吳長偉，弓新國，鄭 琳，張 勃，蔣美紅，李學(xué)杉，黃志強，普興偉，吳明美，李 仙

(常德華馥生物技術(shù)有限公司，湖南 常德 415900)

煙草提取物含有煙草特征香味物質(zhì)，相比于其他來源的提取物，易與卷煙協(xié)調(diào)一致，是重要的煙用添加劑，廣泛應(yīng)用于卷煙工業(yè)[1-4]。目前，煙草提取物大多采用溶劑浸提法制得[5-7]，方法相對單一，所富集的致香物質(zhì)組成復(fù)雜，目標性不強。微生物發(fā)酵產(chǎn)香技術(shù)已被研究和廣泛應(yīng)用[8]。目前，大多研究將產(chǎn)香微生物直接接種到物料中進行生物發(fā)酵產(chǎn)香，但該方法的生物代謝途徑相對復(fù)雜，發(fā)酵過程不易控制，致香物質(zhì)轉(zhuǎn)化率不高[9-10]。而微生物休止細胞發(fā)酵技術(shù)具有反應(yīng)專一性強、底物轉(zhuǎn)化率高、不易染雜菌、產(chǎn)物對菌體生長抑制作用較小等特點，發(fā)酵產(chǎn)物得率高，可以部分實現(xiàn)物質(zhì)的定向轉(zhuǎn)化，且發(fā)酵過程易于控制[11-14]。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌屬的一個新種，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有促進植物生長和抵御病原微生物的作用[15-18]。據(jù)報道，該菌具有降解木質(zhì)纖維素的能力。陳龍[19]從杜仲樹皮內(nèi)分離得到一株芽孢桿菌157，經(jīng)16S rRNA分子生物學(xué)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis157)，利用其對秸稈和豆粕混合物進行固態(tài)發(fā)酵，纖維素降解率為9.06%，半纖維素降解率為43.61%。但利用貝萊斯芽孢桿菌休止細胞發(fā)酵法降解煙草木質(zhì)纖維素產(chǎn)香的研究少見報道。為此，以篩選的降解煙草木質(zhì)纖維素貝萊斯芽孢桿菌(BacillusvelezensisHF-09)為出發(fā)菌株，研究其降解煙梗木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)糖能力及休止細胞發(fā)酵定向轉(zhuǎn)化致香成分的特點，以改善煙梗浸膏的感官抽吸品質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑

材料：煙梗樣品來源于云南昆明紅云紅河集團，品種等級為紅大(C3F)；降解煙草木質(zhì)纖維素細菌貝萊斯芽孢桿菌HF-09(BacillusvelezensisHF-09)，分離自云南省昆明市煙草栽培土壤。

試劑：葡萄糖(AR，廣東汕頭市西隴化工廠)、氯化鉀(AR，天津市博迪化工有限公司)、牛肉膏(BR，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)、蛋白胨(BR，上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司)、無水Na3PO4(AR，廣東汕頭市西隴化工廠)、無水硫酸鈉(AR，廣東汕頭市西隴化工廠)、二氯甲烷(AR，天津市博迪化工有限公司)。

1.2 儀器設(shè)備

XP404S型電子天平(感量：0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司)、KDM型調(diào)溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)、UV-9100型紫外-可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)、SKY-211B大容量恒溫培養(yǎng)搖床(上海蘇坤實業(yè)有限公司)、R-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)、同時蒸餾提取器(上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司)、6890N/5973N氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS，美國Agilent公司)、Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株HF-09的生長條件檢測 生長曲線：將純化后的菌株HF-09過夜培養(yǎng)后，菌落計數(shù)，調(diào)整菌液濃度并測定其OD600值，再按照1%接菌量轉(zhuǎn)接至100 mL液體LB培養(yǎng)基中，測定菌液起始OD600值，于180 r/min搖床37 ℃培養(yǎng)，每間隔1 h取樣，重復(fù)測定OD6003次，繪制生長曲線。

