張晶晶 陳云珍 黃旅珍 陳莉

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是一種臨床上常見(jiàn)的黃斑變性類疾病，可造成進(jìn)行性、不可逆性中心視力喪失，是全球發(fā)達(dá)國(guó)家成年人致盲的首要疾病之一[1-3]。隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的日益加劇，由AMD所致的盲目人群數(shù)量激增，給整個(gè)社會(huì)帶來(lái)巨大的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AMD的病理改變主要是視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的丟失和損傷，最終造成視力損害。脂褐素又稱“老年色素”，在眼部主要存在于RPE細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞在衰老過(guò)程中逐漸積累的一種棕黃色物質(zhì)[4]。脂褐素含有十余種不同的成分，包括各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及代謝殘骸等，近年來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺(A2E)是脂褐素中重要的基團(tuán)[5]。脂褐素及其主要成分A2E作為不完全降解的殘余物長(zhǎng)期堆積在RPE細(xì)胞內(nèi)，會(huì)造成細(xì)胞的衰老及凋亡，是黃斑變性發(fā)生、發(fā)展的主要因素之一[6]。

自噬是細(xì)胞對(duì)于環(huán)境變化的有效反應(yīng)，對(duì)新陳代謝具有舉足輕重的作用。一方面，自噬可以作為一種防御機(jī)制應(yīng)對(duì)因饑餓、缺氧、氧化應(yīng)激等對(duì)細(xì)胞造成的損傷，清除有缺陷的蛋白或者細(xì)胞器；另一方面，如果自噬被過(guò)度激活，它也可以啟動(dòng)“自噬性細(xì)胞死亡(autophagic cell death)”程序或者和凋亡協(xié)同作用導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[7]。因此，自噬是一把雙刃劍。現(xiàn)有的研究已發(fā)現(xiàn)自噬與AMD病理機(jī)制相關(guān)，可能參與了RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激后的清除過(guò)程[8]，但對(duì)于自噬在RPE細(xì)胞損傷和AMD發(fā)病機(jī)制中的確切作用尚不十分清楚。因此，本研究旨在探討自噬對(duì)人RPE細(xì)胞內(nèi)脂褐素成分A2E誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)中的作用，并為治療AMD提供了一種可能的策略。

1 材料與方法

1.1 材料人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。A2E由北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科實(shí)驗(yàn)室黃旅珍研究員饋贈(zèng)。DMEM-F12培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich，美國(guó))；胎牛血清(Gibco，美國(guó))；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(Dojindo，日本)；ProcartaPlex細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(Panomics，美國(guó))；兔抗人LC3抗體、兔抗人Beclin-1抗體、兔抗人p62抗體(Abcam，美國(guó))；兔抗人β-actin抗體、山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology，美國(guó))；小鼠抗兔熒光二抗(Invitrogen，美國(guó))；Luminex 200儀器、電泳儀、聚丙烯酰胺垂直電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(BioRad，美國(guó))；超微切片機(jī)(Wetzlar，德國(guó))；熒光顯微鏡(Nikon，日本)；透射電子顯微鏡(FEI，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理ARPE-19細(xì)胞采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至 80%～90%融合時(shí)，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化傳代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 A2E作用濃度篩選ARPE-19細(xì)胞按每孔5000個(gè)接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別用含A2E濃度為0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，每種濃度分別設(shè)1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)終止培養(yǎng)，之后用PBS清洗兩次后更換為100 μL含100 g·L-1CCK-8的DMEM-F12完全培養(yǎng)液繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的光密度，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。篩選出A2E的適宜作用濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 細(xì)胞因子檢測(cè)用含20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞6 h 和12 h后終止培養(yǎng)，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)，同時(shí)用不含A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞作為對(duì)照。根據(jù)ProcartaPlex細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的操作步驟，選擇與AMD發(fā)病密切相關(guān)的10種細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)行檢測(cè)，被檢測(cè)的因子包括：細(xì)胞間黏附分子(ICAM)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10、促血管生成素-2(Ang-2)、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)。在濾板的每孔中加入50 μL抗體珠，用洗滌液沖洗；每孔加50 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，室溫孵育1 h，加入25 μL檢測(cè)抗體溶液，室溫下500 r·min-1振動(dòng)濾板30 min；加入鏈霉親和素-PE，用Luminex 200儀器進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，加入含有20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，分別于 1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后倒掉含A2E的培養(yǎng)液，將各組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2遍，用細(xì)胞刷刮下細(xì)胞，收集后2000 r·min-1離心10 min，棄上清，留細(xì)胞沉淀，同時(shí)用不含A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞作為對(duì)照；將4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液沿管壁緩慢加入沉淀的細(xì)胞中，4 ℃固定2 h后轉(zhuǎn)移到4 ℃ PBS中保存1～2 h，PBS漂洗3次；將樣品加入4 ℃預(yù)冷的鋨酸固定液中，4 ℃ 固定2 h，PBS漂洗3次，梯度酒精脫水；環(huán)氧樹脂浸透包埋樣品，超薄切片機(jī)切片；醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)并拍片。

