李 杰，羅江宏，萬子龍，楊 萍

(紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 蒙自 661100)

我國是世界上辣椒第一生產(chǎn)國與消費(fèi)國，辣椒播種面積約占世界的40%，在蔬菜中位居第一，是我國蔬菜產(chǎn)業(yè)中的第一大產(chǎn)業(yè)[1]。近些年來，辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快[2-11]，不斷培育具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲害、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良性狀的新品種是實(shí)現(xiàn)辣椒持續(xù)增產(chǎn)的關(guān)鍵。隨著栽培辣椒基因組測序的完成、辣椒泛基因組的構(gòu)建以及辣椒種質(zhì)資源重測序數(shù)據(jù)的不斷完善，研究優(yōu)良基因和篩選良好的基因已成為辣椒分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[12]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷突破，測序技術(shù)的進(jìn)步和成本的降低，辣椒的基因測序在不斷地進(jìn)行，基因不斷地被預(yù)測[13]。但在這些被預(yù)測到的基因中，大部分基因功能目前還沒有得到驗(yàn)證。另外，辣椒存在遺傳變異程度低、基因組變化大且復(fù)雜、染色體小等問題，難以進(jìn)行細(xì)胞遺傳研究，導(dǎo)致基因功能研究進(jìn)展緩慢[14]。目前，辣椒基因組功能的研究方法相對缺乏，一些完善的基因研究技術(shù)難以在辣椒中使用，如使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因法存在轉(zhuǎn)化效果差、周期長等缺點(diǎn)。新興的基因編輯應(yīng)用存在系統(tǒng)不健全、技術(shù)難度高等問題。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因、基因敲除、反義抑制等基因功能研究方法在辣椒作物遺傳轉(zhuǎn)化中耗時(shí)費(fèi)力且轉(zhuǎn)化效率極低。而病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)技術(shù)研究周期短，不需要穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化過程，具有低成本、高通量等優(yōu)勢，且沉默之后表型癥狀明顯[15]。利用該技術(shù)在辣椒中已鑒定或驗(yàn)證了上百種功能基因，極大地提高了辣椒基因功能的解析效率[16]。

鑒于此，根據(jù)國內(nèi)外最新相關(guān)報(bào)道，著重對VIGS技術(shù)在辣椒作物生長發(fā)育、次生代謝、生物與非生物脅迫等方面研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為VIGS在辣椒上的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 VIGS技術(shù)和辣椒VIGS載體

1.1 VIGS技術(shù)介紹

VIGS利用攜帶植物功能基因cDNA侵染植物后可引起該植物靶基因沉默和表型變異，從而通過植物表型或生理指標(biāo)的變化來反映該基因的功能[17]。VIGS最早是由KAMMEN首先描述病毒感染植株恢復(fù)正常的現(xiàn)象，但是該名詞現(xiàn)在已經(jīng)被專一應(yīng)用于重組病毒導(dǎo)致內(nèi)源基因表達(dá)減少這一技術(shù)[18-19]。在VIGS技術(shù)下，病毒載體攜帶的目的基因可使植物表達(dá)水平下降，根據(jù)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄特異性基因序列同源誘導(dǎo)基因mRNA被分解或甲基化等修飾，引起植物的表型和生理指標(biāo)的變化，導(dǎo)致植物出現(xiàn)靶基因功能喪失或表達(dá)水平下降，實(shí)現(xiàn)植物功能基因的鑒定，為基因功能研究提供了實(shí)用工具[20-21]。

