鄭 堯，邱澤慧，王錫昌，2*

凍藏是肉及其制品（meat and meat products，M & MP）最常用的長(zhǎng)期貯藏方法，可以有效延長(zhǎng)貨架期，增大銷(xiāo)售半徑，保證季節(jié)性原料持續(xù)供應(yīng)，食用方便，適合青年消費(fèi)者。日本等地的刺身食品，由于沒(méi)有熟制過(guò)程（直接生食），所以存在寄生蟲(chóng)等安全性問(wèn)題。而經(jīng)過(guò)冷凍可以有效殺死寄生蟲(chóng)，保證了安全性。雖然凍藏可以通過(guò)抑制微生物生長(zhǎng)和酶促反應(yīng)來(lái)防止M & MP 腐敗變質(zhì)，但是M & MP 在長(zhǎng)期凍藏過(guò)程中仍不可避免地發(fā)生品質(zhì)下降[1-2]。

脂質(zhì)氧化和蛋白氧化（protein oxidation，PO）是導(dǎo)致M & MP 在加工和貯藏過(guò)程中品質(zhì)下降的主要因素[3]，在凍藏條件下仍能持續(xù)進(jìn)行[4]。脂質(zhì)氧化的機(jī)制及其對(duì)品質(zhì)的影響已有廣泛研究[5]，而PO 近年來(lái)才逐漸受到關(guān)注。PO 是指蛋白質(zhì)發(fā)生的共價(jià)修飾，這種共價(jià)修飾由活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活 性 氮（reactive nitrogen species，RNS）直接誘導(dǎo)產(chǎn)生，或是由氧化脅迫產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物間接誘導(dǎo)而產(chǎn)生[6]。ROS 可以氧化修飾蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈，同時(shí)可以攻擊蛋白質(zhì)的碳骨架，使其斷裂或形成共價(jià)交聯(lián)[7]。這些化學(xué)修飾會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的表面疏水性、構(gòu)象、溶解性以及與蛋白酶的作用等造成不可逆的改變[8-9]，最終影響M & MP 的食用品質(zhì)，如持水性、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、色澤、營(yíng)養(yǎng)等[10-12]。除了食品領(lǐng)域的研究外，近年來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)，人體通過(guò)膳食攝入被氧化的蛋白，會(huì)引起機(jī)體的氧化應(yīng)激[13]，對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在影響，并與帕金森綜合征、阿爾茲海默癥以及白內(nèi)障等年齡相關(guān)的疾病有關(guān)[6]。

本文首先介紹PO 的發(fā)生機(jī)制、氧化修飾造成的結(jié)構(gòu)變化以及常用檢測(cè)指標(biāo)，梳理凍藏過(guò)程中影響PO 發(fā)生和程度的因素，綜述凍藏引發(fā)的蛋白氧化對(duì)M & MP 食用品質(zhì)的影響。

1 肉及其制品中蛋白氧化機(jī)理

為了研究?jī)霾貤l件下M & MP 中PO 及其對(duì)食用品質(zhì)的影響，首先要弄清PO 的反應(yīng)機(jī)理。目前已有對(duì)PO 反應(yīng)機(jī)理的研究報(bào)道[14]。本文概述PO 的發(fā)生機(jī)制、氧化結(jié)果及其測(cè)定方法。