1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞中LC3的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，以每孔40 000個(gè)接種于24孔板，孔板內(nèi)置入載玻片，常規(guī)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液；用含有20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h，同時(shí)用不含A2E的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞作為對(duì)照。取出細(xì)胞爬片，用40 g·L-1多聚甲醛PBS固定15 min；體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100穿透液滲透10 min；血清封閉液封閉30 min；滴加兔抗人LC3抗體(1100)4 ℃過(guò)夜；PBS洗3次，滴加小鼠抗兔熒光標(biāo)記二抗(1200)，37 ℃避光反應(yīng)2 h，PBS洗3次后熒光淬滅封片劑封片；暗室中熒光顯微鏡下選擇波長(zhǎng)為490 nm觀察LC3綠色熒光斑點(diǎn)并計(jì)數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)Beclin-1和p62的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)，用含有20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液分別培養(yǎng)1 h、3 h、6 h、12 h、24 h，同時(shí)用不含A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞作為對(duì)照。將收獲的ARPE-19細(xì)胞溶解在RIPA緩沖液，12 000 r·min-1、4 ℃離心30 min去除細(xì)胞碎片，收集上清液，采用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量；SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜；用50 g·L-1脫脂牛奶封閉膜 1 h，配制適當(dāng)濃度的一抗(Beclin-1抗體，11000；p62抗體，11000；β-actin抗體，11000)，將PVDF膜放入其中，并以50 r·min-1的速度搖晃1 h后4 ℃ 過(guò)夜；TBST洗滌緩沖液搖床上洗滌3次；15000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h。利用ImageJ軟件分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度A2E對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的影響CCK-8法檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，10 μmol·L-1的A2E分別作用ARPE-19細(xì)胞1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化；20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細(xì)胞6 h細(xì)胞活性開始下降，細(xì)胞增殖受到抑制，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活性下降更明顯，與對(duì)照相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P< 0.05)；當(dāng)A2E濃度達(dá)到30 μmol·L-1時(shí)，與對(duì)照相比，A2E作用3 h細(xì)胞增殖即受到明顯抑制(P<0.001)，提示該濃度對(duì)細(xì)胞具有較高的毒性作用(圖1)。因此本實(shí)驗(yàn)選擇20 μmol·L-1的A2E進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1不同濃度A2E對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖能力的影響 與對(duì)照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.2 A2E對(duì)ARPE-19細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響采用多重細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細(xì)胞后各種細(xì)胞因子的表達(dá)變化結(jié)果顯示，ARPE-19細(xì)胞6 h起，細(xì)胞因子ICAM、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、Ang-2、IGF-1、TGF-β表達(dá)水平均有所升高，與未給予A2E處理的對(duì)照相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，細(xì)胞因子PIGF和VEGFA的表達(dá)水平在20 μmol·L-1A2E作用12 h后也明顯升高(均為P<0.01)(見(jiàn)圖2)。提示A2E能夠刺激ARPE-19細(xì)胞分泌多種AMD相關(guān)的炎癥因子、趨化因子和血管生長(zhǎng)因子。