1.2 辣椒VIGS載體及在辣椒中的應(yīng)用

根據(jù)構(gòu)建VIGS載體的病毒性質(zhì)的不同，可以將其分為三大類：DNA病毒載體、RNA病毒載體和微衛(wèi)星病毒載體。1995年，KUMAGAI等[22]首次完成了基于煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的VIGS載體構(gòu)建，利用重組TMV在本氏煙草(Nicotianabenthamiana)中成功沉默了植物內(nèi)源八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene desaturas，PDS)基因，由于PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，當(dāng)PDS表達(dá)受阻時(shí)，植物便喪失了類胡蘿卜素的光保護(hù)作用，會(huì)出現(xiàn)褪色現(xiàn)象，從而呈現(xiàn)出白化現(xiàn)象[23]。1998年，RUIZ等[24]將PDS cDNA插入馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)基因組中，重組病毒在VIGS中同樣使本氏煙草產(chǎn)生白化現(xiàn)象，使植物源基因的表達(dá)得到有效抑制。隨后RATCLIFF等[25]以煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)為載體構(gòu)建了VIGS體系，TRV的基因組由RNA1和RNA2兩部分組成，RNA1主要提供復(fù)制和移動(dòng)功能，RNA2的主要功能是編碼病毒外殼蛋白，TRV病毒載體還有一個(gè)明顯的優(yōu)勢，即病毒能夠在分生組織中迅速傳播。迄今為止，TRV載體是使用最廣泛的VIGS載體，與其他病毒載體相比，TRV-VIGS載體具有插入目的基因長、誘導(dǎo)基因沉默效率高、持久性長、對宿主不會(huì)造成明顯傷害等優(yōu)點(diǎn)[26]。在CHOI等[27]的研究中，建立了一個(gè)有效的病毒載體體系，該體系利用蠶豆枯萎病病毒2(BBWV2)進(jìn)行辣椒瞬時(shí)基因沉默的研究，該體系設(shè)計(jì)了BBWV2作為雙基因表達(dá)載體，同時(shí)在辣椒細(xì)胞中表達(dá)2種重組蛋白，此外，還建立了能夠增強(qiáng)和穩(wěn)定表達(dá)的重組蛋白，開發(fā)了基于BBWV2的VIGS載體，并成功在辣椒中使用BBWV2-VIGS載體沉默了PDS基因。通過測試不同條件下PDS基因沉默的效率，對辣椒BBWV2-VIGS系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。該載體系統(tǒng)為辣椒基因功能的快速分析提供了一種簡便的方法。以下列舉了目前應(yīng)用于辣椒上有效的病毒VIGS載體及接種方法(表1)。

表1 辣椒VIGS載體及接種方式

2 VIGS在辣椒功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用

應(yīng)用VIGS技術(shù)在辣椒中鑒定的基因功能涉及生長發(fā)育、代謝調(diào)控、生物脅迫及非生物脅迫應(yīng)答等諸多方面，重點(diǎn)介紹在辣椒激素調(diào)節(jié)及生物和非生物脅迫應(yīng)答等方面利用VIGS技術(shù)的研究進(jìn)展(表2)。

表2 利用VIGS研究的辣椒基因及其表型

2.1 辣椒生長發(fā)育和次生代謝相關(guān)基因功能的研究

ZHANG等[31]通過研究辣椒花青苷合成轉(zhuǎn)錄因子基因(CaMYB)，發(fā)現(xiàn)利用VIGS技術(shù)沉默該轉(zhuǎn)錄因子基因能夠抑制辣椒花青素的合成，表明CaMYB參與調(diào)控花青素的生物合成。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)不僅調(diào)控植物的生長發(fā)育，還對植物的抗病性起重要作用。辣椒素不僅是辣椒果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)，還在辣椒生長中起防蟲防病的自我防御作用。茉莉酸(JA)在調(diào)控辣椒果實(shí)辣椒素的代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起非常重要的作用，其調(diào)控因子R2R3-MYB的轉(zhuǎn)錄因子基因CaMYB108主要在辣椒果實(shí)和花中表達(dá)，但是CaMYB108基因的下游信號(hào)沒有確定，利用VIGS技術(shù)沉默CaMYB108基因后導(dǎo)致辣椒素生物合成基因CBGs表達(dá)量降低，同時(shí)辣椒素含量也相對減少。CaMYB108基因沉默植株的花藥開裂延遲，花粉活力降低。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)，CaMYB108基因靶向啟動(dòng)CBGs基因。另外，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)CaMYB108和CBGs基因的表達(dá)，證實(shí)了CaMYB108基因參與辣椒素的合成以及雄蕊發(fā)育的功能[32]。在ALSV(蘋果潛伏球形病毒)介導(dǎo)的VIGS體系中，將氨基酸轉(zhuǎn)移酶基因(pAMT)導(dǎo)入ALSV病毒載體，該病毒成功侵染辣椒植株，侵染率在80%～90%，pAMT沉默植株的辣椒素含量和辣椒素酯積累減少。研究結(jié)果表明，ALSV病毒能夠用于構(gòu)建VIGS體系來研究辣椒素積累的調(diào)控機(jī)制，從而可以在辣椒育種上通過基因改造提高辣椒素的含量[16]。DEL等[33]利用瓦斯蒂克辣椒黃脈病毒(Pepper huasteco yellow veinsvirus，PHYVV)沉默辣椒素合成相關(guān)基因Pun1、Comt、Kas和AMT之后，沉默植株中辣椒素含量顯著下降，由此推測，這些基因?qū)苯匪睾铣捎蟹e極作用。