1.1 蛋白質(zhì)直接氧化

M & MP 中的PO 可以直接由活性物質(zhì)ROS和RNS 誘導(dǎo)產(chǎn)生（圖1）。ROS 包括①自由基：羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2·-）等；②非自由基：過(guò)氧化氫（H2O2）、氫過(guò)氧化物（ROOH）、次氯酸（HClO）等；③活性醛基、活性酮基等。RNS 包括一氧化氮（NO）、二氧化氮自由基（·NO2）等?；钚晕镔|(zhì)的產(chǎn)生包括內(nèi)源因素和外源因素兩大類，內(nèi)源因素：正常生理代謝（如線粒體電子傳遞）、酶促反應(yīng)（如NADPH 氧化酶、黃嘌呤氧化酶）、金屬催化等；外源因素：輻照（紫外線、X 射線、γ 射線及可見(jiàn)光等），以及環(huán)境污染物等[14]。ROS 表現(xiàn)出極強(qiáng)的反應(yīng)活性，通過(guò)抽氫的方式將肽主鏈上的中心碳基團(tuán)轉(zhuǎn)化為自由基（P·），在氧的存在下進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化成烷過(guò)氧自由基（POO·），烷過(guò)氧自由基再?gòu)钠渌肿由铣闅湫纬蛇^(guò)氧化烷基（POOH）[15]，其具體反應(yīng)途徑在袁凱等[16]研究中有較為詳細(xì)的報(bào)道。目前普遍認(rèn)為PO 的機(jī)理和脂質(zhì)氧化相似，均為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，而PO 的復(fù)雜之處在于其氧化位點(diǎn)更多，氧化途徑更復(fù)雜，氧化產(chǎn)物也更多樣。

1.2 蛋白質(zhì)間接氧化

M & MP 系統(tǒng)中引起蛋白質(zhì)間接氧化的因素主要包括脂質(zhì)氧化和肌紅蛋白（圖1）。脂質(zhì)和蛋白質(zhì)是M & MP 中最主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)脂質(zhì)氧化和PO 也是M & MP 品質(zhì)下降的兩個(gè)主要原因。眾多研究表明脂質(zhì)氧化導(dǎo)致M & MP 在貯藏期間產(chǎn)生異味，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降[17]，而由脂質(zhì)氧化造成的蛋白質(zhì)、核酸、淀粉等其它大分子的氧化損傷尚未充分闡明[18]。目前大部分學(xué)者認(rèn)為脂質(zhì)氧化產(chǎn)生大量活性中間產(chǎn)物，能直接或間接加速蛋白質(zhì)氧化。脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物二醛基化合物，如丙二醛可與蛋白質(zhì)分子的氨基發(fā)生作用而導(dǎo)致多肽鏈的鏈內(nèi)交聯(lián)和鏈間交聯(lián)。趙冰等[19]以肌原纖維蛋白為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)氧化可以促進(jìn)PO，并且PO 的程度隨脂質(zhì)氧化程度的增加而增加。

圖1 肉及其制品中蛋白氧化的機(jī)制[6-7，24]Fig.1 The mechanism of protein oxidation in meat and meat products[6-7，24]

肌紅蛋白是肌肉的天然組分，是肌肉組織中血紅素鐵的重要來(lái)源。Mario 等[20]發(fā)現(xiàn)肌紅蛋白比Fe3+、Cu2+更能促進(jìn)肌原纖維PO。肌紅蛋白在氧化生成高鐵肌紅蛋白（MetMb）的過(guò)程中生成超氧陰離子，后者迅速歧化生成H2O2。這些活性物質(zhì)可以直接引發(fā)PO，也可以引發(fā)脂肪氧化而進(jìn)一步促進(jìn)PO。此外，H2O2可以和MetMb 生成具有強(qiáng)氧化能力的MetMb-H2O2和超鐵肌紅蛋白[21]。H2O2還可以和肌肉中的Fe2+通過(guò)芬頓反應(yīng)生成羥基自由基[22]，該反應(yīng)也作為模擬M & MP 氧化的經(jīng)典體系[23-24]。

1.3 蛋白氧化結(jié)果及測(cè)定方法

關(guān)于蛋白直接氧化和間接氧化造成的損傷已有全面、深入的綜述報(bào)道[14]，簡(jiǎn)言之主要包括氨基酸側(cè)鏈和蛋白骨架兩個(gè)方面（圖1）。大量研究證實(shí)，所有氨基酸均可被氧化修飾，其中半胱氨酸和甲硫氨酸因含有活性巰基而最易被氧化，其次是堿性氨基酸可被活性氧直接攻擊，形成羰基衍生物。蛋白骨架的損傷主要包括裂解與交聯(lián)聚合，交聯(lián)主要通過(guò)二硫鍵和二酪氨酸形成。上述氧化修飾會(huì)改變蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)與構(gòu)象、溶解性、酶活性等，最終影響M & MP 的食用品質(zhì)。

