陶 娟，宋小鋒，周圓圓

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

連翹[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]是木樨科連翹屬植物，以種子入藥，具有清熱、解毒、散結(jié)、消腫的功效?，F(xiàn)代研究表明，連翹葉中含有連翹酯苷、木脂素類(lèi)、蘆丁和槲皮素等黃酮類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)化學(xué)成分[1]，具備抗菌、抗氧化、抗炎、降血糖血脂等功效[2]，在功能性食品及藥品開(kāi)發(fā)方面具有較大開(kāi)發(fā)潛力。民間有用連翹葉制作保健茶飲的傳統(tǒng)[3]。連翹資源豐富，廣泛分布在山西、河南、河北等地，藥材以野生采集為主，生產(chǎn)中常會(huì)受到低溫、干旱等脅迫[4]，造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降以及次生代謝成分的不穩(wěn)定。連翹中木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物是連翹藥材的重要有效成分。前人研究表明，茉莉酸甲酯(MeJA)等外源物質(zhì)可作為一種外源誘導(dǎo)因子促進(jìn)藥用植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累[5-7]。目前，關(guān)于連翹的研究主要集中在其化學(xué)成分及提取[8-10]、藥理活性[2,11]、種質(zhì)資源[12]、栽培技術(shù)[4,13]等方面，而外源物質(zhì)對(duì)其光合作用和次生代謝產(chǎn)物的影響研究還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，對(duì)連翹葉片噴施不同濃度MeJA，分析其對(duì)連翹葉光合作用、葉綠素和總黃酮含量、連翹苷和連翹酯苷A積累以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響，為連翹野生撫育實(shí)踐中應(yīng)用外源物質(zhì)提高連翹品質(zhì)與產(chǎn)量提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：連翹栽培于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院校園，經(jīng)盧龍斗教授鑒定為連翹[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]，以生長(zhǎng)環(huán)境一致、生長(zhǎng)狀況良好的連翹為試驗(yàn)材料。

供試儀器：Li-6400XT便攜式光合作用儀(美國(guó)Li-COR公司)、SPAD-502Plus葉綠素測(cè)定儀(日本柯尼卡美能達(dá)控股公司)、A5雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(翱藝儀器上海有限公司)。

供試試劑：茉莉酸甲酯(北京索萊寶科技有限公司，純度≥95%，批號(hào)：20180118)、連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品(四川維克奇生物科技有限公司，純度≥95%，批號(hào)：150602)、連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品(四川維克奇生物科技有限公司，純度≥95%，批號(hào)：150716)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(四川維克奇生物科技有限公司，純度≥95%，批號(hào)：20030203)、PAL測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在連翹展葉后期，選擇生長(zhǎng)環(huán)境一致、生長(zhǎng)狀況良好的連翹植株掛簽標(biāo)識(shí)，于晴天9:00，采取葉面噴施的方式，分別噴施1 mmol/L(T1)、0.1 mmol/L(T2)、0.01 mmol/L(T3)MeJA，對(duì)照(CK)噴施清水，每個(gè)處理選取同一高度、生長(zhǎng)狀況一致的連翹噴施10株，每株噴施至表面葉片濕潤(rùn)且無(wú)大液珠流下，噴施前后2 d內(nèi)晴朗無(wú)降雨。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1 光合特性 在陽(yáng)光充足時(shí)，采用Li-6400XT便攜式光合作用儀加紅藍(lán)光源，設(shè)定光強(qiáng)為1 200 lx，分別于噴施后2、6、24、48、72 h測(cè)定樣品區(qū)連翹葉的光合特性。為保證樣品一致性，均選擇連翹中上部葉片進(jìn)行測(cè)定，記錄凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)，重復(fù)測(cè)定10株。

1.3.2 SPAD 分別于噴施后2、6、24、48、72 h，選取每個(gè)處理10株連翹的中上部葉片，采用柯尼卡SPAD-502Plus手持便攜式葉綠素儀測(cè)定連翹葉SPAD值，注意避開(kāi)損傷的葉片。

1.3.3 PAL活性 分別于噴施后2、6、24、48、72 h，隨機(jī)選取每個(gè)處理連翹中上部葉片，用錫紙包裹后迅速投入液氮中，凍存于-80 ℃超低溫冰箱備用。取0.2 g凍樣，放入研缽(預(yù)冷)中，液氮下研磨成粉，裝入10 mL離心管中，加入2 mL硼酸緩沖液(含0.1%巰基乙醇、2%聚乙烯吡咯烷酮，pH值8.8)，15 000 r/min、4 ℃離心25 min，上清液即為測(cè)定所需的酶液。加入10 mmol/L L-苯丙氨酸1 900 μL，酶液100 μL，總體積2 000 μL，混合后，暗反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL 5 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，290 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。用硼酸緩沖液(pH值8.8)作為空白參比，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.4 總黃酮含量 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用紫外分光光度法測(cè)定不同處理連翹葉總黃酮含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.009 92 g，用少量40%乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移入50 mL容量瓶中，40%乙醇定容，搖勻，即為0.198 4 g/L 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確移取 1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、4.5、5.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL容量瓶中，加40%乙醇定容至刻度線處，搖勻，分別從中吸取3 mL溶液，先加0.3 mL 50 mg/mL NaNO2溶液，搖勻，放置6 min；再加0.3 mL 100 mg/mL Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6 min；再加2 mL 40 mg/mL NaOH，搖勻，放置15 min。在510 nm下測(cè)定并記錄其吸光值。利用Excel軟件，以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪圖，得出線性回歸方程為Y=0.924 6X-0.021 4，R2=0.999 3。