圖2 20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19細(xì)胞6 h、12 h后對(duì)各細(xì)胞因子的影響 與對(duì)照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 A2E對(duì)ARPE-19細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響利用透射電子顯微鏡觀察A2E能否誘導(dǎo)ARPE-19自噬的發(fā)生，結(jié)果顯示，最早從20 μmol·L-1的A2E作用1 h開始，ARPE-19細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以見(jiàn)到由雙層膜構(gòu)成的碗狀結(jié)構(gòu)即“吞噬泡”，尚未收口，這是自噬體開始形成的標(biāo)志；在隨后的3 h、6 h，觀察到了典型的雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)；A2E作用12 h和 24 h 時(shí)，可以看到溶酶體膜和自噬泡膜融合后形成的單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體結(jié)構(gòu)；自噬溶酶體在A2E作用24 h時(shí)開始出現(xiàn)內(nèi)容物減少，體積逐漸縮小，提示自噬溶酶體的退化和降解(圖3)。至此，通過(guò)電子顯微鏡證實(shí)了A2E能夠激活A(yù)RPE-19細(xì)胞的自噬反應(yīng)，并觀察到整個(gè)自噬潮發(fā)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

圖3 透射電子顯微鏡下觀察20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 A：對(duì)照；B：作用1 h；C：作用3 h；D：作用6 h；E：作用12 h；F：作用24 h。

2.4 免疫熒光染色檢測(cè)A2E對(duì)ARPE-19細(xì)胞LC3表達(dá)的影響用濃度為20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察LC3蛋白形成的綠色熒光斑點(diǎn)，結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細(xì)胞6 h起即可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LC3熒光呈現(xiàn)點(diǎn)狀聚集，此時(shí)斑點(diǎn)數(shù)量較少，體積較小，彌散在細(xì)胞質(zhì)中，至12 h時(shí)熒光斑點(diǎn)數(shù)量達(dá)到最多，顆粒也最大，差異最明顯，24 h時(shí)綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)量開始下降，熒光強(qiáng)度也較前減弱(圖4)，提示自噬溶酶體開始退化和降解，自噬活性逐漸減弱。

圖4 20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19細(xì)胞不同時(shí)間后LC3熒光顆粒的表達(dá)

2.5 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)用濃度為20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細(xì)胞，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和p62的表達(dá)，用以評(píng)價(jià)自噬的水平。結(jié)果顯示，與未給予A2E處理的對(duì)照相比，給予20 μmol·L-1A2E處理后1 h、3 h、6 h、12 h及24 h的ARPE-19細(xì)胞中Beclin-1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(均為P<0.01)，其中作用12 h時(shí)的蛋白表達(dá)量達(dá)到最高，這與上述LC3熒光斑點(diǎn)的表達(dá)變化相一致；與對(duì)照相比，20 μmol·L-1A2E處理后不同時(shí)間點(diǎn)ARPE-19細(xì)胞中p62蛋白的表達(dá)水平均顯著下降(均為P<0.05)(圖5)。

圖5 20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19細(xì)胞不同時(shí)間后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 與對(duì)照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

AMD是目前影響老年人視力和生存質(zhì)量的主要眼科疾病之一，其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，仍缺乏有效的治療手段。近年來(lái)的研究表明，一種年齡相關(guān)的色素——脂褐素及其核心成分A2E在AMD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，它們隨年齡增長(zhǎng)而沉積于視網(wǎng)膜下，并可能通過(guò)慢性光化學(xué)作用損傷局部視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜，從而導(dǎo)致AMD的發(fā)生[9]。