耐受試驗：①溫度耐受：將純化后的菌株HF-09培養(yǎng)于正常LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，75 ℃水浴20 min，即芽孢體，洗滌3次后將1 mL菌液分裝到EP管中，分別置于不同溫度水浴處理20 min后，立刻冷卻至常溫；②pH值耐受：按照上述方法制備菌株HF-09芽孢體，隨后將1 mL菌液分裝到EP管中，分別接種到pH值2～12的不同緩沖液中，37 ℃處理3 h。上述耐受試驗均采用倍比稀釋后平板計數(shù)，用37 ℃的菌液做空白對照。存活率=(處理后的細菌數(shù)/處理前的細菌數(shù))×100%[19]。

1.3.2 煙梗木質(zhì)纖維素含量檢測 將煙梗經(jīng)菌株HF-09固態(tài)發(fā)酵10 d的降解產(chǎn)物送至云南同創(chuàng)檢測技術(shù)有限公司進行檢測。采用聚酯纖維濾網(wǎng)袋法測定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量，計算其降解率(DR)。DR=(接種前某成分含量-接種后某成分含量)/接種前某成分含量×100%[20]。

1.3.3 休止細胞制備 將菌株HF-09接種到液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)約18 h至光密度值達2.0。菌液于8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集菌體，然后用50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH值為7.0)洗滌3次。菌體于100 mL50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH值為7.0)中重懸，此懸浮細胞即為菌株HF-09的休止細胞。

1.3.4 菌株HF-09休止細胞液體發(fā)酵制備煙梗浸膏 將煙梗粉碎成粉，水回流提1 h，自然冷卻后均按1%的接種量加入菌株HF-09發(fā)酵液和菌株HF-09休止細胞，OD600均為2.0，37 ℃恒溫發(fā)酵12 h。發(fā)酵液于100 ℃條件下滅活處理10 min，過濾，濾出液減壓濃縮至膏狀，分別制得菌株HF-09發(fā)酵煙梗浸膏和菌株HF-09休止細胞發(fā)酵梗膏。未發(fā)酵煙梗直接提取，過濾，濾出液減壓濃縮至膏狀。

1.3.5 煙梗浸膏理化性質(zhì)檢測 按照煙草行標YC/T 145.1—145.9對煙梗浸膏的外觀、澄清度、相對密度、酸值、揮發(fā)性成分總量等進行測定；按照GB/T 5009.75—2003《食品添加劑中鉛的測定》和GB/T 5009.76—2003《食品添加劑中砷的測定》的方法測定重金屬元素鉛(Pb)和砷(As)的含量。

1.3.6 煙梗浸膏常規(guī)成分GC-MS分析 將煙梗浸膏25 g放入同時蒸餾萃取裝置一端的圓底燒瓶中，加入250 mL蒸餾水，裝置的另一端盛有25 mL二氯甲烷，在60 ℃下水浴加熱，同時蒸餾萃取3 h。二氯甲烷萃取液用無水硫酸鈉干燥，置于4 ℃下過夜，過濾，將濾液倒入濃縮瓶中用Vigreux柱濃縮至約1 mL。選擇萘為內(nèi)標物，每1 mL濃縮液中加入含50 μL萘(0.1 mol/L)的無水乙醇溶液，搖勻后，用于GC-MS分析。

氣相色譜條件：毛細管柱HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣溫度240 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min，分流比25∶1，進樣量2 μL，升溫程序為起始溫度50 ℃保持1 min，以10 ℃/min上升到260 ℃后保持5 min，GC-MS接口溫度280 ℃。