為了評(píng)價(jià)M & MP 中的PO，需要穩(wěn)定、可靠的指標(biāo)來(lái)指示PO 的發(fā)生、程度、結(jié)果。由于反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜且自由基種類、目標(biāo)蛋白、氧化產(chǎn)物均多種多樣，因此選擇唯一能代表食品體系PO 程度的指標(biāo)比較困難[25]。目前通常采用同時(shí)測(cè)定多種PO產(chǎn)物的方式來(lái)應(yīng)對(duì)此問(wèn)題，并不斷尋找更加合適PO 的評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)PO 修飾的結(jié)果（圖1），目前常用的測(cè)定方法包括：①羰基含量。蛋白羰化被認(rèn)為是PO 過(guò)程中最顯著的變化[26]，因此羰基含量被廣泛用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的氧化程度，其產(chǎn)生途徑包括直接氧化作用、Micheal 加成、α-酰胺化途徑，多肽骨架鏈β-斷裂[16]。傳統(tǒng)測(cè)定羰基含量通常采用2，4-二硝基苯肼（DNPH）法。近年來(lái)，Estévez[7]利用高效液相色譜-熒光檢測(cè)（HPLC-FLD）定量測(cè)定兩種特異性羰基化產(chǎn)物——α-氨基己二醛（αaminoadipic semialdehyde，AAS）和γ-谷氨酸半醛（γ-glutamyl semialdehyde，GGS），AAS 是賴氨酸的氧化產(chǎn)物，而GGS 是脯氨酸和精氨酸的氧化產(chǎn)物，兩者占羰基總量的60%左右[28]。這種特異性羰基化產(chǎn)物的測(cè)定方法不僅避免了DNPH 法測(cè)定值偏高的問(wèn)題，而且更為重要的是有助于研究其發(fā)生機(jī)理，在后續(xù)反應(yīng)中發(fā)揮的作用以及對(duì)食品體系產(chǎn)生的影響。②巰基及二硫鍵。半胱氨酸的活性巰基極易被氧化成二硫鍵，因此巰基含量也常作為PO 的評(píng)價(jià)指標(biāo)，目前普遍采用5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）法測(cè)定。③裂解與交聯(lián)。蛋白質(zhì)氧化往往導(dǎo)致其分子發(fā)生裂解或交聯(lián)聚合，目前普遍采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行分析，并且通過(guò)是否添加還原劑（β-巰基乙醇/二硫蘇糖醇）判斷交聯(lián)是否由二硫鍵形成。此外，蛋白交聯(lián)會(huì)導(dǎo)致粒徑增大，通過(guò)激光衍射法測(cè)定粒徑變化是一種快速、簡(jiǎn)單的蛋白交聯(lián)測(cè)定方法[27]。④顯微結(jié)構(gòu)。借助電子顯微鏡直接觀察M & MP 肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)，如Zhang 等[28]通過(guò)掃描電鏡研究南美白對(duì)蝦經(jīng)120 d 凍藏后PO 對(duì)肌肉組織結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)凍藏組肌纖維明顯收縮、間隙增大。⑤其它指標(biāo)。主要包括色氨酸損失、席夫堿（SB）生成（由蛋白羰基化產(chǎn)物和堿性氨基酸生成）、二酪氨酸含量等。