脂褐素是一種脂質(zhì)或蛋白質(zhì)的聚合物，存在于不同組織有絲分裂后細(xì)胞的溶酶體內(nèi)。A2E作為脂褐素主要的載體成分，是視黃醛代謝后在RPE細(xì)胞內(nèi)沉積的產(chǎn)物，由于它難于降解，就以脂褐素的形式積聚在RPE細(xì)胞中[10]。一些學(xué)者對(duì)RPE細(xì)胞中各種溶酶體酶活性在A2E影響下的變化進(jìn)行檢測(cè)；另一些學(xué)者在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，脂褐質(zhì)大量聚集降低了RPE細(xì)胞的吞噬功能[11-13]。由于A2E對(duì)離體培養(yǎng)的ARPE細(xì)胞的損傷作用有時(shí)間和劑量累積效應(yīng)，因此尋求合適的時(shí)間和劑量是進(jìn)一步研究A2E在AMD發(fā)病中作用的關(guān)鍵。有研究報(bào)道，人眼內(nèi)RPE細(xì)胞中A2E的濃度水平為每105個(gè)細(xì)胞中 60～130 ng[14]或每眼中含830 pmol[15]，這相當(dāng)于體外用濃度為15～30 μmol·L-1的A2E培養(yǎng)ARPE細(xì)胞數(shù)小時(shí)的水平[16]。本研究中當(dāng)A2E濃度為20 μmol·L-1時(shí)，一方面對(duì)體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷作用，另一方面與人眼中的A2E濃度最接近，能更好地模擬人眼內(nèi)RPE細(xì)胞的生理和病理情況，是理想的實(shí)驗(yàn)觀察濃度。因此，我們選擇20 μmol·L-1的A2E進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

近年來(lái)，有學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)A2E與AMD發(fā)病中的某些重要環(huán)節(jié)具有相關(guān)性。正常情況下，RPE細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量免疫抑制因子(如IL-18、IL-37等)，防止過(guò)度免疫炎癥反應(yīng)損傷眼內(nèi)組織[17]。當(dāng)RPE細(xì)胞受損時(shí)，不能分泌足夠的抑制因子，眼內(nèi)免疫豁免穩(wěn)態(tài)喪失，眼內(nèi)長(zhǎng)期處于慢性炎癥狀態(tài)，長(zhǎng)期積累損傷導(dǎo)致了AMD的發(fā)生[18]。RPE細(xì)胞激活后將分泌大量促炎因子，誘發(fā)炎癥免疫反應(yīng)的瀑布式激活。Anderson等[19]發(fā)現(xiàn)，A2E能夠刺激RPE細(xì)胞產(chǎn)生炎癥相關(guān)趨化因子和細(xì)胞因子，而包括NLRP3、Caspase-1和ASC在內(nèi)的炎癥小體參與了這一過(guò)程。Caspases作為炎癥小體的“反應(yīng)器”，可以將無(wú)活性的炎癥因子的前體[主要為IL-1β前體(pro-IL-1β)和IL-18前體(pro-IL-18)]水解為有活性的成熟因子(如IL-1β、IL-18)，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[20]。而 NLRP3炎癥小體激活，能夠使其信號(hào)通路下游炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-33以及 TNF-α等分泌增加[21]。RPE功能受損不僅會(huì)導(dǎo)致脈絡(luò)膜毛細(xì)血管代謝障礙、光感受器細(xì)胞死亡，而且誘發(fā)的局部炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)新生血管生成[22]。Iriyama等[23]發(fā)現(xiàn)，在小鼠視網(wǎng)膜下注入A2E三周后能夠誘導(dǎo)RPE細(xì)胞死亡，并伴有RPE和脈絡(luò)膜內(nèi)VEGF表達(dá)水平的升高。本研究采用20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細(xì)胞，選擇了10種與AMD發(fā)病密切相關(guān)的炎癥因子、趨化因子和血管生長(zhǎng)相關(guān)因子(包括ICAM、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、Ang-2、PIGF、IGF-1、TGF-β及VEGFA)，檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)上清液中各種細(xì)胞因子的變化，結(jié)果證實(shí)，A2E能夠刺激RPE細(xì)胞分泌多種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和血管生長(zhǎng)相關(guān)因子，這為A2E與AMD發(fā)病機(jī)制中炎癥、新生血管之間的聯(lián)系提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)成分自我降解的過(guò)程，包括自噬的誘導(dǎo)、自噬體膜的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及內(nèi)容物的降解[24]。自噬對(duì)細(xì)胞有著雙重作用，一方面它可以清除受損病變的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)，或?yàn)轲囸I條件下的細(xì)胞提供能量和底物；但持續(xù)而劇烈的自噬卻會(huì)導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，又稱為II型程序性細(xì)胞死亡[25]。本研究中，我們將A2E作用于ARPE-19細(xì)胞，結(jié)果顯示，ARPE-19細(xì)胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)碗狀、尚未收口的雙層膜結(jié)構(gòu)的“吞噬泡”，隨著時(shí)間推移出現(xiàn)自噬體結(jié)構(gòu)以及自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，這些統(tǒng)稱為自噬囊泡。自噬囊泡在A2E作用24 h時(shí)開始出現(xiàn)內(nèi)容物減少，體積逐漸縮小，提示自噬溶酶體的退化和降解。至此，我們通過(guò)透射電子顯微鏡證實(shí)了A2E作用于RPE細(xì)胞能夠激活細(xì)胞的自噬反應(yīng)，并觀察到整個(gè)自噬潮發(fā)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