質(zhì)譜條件：EI方式，離子源溫度230 ℃，離子化電壓70 eV，掃描范圍35～455 amu，掃描速率1.65 scan/s。

1.3.7 煙梗浸膏應(yīng)用及感官評吸 分別配制質(zhì)量濃度10、15、20 mg/mL的3種煙梗浸膏水溶液，取2 mL噴灑于100 g紅大煙絲(X3L)上，裝入PVC 塑料袋密封，置于25 ℃樣品平衡箱中保存8 h；每20支煙支質(zhì)量(18.0±0.25)g；將煙支于溫度22 ℃和相對濕度60%的恒溫恒濕箱中平衡48 h。由7人組成的專業(yè)評吸小組根據(jù)GB/T 5606.4—2005標準進行評吸，對添加效果進行感官質(zhì)量評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HF-09的生長曲線及耐受性

菌株HF-09在LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線表明(圖1)，培養(yǎng)時間0～7 h為遲緩期，7～20 h達到對數(shù)期，生長速度較快。該菌在pH值 5～9下的存活率均在94%以上；在75 ℃以下的存活率在92%以上。良好的pH值和溫度耐受性可能與其形成芽孢的能力密切相關(guān)。

2.2 菌株HF-09降解纖維素轉(zhuǎn)糖試驗

采用菌株HF-09對紅大煙梗固體發(fā)酵10 d，并對木質(zhì)纖維素降解后轉(zhuǎn)糖能力(圖2)進行檢測，結(jié)果顯示，纖維素和半纖維素含量均有明顯降低，總糖和還原糖含量上升。纖維素含量由12.70%降低到10.29%(降解率18.98%)；半纖維素含量由7.52%降到5.24%(降解率30.32%)；總糖含量由26.63%增到31.98%(提升率20.10%)；還原糖含量由21.93%增到26.62%(提升率21.39%)。其中，煙草還原糖對煙氣的香吃味有良好的作用，并能減少煙氣的刺激性，對煙葉品質(zhì)影響較大，是決定煙葉品質(zhì)的重要化學(xué)成分[20-23]。

2.3 休止細胞發(fā)酵煙梗制備浸膏中的組分分析

2.3.1 煙梗浸膏組分的理化指標 將煙梗粉碎(小于630 μm)，采用直接提取、常規(guī)發(fā)酵和休止細胞發(fā)酵3種工藝制備煙梗浸膏，理化指標檢測結(jié)果(表1)顯示，3種煙梗浸膏各種理化性質(zhì)正常，重金屬含量也符合行業(yè)要求。發(fā)酵后的煙梗浸膏酸值明顯提升，尤其是采用休止細胞發(fā)酵后酸值較未發(fā)酵提升57.69%，菌株HF-09降解煙草木質(zhì)纖維素成糖的同時，也可能伴隨著酸性物質(zhì)的生成。

表1 不同工藝煙梗浸膏的理化指標檢測結(jié)果

3種煙梗浸膏的常規(guī)化學(xué)指標(圖3)檢測結(jié)果表明，經(jīng)菌株HF-09常規(guī)發(fā)酵和休止細胞發(fā)酵處理后，煙梗浸膏中的總糖、還原糖含量均有所提升，總糖含量由16.85%分別提升到18.30%和24.80%(提升率8.61%和47.18%)，還原糖含量由16.21%分別提升到17.20%和22.50%(提升率6.11%和38.80%)。同時，休止細胞發(fā)酵處理后，總氮、氯離子含量均有所下降，總氮含量由1.12%下降到0.96%(下降率14.29%)，氯離子含量由0.92%下降到0.70%(下降率23.91%)，鉀離子、總植物堿含量沒有明顯變化。煙草中的氯離子往往會降低卷煙吃味，增加刺激，與煙草品質(zhì)呈負相關(guān)[24-26]。休止細胞發(fā)酵較常規(guī)發(fā)酵具有更為顯著的提高總糖、還原糖含量，降低氯離子、總氮含量的工藝優(yōu)勢。