分別于噴施2、6、24、48、72 h，隨機(jī)選取每個(gè)處理連翹中上部葉片，重復(fù)3次，于烘箱中60 ℃烘干，研磨成粉。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 0 g連翹葉樣品粉末于具塞錐形瓶中，加入40 mL 40%乙醇超聲提取，過(guò)濾后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，40%乙醇定容，搖勻即得供試品溶液。測(cè)定方法同上，重復(fù)測(cè)定3次，并由線性回歸方程計(jì)算樣品中的總黃酮含量。

1.3.5 連翹苷含量 精密稱(chēng)取連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇制成每1 mL含0.222 mg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。采用高效液相色譜法精密進(jìn)樣1、3、5、7、10、14 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=611.52X-2.814，R2=0.999 9。

精密稱(chēng)定1.3.4中各處理連翹葉樣品粉末1 g，加入15 mL甲醇，稱(chēng)質(zhì)量后浸漬過(guò)夜，超聲處理25 min，放冷后補(bǔ)足質(zhì)量，過(guò)濾，取5 mL濾液于蒸發(fā)皿中，水浴鍋上揮干甲醇。再以50%甲醇提取，定容至5 mL容量瓶中，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，取過(guò)濾液保存于進(jìn)樣小瓶中。以乙腈∶水(25∶75)為流動(dòng)相，設(shè)置流速為1.0 mL/min，柱溫為32 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中連翹苷含量。

1.3.6 連翹酯苷A含量 精密稱(chēng)取連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇制成1.612 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。采用高效液相色譜法精密進(jìn)樣1、2、3、5、6 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=656.27X-13.823，R2=0.998 9。精密稱(chēng)定1.3.4中各處理連翹葉樣品粉末0.5 g，加入70%甲醇15 mL，將具塞錐形瓶瓶口處用封口膜密封，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷后70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。搖勻后用濾紙過(guò)濾，取濾液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜保存于色譜進(jìn)樣瓶中。以乙腈∶0.4%冰醋酸(15∶85)為流動(dòng)相，設(shè)置流速為1.0 mL/min，柱溫為32 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中連翹酯苷A含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析中LSD法進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05時(shí)存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA對(duì)連翹光合特性的影響

由圖1可見(jiàn)，MeJA噴施后2、24、48、72 h，T1—T3處理連翹葉Pn均高于CK。其中，噴施后72 h，T3處理Pn較CK提高50.99%。噴施后2、6 h，T1—T3處理連翹葉Ci均較CK增加；噴施后48 h，均較CK有所下降；噴施后72 h均較CK增加，其中T1、T3處理分別較CK顯著增加42.82%、44.69%。整體上看，高濃度MeJA噴施處理(T1)對(duì)連翹葉Gs和Tr表現(xiàn)出一定的抑制作用，T1—T3處理Gs和Tr隨噴施處理后時(shí)間延長(zhǎng)總體上表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。噴施MeJA 后2、6、24 h，T2和T3處理均提高了Gs，尤其是T2處理增幅最大，分別增加了40.00%、94.44%、130.95%；噴施MeJA后48、72 h，T1—T3處理Gs和Tr均較CK有所下降。

不同小寫(xiě)字母表示同一時(shí)間不同處理差異顯著(P<0.05)

2.2 MeJA對(duì)連翹葉SPAD的影響

由表1可見(jiàn)，噴施MeJA后，連翹葉SPAD值變化不明顯。噴施后2 h，T1—T3處理SPAD值下降；噴施后6、24、48 h，各處理SPAD值差異均不顯著；噴施后72 h，T1—T3處理均較CK提高，分別增加了6.18%、12.75、7.00%。

表1 MeJA對(duì)連翹葉片SPAD值的影響

2.3 MeJA對(duì)連翹葉總黃酮含量的影響

由表2可見(jiàn)，T1—T3處理連翹葉總黃酮含量均高于CK，說(shuō)明噴施不同濃度外源MeJA均能夠誘導(dǎo)連翹葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的積累。T3處理連翹葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量增加比較顯著，噴施后2、6、24、48、72 h分別較CK增加了18.70%、34.13%、30.16%、40.57%、11.02%，噴施后48 h總黃酮含量為15.21 mg/g，為所有處理連翹葉總黃酮含量的最高值。