目前PO 的檢測(cè)無(wú)論從靈敏度還是精確度上都取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，未來(lái)需進(jìn)一步研究除賴氨酸、精氨酸、脯氨酸外其它易被氧化氨基酸的特異性氧化產(chǎn)物，從而深入解析PO 的反應(yīng)途徑，了解其反應(yīng)機(jī)理。此外，針對(duì)凍藏條件下的PO 而言，目前絕大多數(shù)的檢測(cè)方法均需在樣品解凍后再測(cè)定，由此導(dǎo)致PO 定量結(jié)果既包含凍藏的影響，也包含解凍過(guò)程造成的影響。近期Cheng 等[29]通過(guò)異譜二維相關(guān)結(jié)合近紅外高光譜成像技術(shù)，在未解凍的狀態(tài)下成功測(cè)定豬肉凍藏過(guò)程中的蛋白氧化，這為通過(guò)物理方法快速測(cè)定凍藏M & MP 蛋白氧化打下基礎(chǔ)，值得推廣及深入研究。

2 凍藏過(guò)程中影響肉及其制品蛋白氧化的因素

蛋白作為M & MP 的主要成分在加工貯藏中發(fā)揮重要作用，由于肌肉中含有大量脂肪、肌紅蛋白等促氧化物質(zhì)，并且在宰后、加工貯藏過(guò)程中自身抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，因此極易受到ROS 攻擊而被氧化（見(jiàn)1.2 節(jié)）。肌肉在熟化及冷藏過(guò)程中均會(huì)發(fā)生PO[30]，M & MP 在輻照[31-32]、蒸煮[33]、干腌[34]、發(fā)酵[35]等加工過(guò)程中發(fā)生的PO 也有大量報(bào)道。對(duì)凍藏過(guò)程而言，近年來(lái)大量研究表明豬肉[36]、牛肉[37]、羊肉[38]、雞肉[39]、魚(yú)肉[40]等均會(huì)發(fā)生PO。影響凍藏條件下PO 程度的主要因素有：凍藏溫度、凍藏時(shí)間、原料性狀、凍前處理、溫度波動(dòng)、反復(fù)凍融等，下文將逐一說(shuō)明。

2.1 原料特性與凍前處理

原料自身屬性與凍藏前預(yù)處理方式對(duì)PO 的影響如表1所示。影響凍藏M & MP 中PO 的內(nèi)源因素主要包括：血紅素鐵含量、脂肪含量及組成、抗氧化酶活性等。Utrera 等[41]研究3 種原料的肉餅（牛肉、豬肉、雞肉）在凍藏條件下的變化，發(fā)現(xiàn)牛肉餅的氧化程度高于豬肉餅和雞肉餅，并分析這是由于牛肉餅中血紅素鐵含量較高引起的。M & MP 中的血紅素鐵主要來(lái)源于肌紅蛋白，血紅素鐵被認(rèn)為是M & MP 中促進(jìn)PO 的重要原因之一（見(jiàn)1.2 節(jié)）。類似的結(jié)果在豬肉[42]中也有報(bào)道，股四頭肌和半膜肌中血紅素鐵含量高于股二頭肌，其氧化程度也高于股二頭?。粚?duì)于脂肪含量而言，3 種脂肪含量的牛肉餅[43]凍藏后，高脂組的蛋白氧化程度顯著大于中脂組和低脂組，這是由于脂肪氧化可以促進(jìn)PO（見(jiàn)1.2 節(jié)）。最新研究更是直接表明脂肪氧化的產(chǎn)物丙二醛通過(guò)加和反應(yīng)（adduct reactions）以及影響活性氧產(chǎn)生系統(tǒng)來(lái)促進(jìn)兔肉肌原纖維蛋白氧化[44]。Utrera 等[45]進(jìn)一步對(duì)牛肉的股四頭肌、腰大肌和背長(zhǎng)肌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)除血紅素鐵外，抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶）和不飽和脂肪酸含量共同影響PO 的程度，抗氧化酶活性較低、不飽和脂肪酸含量較高的股四頭肌PO 程度更高。

表1 原料性狀與凍前處理對(duì)蛋白氧化的影響Table 1 Effects of material properties and pre-freezing treatments on protein oxidation