2.3.2 煙梗浸膏中主要致香成分 對不同工藝制備的煙梗浸膏中27種主要致香成分含量分析結(jié)果(表2)顯示，與未發(fā)酵煙梗浸膏相比，常規(guī)發(fā)酵和休止細胞發(fā)酵煙膏27種主要致香成分含量有較大變化。從致香物質(zhì)總量來看，常規(guī)發(fā)酵煙梗浸膏27種主要致香物質(zhì)含量由89.033 μg/g略降到85.240 μg/g，休止細胞發(fā)酵煙梗浸膏27種主要致香物質(zhì)含量反而增加到109.590 μg/g，增長幅度為23.09%。從致香物質(zhì)變化情況來看，常規(guī)發(fā)酵煙梗浸膏和休止細胞發(fā)酵煙梗浸膏相對于未發(fā)酵煙梗浸膏分別有11種和9種致香物質(zhì)含量降低，16種和18種致香物質(zhì)含量增加，但變化的致香成分品種略有不同。在2種發(fā)酵煙梗中含量均下降的致香物質(zhì)有7種，含量均增加的致香物質(zhì)有14種。

表2 不同工藝煙梗浸膏主要致香成分的GC-MS分析

續(xù)表2 不同工藝煙梗浸膏主要致香成分的GC-MS分析

2.3.3 不同工藝煙梗浸膏中主要致香成分含量比較 單一致香成分絕對含量對比分析(圖4)結(jié)果顯示，菌株HF-09以2種發(fā)酵工藝處理后苯甲醇、胡薄荷酮、茄酮、巨豆三烯酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、肉豆蔻酸、十五酸、金合歡基丙酮、棕櫚酸甲酯、十六酸等致香成分含量均有明顯提升，多為酮類、醇類和大分子脂肪酸類。酮類和醇類物質(zhì)具有豐富煙草本香，提升質(zhì)感的作用；大分子脂肪酸具有柔順煙氣，改善卷煙吃味的作用[27-28]。同時，糠醛、2-環(huán)戊烯-1,4-二酮、苯乙醛、吲哚、二氫獼猴桃內(nèi)酯、新植二烯等致香成分含量均略有下降。其中，新植二烯作為煙草中含量最高的潛香物質(zhì)，本身不具香氣，但其降解產(chǎn)物對煙草香氣有重要貢獻[29]。另外，該結(jié)果也表明菌株HF-09不但具有高效降解煙梗木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)糖的能力，還可能有降解煙草中大分子物質(zhì)(還原糖、長鏈烯烴等)生成致香物質(zhì)的潛在能力，且休止細胞發(fā)酵工藝較常規(guī)發(fā)酵有更加高效的轉(zhuǎn)化及生香效率。

2.3.4 菌株HF-09生成主要致香成分的轉(zhuǎn)化特點 分析降解煙梗木質(zhì)纖維素菌株HF-09對煙梗浸膏主要致香成分的轉(zhuǎn)化特點(圖5)，分別計算出常規(guī)發(fā)酵樣品和休止細胞發(fā)酵樣品相對于未發(fā)酵樣品的27種致香成分變化，結(jié)果表明，從致香成分相對含量變化趨勢來看，除苯甲醛、芳樟醇、藏花醛等物質(zhì)外，2種發(fā)酵工藝下致香成分相對含量的變化趨勢基本一致，推測休止細胞發(fā)酵工藝并沒有改變原有的代謝路徑。從致香成分相對含量變化幅度來看，菌株HF-09降解煙梗纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化成長鏈脂肪酸及脂肪酸酯的能力較強，能顯著提升肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕櫚酸甲酯等煙草重要物質(zhì)的含量，該類物質(zhì)在卷煙中具有調(diào)節(jié)煙氣形態(tài)、柔順煙氣、改善吃味及舒適性的作用[30]。從2種發(fā)酵工藝轉(zhuǎn)化效率來看，休止細胞發(fā)酵轉(zhuǎn)化效率更高，更具有代謝專一性，比常規(guī)發(fā)酵更具有轉(zhuǎn)化優(yōu)勢，休止細胞發(fā)酵產(chǎn)生的肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕櫚酸甲酯的含量分別比未發(fā)酵工藝提升442.64%、248.40%、165.50%、153.64%，而常規(guī)發(fā)酵只提升64.72%、73.31%、24.87%、49.56%。