自噬過(guò)程由自噬相關(guān)基因(Atg)調(diào)控，LC3(Atg8)是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3-I，LC3-I散在分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)自噬體形成后，LC3-II始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來(lái)作為自噬體的標(biāo)記，且LC3-II的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[26-27]。自噬發(fā)生過(guò)程中，通過(guò)免疫熒光的方法檢測(cè)內(nèi)源性LC3熒光強(qiáng)度的變化即可以反映自噬活性，自噬誘導(dǎo)后的細(xì)胞表現(xiàn)為熒光斑點(diǎn)狀聚集增多。BECN1是酵母中自噬基因Atg6的同源物，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)基因[28]。其編碼的Beclin-1蛋白可調(diào)控自噬前體的形成，引導(dǎo)其他的Atg蛋白在自噬體膜上的定位[29]。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Beclin-1可以加強(qiáng)血清和氨基酸撤除誘導(dǎo)的自噬，說(shuō)明Beclin-1是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子[30]。Beclin-1-/-小鼠自噬缺陷，細(xì)胞凋亡卻正常，說(shuō)明Beclin-1是自噬特異性的調(diào)控基因[31]。因此，通過(guò)Western blot檢測(cè)Beclin-1的表達(dá)水平，能夠?qū)?xì)胞的自噬活性進(jìn)行進(jìn)一步的判斷。p62是一種自噬連接蛋白，Komatsu等[32]報(bào)道了p62和LC3之間的關(guān)聯(lián)，證實(shí)p62在自噬中的作用。研究表明，p62介導(dǎo)了自噬轉(zhuǎn)換的蛋白質(zhì)聚集物的形成，這表明p62通過(guò)自噬促進(jìn)了蛋白質(zhì)的選擇性降解。因此，p62作為一個(gè)適配器，結(jié)合泛素化的蛋白質(zhì)聚集物，并將它們傳遞給自噬體[33]。本研究中，20 μmol·L-1A2E作用下的ARPE-19細(xì)胞中Beclin-1蛋白的表達(dá)明顯增加，p62蛋白的表達(dá)明顯下降，說(shuō)明A2E能夠引起ARPE-19細(xì)胞自噬活性的增加，Beclin-1及p62蛋白可能參與了這一過(guò)程。

綜上所述，本研究證實(shí)了20 μmol·L-1的A2E能夠誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的自噬發(fā)生；該濃度的A2E同時(shí)能夠抑制ARPE-19細(xì)胞的增殖，并刺激多種AMD相關(guān)炎癥因子和新生血管因子的分泌。至于本研究中A2E引起的自噬激活在這一過(guò)程中究竟扮演了何種角色，還有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。