常見(jiàn)的凍前處理包括原料肉預(yù)切碎、包裝方式、添加抗氧化劑等。切碎豬肉[36]相較于完整豬肉蛋白更易于被氧化，這是因?yàn)榍兴榇龠M(jìn)了氧氣等氧化劑和M & MP 接觸；透氧包裝相較于真空包裝PO 程度更高，透氧包裝中氧氣與M & MP 表面接觸并參與形成自由基和過(guò)氧化物等；在凍藏前添加抗氧化劑能顯著降低PO 程度[46]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加石榴皮提取物[47]、卡拉膠低聚糖[28]等抗氧化劑均能有效抑制M & MP 在凍藏過(guò)程中的PO。

2.2 凍藏溫度與凍藏時(shí)間

凍藏溫度和凍藏時(shí)間是M & MP 在凍藏過(guò)程中最重要的兩個(gè)參數(shù)，凍藏溫度對(duì)PO 的影響如表2所示。諸多研究表明凍藏溫度越低，PO 程度也越低。例如：牛肉餅[48]在不同凍藏溫度下的PO 程度為：-8 ℃＞-18 ℃>-80 ℃，并且-80 ℃下PO程度和未凍組最為接近；虹鱒魚(yú)（Oncorhynchus mykiss）[49]在-20 ℃下羰基含量顯著上升，而在-30℃和-80 ℃條件下，羰基含量均無(wú)顯著變化；豬肉餃子餡[50]在-7 ℃的PO 程度也顯著高于-18 ℃。也有研究發(fā)現(xiàn)，牛肉（M.longissimus lumborum）[51]在-12 ℃和-18 ℃凍藏條件下PO 程度無(wú)顯著差異，可能原因：①牛肉本身的食品原料學(xué)屬性；②溫度差值較小導(dǎo)致結(jié)果不明顯；③傳統(tǒng)的羰基含量測(cè)定（DNPH 法）不夠靈敏。目前普遍采用的商業(yè)凍藏溫度為-18 ℃左右，在此溫度下微生物的生長(zhǎng)繁殖可以得到有效抑制。然而，在此溫度范圍，食品體系中仍有10%～20%的水未被凍結(jié)[52]，導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)濃縮，使鐵、過(guò)氧化氫、肌紅蛋白等促氧化劑濃度上升，加速形成ROS。而大部分未被凍結(jié)的水都圍繞在肌原纖維蛋白周?chē)纬梢粋€(gè)強(qiáng)氧化環(huán)境，從而加速PO。只有當(dāng)溫度達(dá)到-80 ℃時(shí)才能基本抑制M & MP 中的PO。在實(shí)際應(yīng)用中凍藏溫度的選擇主要受制冷條件及經(jīng)濟(jì)成本的限制。為不同種類M & MP 確定合適的凍藏溫度，以期最大程度地保持其品質(zhì)還有待后續(xù)研究。

表2 凍藏溫度對(duì)蛋白氧化的影響Table 2 Effects of frozen storage temperature on protein oxidation

另一個(gè)影響M & MP 中PO 的重要因素是凍藏時(shí)間，研究表明隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，PO 程度不斷增大，鯉魚(yú)片[40]經(jīng)6 個(gè)月凍藏后，羰基含量為起始值的1.3 倍；豬肉[50]凍藏3 個(gè)月后，羰基含量為起始值的2.0 倍。Utrera 等[41]發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期凍藏過(guò)程中AAS、GGS 含量先升高后下降，這是因?yàn)檠趸a(chǎn)物在長(zhǎng)期凍藏過(guò)程中發(fā)生進(jìn)一步的反應(yīng)，生成下一級(jí)的氧化產(chǎn)物。