2.2 辣椒生物脅迫相關(guān)基因功能的研究

CaPHL8是一種MYB轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是辣椒對青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)防御的陽性調(diào)節(jié)因子。ALI等[34]在辣椒系統(tǒng)發(fā)育評價(jià)和利用VIGS技術(shù)對該基因功能鑒定的研究中揭示了CaPHL8在辣椒防御進(jìn)化中的作用，同時(shí)通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，CaPHL8與其他植物中MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的相似性最大。辣椒植株在遭受青枯雷爾氏菌攻擊時(shí)，CaPHL8表達(dá)會(huì)上調(diào)。青枯雷爾氏菌侵染下CaPHL8沉默植株GUS活性檢測也證實(shí)了這一現(xiàn)象；通過VIGS技術(shù)對CaPHL8功能的研究證實(shí)，辣椒植株免疫力降低，植物生長受到損害，同時(shí)伴有高致病菌生長，在該基因沉默的植物中，辣椒免疫功能的減弱伴隨著防御相關(guān)標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄的減少。同時(shí)，瞬時(shí)過表達(dá)CaPHL8(35S:CaPHL8-ha)可引起辣椒過敏反應(yīng)，過表達(dá)植株表現(xiàn)出產(chǎn)量高和免疫增強(qiáng)的表型。Western blot結(jié)果證實(shí)了CaPHL8-ha蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，此外，與其他轉(zhuǎn)錄因子不同的是，CaPHL8不參與高溫脅迫的耐受功能。

研究表明，辣椒WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子涉及辣椒的抗病反應(yīng)，缺乏辣椒轉(zhuǎn)錄因子WRKY1基因，會(huì)減少地毯草黃單胞桿菌(Xanthomonasaxonopodis)生長[35]。HUH等[36]利用TRV病毒介導(dǎo)的VIGS技術(shù)沉默辣椒WRKYd基因，發(fā)現(xiàn)沉默會(huì)影響TMV-P0介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，以及沉默辣椒WRKYd基因會(huì)導(dǎo)致發(fā)病相關(guān)基因與過敏反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)降低，揭示了Btf3基因和WRKYd基因作為調(diào)控因子控制過敏反應(yīng)和病原物傳播的機(jī)制。LIM等[37]利用VIGS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)辣椒抗旱相關(guān)的DIN1基因存在于辣椒葉中，與以前的研究不同，高鹽處理可引起DIN1顯著表達(dá)。辣椒CaWRKY45參與抗病的基因功能也利用VIGS技術(shù)得以驗(yàn)證[38]。

昆蟲的食草性會(huì)嚴(yán)重阻礙植物的生長發(fā)育，降低作物產(chǎn)量。薊馬是植物病毒病原的重要載體，也是危害性極強(qiáng)的農(nóng)作物害蟲。SARDE等[39]研究了辣椒脂氧合酶基因CaLOX2對辣椒防御西方花薊馬的作用，結(jié)果顯示，CaLOX2參與JA的生物合成并介導(dǎo)植物抗性，薊馬攝食誘導(dǎo)JA相關(guān)基因CaLOX2和CaPINⅡ表達(dá)，通過VIGS技術(shù)沉默辣椒植株中的CaLOX2基因，與正常植株相比，薊馬取食時(shí)茉莉酸及其衍生物顯著減少，CaLOX2沉默的辣椒植株對薊馬的敏感性增強(qiáng)，從而揭示了CaLOX2基因依賴JA的信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)植株對薊馬的防御機(jī)制。

2.3 辣椒非生物脅迫相關(guān)基因功能的研究

MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育中起重要作用，一些MADS-box基因參與了植物的脅迫反應(yīng)。目前，辣椒中與抗逆相關(guān)的MADS-box基因家族信息較少，CHEN等[40]從辣椒中分離出1個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子基因，并將其命名為CaMADS，利用VIGS技術(shù)沉默辣椒植物CaMADS基因后，發(fā)現(xiàn)沉默植株中該基因的表達(dá)量下調(diào)。在低溫、氯化鈉和甘露醇脅迫處理后，CaMADS基因沉默植株受到的傷害比正常植株嚴(yán)重，并且表現(xiàn)出電解質(zhì)泄漏增加、丙二醛(MDA)水平升高和葉綠素含量降低的現(xiàn)象。進(jìn)一步說明CaMADS在低溫、鹽和滲透脅迫信號(hào)通路中起著積極的應(yīng)答作用。