2.4 煙梗浸膏的卷煙加香效果

煙梗浸膏在煙絲添加后的感官評價結(jié)果(表3)顯示，添加休止細胞發(fā)酵煙梗浸膏和常規(guī)發(fā)酵煙梗浸膏感官抽吸品質(zhì)均好于添加未發(fā)酵煙梗浸膏，添加休止細胞發(fā)酵煙梗浸膏綜合抽吸品質(zhì)最好。添加常規(guī)發(fā)酵煙梗浸膏的試驗卷煙樣品在甜潤感、豐富性和飽滿度上有明顯改善，但略有刺激。添加休止細胞發(fā)酵煙梗浸膏的卷煙樣品在煙氣豐富性、飽滿度、醇和性、細膩感、柔順感和明亮度上改善較為明顯。不同添加量比較表明，常規(guī)發(fā)酵煙梗浸膏按煙絲質(zhì)量的0.04%添加量時效果最好，醇和性、明亮度、甜潤感、飽滿度得到明顯改善；休止細胞發(fā)酵煙梗浸膏按0.02%添加量時，甜潤感、醇和性、細膩感、質(zhì)感明顯提升。

表3 3種工藝煙梗浸膏添加后感官評吸結(jié)果

3 結(jié)論與討論

研究了降解煙梗纖維素細菌菌株HF-09的生長曲線、耐受性及轉(zhuǎn)糖效率，利用其休止細胞和常規(guī)細胞對煙梗進行液體發(fā)酵生香，考察了休止細胞發(fā)酵煙梗浸膏、常規(guī)發(fā)酵煙梗浸膏及未發(fā)酵煙梗浸膏的成分差別、變化規(guī)律、轉(zhuǎn)化特點及感官品質(zhì)。①菌株HF-09培養(yǎng)7～20 h為對數(shù)期，生長速度較快且具有良好的pH值和溫度耐受性，這可能與其形成芽孢的能力密切相關(guān)。對紅大煙梗固體發(fā)酵10 d后，纖維素和半纖維素含量均明顯降低，總糖和還原糖含量上升。該菌株具有以煙梗為固體發(fā)酵底物，在溫和條件下高效降解纖維素轉(zhuǎn)化生糖的能力，在煙草廢棄物資源開發(fā)利用方面具有極大的潛力。②從煙梗浸膏中的組分來看，相對于未發(fā)酵煙梗浸膏，采用菌株HF-09發(fā)酵處理后，發(fā)酵煙梗浸膏的酸值、總糖和還原糖含量均有所提升。分析27種主要致香成分后發(fā)現(xiàn)，2種發(fā)酵煙梗浸膏中含量均下降的致香物質(zhì)有7種，多為潛香物質(zhì)和長鏈烯烴類物質(zhì)，含量均增加的致香物質(zhì)14種，多為酮類、醇類和大分子脂肪酸類。表明菌株HF-09降解煙梗纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化長鏈脂肪酸及脂肪酸酯的能力強，能顯著提升肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕櫚酸甲酯等煙草重要致香物質(zhì)的含量。③從2種發(fā)酵工藝轉(zhuǎn)化效率和煙梗浸膏品質(zhì)來看，菌株HF-09經(jīng)2種不同發(fā)酵工藝的致香物質(zhì)代謝途徑基本一致，但休止細胞發(fā)酵更能顯著提高總糖、還原糖、酮類、醇類和大分子脂肪酸類的含量，轉(zhuǎn)化效率和生香率更高，更具有代謝專一性，且感官抽吸品質(zhì)整體表現(xiàn)較好?？梢?，休止細胞發(fā)酵比常規(guī)發(fā)酵和未發(fā)酵更具工藝優(yōu)勢，具有潛在的應(yīng)用前景。