2.3 溫度波動(dòng)與反復(fù)凍融

凍藏條件下M & MP 在貯運(yùn)流通過(guò)程中經(jīng)歷冷庫(kù)→運(yùn)輸車(chē)→二級(jí)經(jīng)銷(xiāo)（農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、餐飲店、超市）→家庭冰箱等多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)，在此過(guò)程中所面臨最頻繁、最突出的問(wèn)題就是溫度波動(dòng)，凍融可以看作是溫度波動(dòng)的極端結(jié)果[41]。溫度波動(dòng)使得凍結(jié)過(guò)程中形成的冰晶繼續(xù)生長(zhǎng)，也稱為重結(jié)晶[42]（即使保持溫度恒定，因小分子表面自由能較高而不能被牢固的束縛，使水分子從小冰晶表面擴(kuò)散到大冰晶表面上，也能導(dǎo)致冰晶的生長(zhǎng)[45]）。重結(jié)晶一方面可以擠壓并刺破細(xì)胞，造成機(jī)械損傷，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使得線粒體酶和溶酶體酶釋放到細(xì)胞質(zhì)中；另一方面可以濃縮促氧化劑（H2O2、血紅素鐵、肌紅蛋白等），加速ROS 的產(chǎn)生并包圍在蛋白質(zhì)等極性大分子的周?chē)?，造成一個(gè)強(qiáng)氧化環(huán)境。Huang 等[50]發(fā)現(xiàn)豬肉餃子餡在-7 ℃/-18 ℃（溫度每3 天波動(dòng)1 次）凍藏180 d 后羰基含量達(dá)到初始值的3 倍，而-18 ℃凍藏只達(dá)到初始值的2.5 倍。豬肉[54]和雞胸肉[55]分別經(jīng)歷5 次和6次凍融循環(huán)，均出現(xiàn)羰基含量上升而巰基含量下降。耗牛肉[56]7 次凍融過(guò)程中，凍融次數(shù)與PO 呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性（P＜0.01）。鏡鯉魚(yú)[57]肌原纖維蛋白經(jīng)5 次凍融循環(huán)，總巰基含量從98.93 μmol/g 降至75.40 μmol/g，下降23.78%。綜上所述，為了減少M(fèi) & MP 在凍藏過(guò)程中發(fā)生的PO，應(yīng)當(dāng)注意以下幾點(diǎn)：①在設(shè)備、能耗可接受的情況下采用盡可能低的凍藏溫度；②加快凍品的銷(xiāo)售周期；③采用對(duì)氧氣阻隔性強(qiáng)的包裝材料以及真空包裝方式；④根據(jù)M & MP 的屬性添加合適的抗氧化劑；⑤在貯運(yùn)流通過(guò)程中盡力避免溫度波動(dòng)及反復(fù)凍融。

3 蛋白氧化對(duì)凍藏肉及其制品食用品質(zhì)的影響

以往研究認(rèn)為凍藏條件下引起M & MP 品質(zhì)變化的主要內(nèi)在因素是冰晶。隨著PO 研究的日益深入，眾多研究表明凍藏條件下PO 對(duì)M & MP品質(zhì)存在一定影響。也有學(xué)者持不同觀點(diǎn)，如Yang 等[58]研究認(rèn)為相較于氧化和內(nèi)源酶活性變化，冰晶是影響河豚魚(yú)肉品質(zhì)變化的主要原因。無(wú)論如何，PO 為解釋M & MP 品質(zhì)變化提供了一個(gè)新的研究角度。作為肌肉組織的主要成分，蛋白對(duì)M & MP 的食用品質(zhì)起決定作用。如前文所述，由氧化引發(fā)的結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致蛋白功能性質(zhì)發(fā)生改變，最終影響M & MP 的食用品質(zhì)。對(duì)此文獻(xiàn)[14]已深入報(bào)道。本文重點(diǎn)關(guān)注由凍藏引發(fā)的PO，與蛋白變性密切相關(guān)的持水性及質(zhì)構(gòu)性質(zhì)，風(fēng)味、色澤和營(yíng)養(yǎng)等品質(zhì)與PO 的最新研究也稍作闡述。

3.1 持水性與質(zhì)構(gòu)