脫水蛋白(DHNs)作為第2組晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)的一個(gè)亞家族，因其在植物抗非生物脅迫方面的作用而受到廣泛關(guān)注。LUO等[41]的研究表明，CaDHN5(辣椒脫水基因)的表達(dá)受鹽和滲透脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但其功能尚不清楚。為了解CaDHN5在非生物脅迫中的作用，利用VIGS技術(shù)下調(diào)了辣椒和轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis)植株中CaDHN5的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，沉默CaDHN5可以抑制錳超氧化物歧化酶(MnSOD)和過氧化物酶(POD)基因的表達(dá)。這些變化引起的活性氧在VIGS系統(tǒng)中的積累比在脅迫條件下的對照組多。與野生型相比，過表達(dá)CaDHN5的植物對鹽和滲透脅迫的耐受性增強(qiáng)，鹽和滲透脅迫相關(guān)基因的表達(dá)也相對增加，從而證明了CaDHN5在鹽和滲透脅迫信號(hào)通路中的正向調(diào)節(jié)作用。

JOO等[42]利用VIGS技術(shù)和轉(zhuǎn)基因擬南芥研究相關(guān)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)CaATBZ1具有負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)和干旱脅迫響應(yīng)的作用。與CaATBZ1沉默辣椒植株一樣，CaASRF沉默辣椒植株通過ABA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)顯示出耐旱表型。CaASRF1介導(dǎo)的泛素化在調(diào)控CaATBZ1的穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用，這些發(fā)現(xiàn)為研究轉(zhuǎn)錄因子的翻譯后調(diào)控提供了分子基礎(chǔ)。CaWRKY27基因在辣椒逆境脅迫中具有很重要的作用，其能夠正調(diào)控植物對細(xì)菌性青枯病的抗性，同時(shí)負(fù)調(diào)控植株的耐熱性。研究者利用VIGS技術(shù)沉默CaWRKY27基因，發(fā)現(xiàn)沉默的辣椒植株對鹽脅迫和滲透脅迫抗性顯著增強(qiáng)，還發(fā)現(xiàn)CaWRKY27不僅在辣椒逆境脅迫中是轉(zhuǎn)錄激活因子，還能夠編碼抗逆境阻遏蛋白[43]。F-box蛋白基因CaDIF1可以由ABA、干旱脅迫、H2O2和NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，CaDIF1沉默株系展示出干旱敏感性，而超表達(dá)株系展示出ABA敏感性和干旱耐性。利用酵母雙雜試驗(yàn)確定了CaDIS1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中與CaDIF1存在互作。CaDIF1和CaDIS1沉默株系展示出對ABA的不敏感性和降低的干旱耐性，葉片氣孔變大和蒸騰速率增加，進(jìn)一步說明CaDIF1和CaDIS1互作參與依賴ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的干旱脅迫抗性過程[44]。

3 VIGS技術(shù)在辣椒研究應(yīng)用中的展望

近些年，VIGS技術(shù)已經(jīng)為辣椒相關(guān)基因的瞬時(shí)調(diào)控和功能分析提供了技術(shù)平臺(tái)，在基因功能的研究領(lǐng)域顯示出了巨大的優(yōu)勢，利用該方法對辣椒基因組功能基因驗(yàn)證的研究也在不斷地深入。VIGS的沉默效率很大程度上依賴于寄主植物與病毒之間的相互作用，此外還與寄主的生長環(huán)境，以及病毒積累的環(huán)境密切相關(guān)。辣椒與侵染它的病毒載體之間的匹配程度對VIGS的沉默效率具有重要影響。目的基因片段的長度以及該片段在整個(gè)基因全長中所處的位置也影響著VIGS的基因沉默效率。攜帶目標(biāo)基因片段的重組病毒載體構(gòu)建后，病毒載體在操作過程中的接種技術(shù)、病毒載體的接種時(shí)期、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的活性以及接種后培養(yǎng)環(huán)境等，均對基因沉默效率有一定影響。

雖然VIGS技術(shù)在辣椒基因功能鑒定方面的應(yīng)用取得了重大進(jìn)展，但是仍存在較多無法忽視的缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)限制了VIGS技術(shù)的應(yīng)用，如幾乎不可能實(shí)現(xiàn)完全抑制目的基因的表達(dá)；基因家族成員之間的功能冗余可掩飾目的基因的沉默；受感染的植株和復(fù)檢不能表現(xiàn)一致的沉默水平；沉默基因的表型可能受病毒影響；易受環(huán)境影響，如溫度和濕度升高導(dǎo)致效率下降[58]。這些問題都是在今后的VIGS技術(shù)研究中所要面臨并需逐步解決的難題。在未來，隨著植物中VIGS技術(shù)研究的深入和VIGS體系的優(yōu)化，VIGS技術(shù)必將成為高通量基因功能鑒定的重要工具。