表2 MeJA對(duì)連翹葉片總黃酮含量的影響

2.4 MeJA對(duì)連翹葉連翹苷、連翹酯苷A含量的影響

由圖2A可知，外源噴施不同濃度MeJA對(duì)連翹葉中連翹苷積累影響不同。噴施后24 h，T1—T3處理連翹苷含量均較CK下降，其他時(shí)間大都表現(xiàn)出低濃度MeJA(T3處理)誘導(dǎo)合成的效應(yīng)。T1處理對(duì)連翹葉中連翹苷合成表現(xiàn)出一定的抑制作用，而T3處理連翹苷含量則在整體上有一定的提升。從圖2B可以看出，外源噴施MeJA對(duì)連翹酯苷A積累整體上呈抑制作用，僅在噴施后48 h，T1—T3處理連翹酯苷A含量高于CK，且不存在濃度效應(yīng)。

圖2 MeJA對(duì)連翹葉連翹苷、連翹酯苷A含量的影響

2.5 MeJA對(duì)連翹葉PAL活性的影響

由表3可見(jiàn)，噴施MeJA后2、6 h，T1—T3處理連翹葉PAL活性均高于CK。噴施MeJA 后2 h，T3處理PAL活性最高，達(dá)到150.82 U/g，比對(duì)照增加11.95%；而噴施MeJA后6 h，T1處理PAL活性最高，達(dá)到150.74 U/g，比對(duì)照增加9.24%。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，噴施24 h后，T1—T3處理連翹葉PAL活性呈受抑制現(xiàn)象，PAL活性急劇下降，特別是噴施后48 h，T1—T3處理較CK分別降低15.88%、12.38%、12.56%。

表3 MeJA對(duì)連翹葉PAL活性的影響

3 結(jié)論與討論

MeJA是一種植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)劑，其可通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)閉、葉綠素合成代謝等環(huán)節(jié)來(lái)參與植物的光合作用，不同濃度外源MeJA對(duì)不同植物光合作用的影響不盡相同[14]。趙許朋等[15]使用0.1～0.75 mmol/L外源MeJA處理頭花蓼幼苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其Pn、Gs、Tr和Ci均呈低濃度誘導(dǎo)高濃度抑制的效應(yīng)。王春麗等[16]使用0.2 mmol/L MeJA處理丹參葉片后，Pn顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度MeJA及不同處理時(shí)間對(duì)連翹葉Pn、Ci、Gs和Tr的影響不同，在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)Gs和Tr表現(xiàn)出低促高抑的作用。FARGUHAR等[17]研究顯示，當(dāng)Pn與Ci呈正相關(guān)時(shí)，Pn由Gs決定。本研究結(jié)果顯示，噴施MeJA處理后，Ci變化趨勢(shì)與Pn變化趨勢(shì)不同，噴施外源物質(zhì)MeJA并不會(huì)因?yàn)橛绊慓s而影響連翹葉Pn的變化。噴施外源MeJA對(duì)連翹葉片Pn和SPAD值表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，推測(cè)可能是MeJA誘導(dǎo)了連翹葉片葉綠素的積累，進(jìn)而提高了Pn，增強(qiáng)了光合能力。

MeJA可作為信號(hào)分子引起植物發(fā)生防御反應(yīng)，誘導(dǎo)植物體內(nèi)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，促使黃酮、萜類(lèi)、酚酸類(lèi)等次生代謝物積累[18]。MeJA處理可大幅提高遠(yuǎn)志、艾納香等的總黃酮含量[5,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源MeJA能夠誘導(dǎo)連翹葉中總黃酮和木脂素類(lèi)成分(連翹苷)的積累，對(duì)苯乙醇苷類(lèi)成分(連翹酯苷A)的積累則呈抑制作用。這可能是由于連翹苷和連翹酯苷A具有部分共同的前體，外源噴施MeJA可激活其共同前體物質(zhì)和下游連翹苷生物合成途徑中某些酶的活性，造成前體物質(zhì)和連翹苷合成的積累，而由于共同前體物質(zhì)被連翹苷合成所利用，從而引起連翹酯苷A合成的抑制。

PAL是苯丙烷類(lèi)代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶，它可以催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成中間產(chǎn)物(反式肉桂酸、阿魏酸)等，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為黃酮類(lèi)、植保素、木脂素等次生代謝產(chǎn)物[20]，PAL的表達(dá)量可以間接影響總黃酮等次生代謝產(chǎn)物的含量。羅才林等[21]發(fā)現(xiàn)，在MeJA處理下，白及PAL活性顯著增加。馬海霞等[22]發(fā)現(xiàn)，MeJA能夠顯著增強(qiáng)橡膠草的PAL活性。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施MeJA后2、6 h，連翹葉PAL活性均高于CK，但隨著噴施后時(shí)間延長(zhǎng)，PAL活性下降。雖然PAL活性降低，但總黃酮和其他次生代謝產(chǎn)物含量并沒(méi)有明顯下降，可能是總黃酮和其他次生代謝產(chǎn)物含量與PAL活性相比存在一個(gè)相對(duì)滯后期。

綜上所述，噴施不同濃度MeJA及噴施后不同時(shí)間對(duì)連翹葉Pn、Ci、Gs和Tr的影響不同，對(duì)連翹葉中總黃酮、連翹苷及連翹酯苷A積累的影響也不同，0.01 mmol/L MeJA噴施后48 h，連翹葉黃酮及連翹苷含量均達(dá)到最高，且連翹酯苷A含量也較對(duì)照顯著提高。