質(zhì)構(gòu)變化是影響M & MP 品質(zhì)下降、消費(fèi)者接受度下降的一個(gè)主要原因[59]。目前研究表明凍藏引發(fā)的PO 使M & MP 質(zhì)構(gòu)劣化，在禽畜肉中表現(xiàn)為嫩度下降，在魚(yú)肉中表現(xiàn)為硬度下降。豬肉[60]在凍藏過(guò)程中嫩度下降，與席夫堿的形成呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05）。牛肉餅[48]在凍藏過(guò)程中嫩度下降，并且PO 程度越高，嫩度下降越多。造成這種現(xiàn)象的主要原因有兩點(diǎn)：一是PO 使蛋白發(fā)生交聯(lián)，使肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變得更加牢固，從而造成肌肉組織硬度增加[61]；二是PO 使鈣蛋白酶等酶活性降低，這些酶在肉宰后嫩化過(guò)程中通過(guò)降解肌原纖維蛋白使肉發(fā)生嫩化。而魚(yú)肉則完全相反，如鯉魚(yú)[40]在6 個(gè)月的凍藏過(guò)程中硬度不斷下降且伴隨著PO，這可能是由于魚(yú)肉中含有豐富的內(nèi)源蛋白酶，蛋白降解成為影響硬度的主要因素。

持水性是指M & MP 受到外力時(shí)保留其原有水分或外加水分的能力，汁液流失不僅造成經(jīng)濟(jì)損失也使?fàn)I養(yǎng)成分流失。肌原纖維蛋白占總蛋白含量的60%～70%，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)特別是持水性方面起到重要作用，約85%的水分都鎖在此結(jié)構(gòu)中。不同于嫩度，PO 對(duì)M & MP 持水性的影響尚存在爭(zhēng)議。大多數(shù)研究表明PO 導(dǎo)致持水性下降，也有研究報(bào)道，肌原纖維蛋白的持水性隨著氧化程度的增大而增加[62]。最新的研究從電荷角度來(lái)解釋這一矛盾現(xiàn)象，肌原纖維蛋白的等電點(diǎn)（pI）在5.0 左右，而鮮肉的pH 值在5.5 左右，因此鮮肉中的肌原纖維蛋白表面凈電荷為負(fù)電[26]。而PO 使蛋白氨基酸側(cè)鏈被氧化修飾，致賴氨酸、精氨酸、組氨酸等堿性氨基酸大量損失（見(jiàn)1.2 節(jié)），因此肌原纖維蛋白經(jīng)氧化后pI 值進(jìn)一步下降，（Bao 等[62]通過(guò)等電聚焦的方法觀察到氧化后肌原纖維蛋白的pI 值下降）。這樣使得氧化后肌原纖維蛋白的pI 值與環(huán)境pH 值的差距進(jìn)一步增大，表面凈電荷進(jìn)一步增加（圖2）。此后，可能出現(xiàn)兩種截然相反的結(jié)果：一是PO 使肌原纖維蛋白之間通過(guò)二硫鍵產(chǎn)生交聯(lián)，肌纖維間隙變小，從而使持水性下降；二是帶更多負(fù)電的肌原纖維蛋白因靜電斥力而使肌纖維間隙變大，從而增大持水性（圖2）。實(shí)際情況是，哪種模式在什么條件下發(fā)揮主要作用仍有待研究。蛋白凈電荷變化無(wú)疑為探究PO 介導(dǎo)的品質(zhì)變化機(jī)制提供了一個(gè)新視角。在凍藏條件下一般M & MP 持水性下降，如鳙魚(yú)[63]在凍藏條件下PO 與持水性下降顯著相關(guān)，低場(chǎng)核磁共振結(jié)果表明不易流動(dòng)水向自由水轉(zhuǎn)變，自由水進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為汁液流失。Hematyar 等[40]也通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)鯉魚(yú)（Cyprinus carpio L.）魚(yú)片在凍藏過(guò)程中汁液流失與PO 顯著相關(guān)。

圖2 蛋白氧化對(duì)肌原纖維蛋白凈電荷及持水性的影響模型[26，62]Fig.2 Model for the effect of myofibrillar protein oxidation on net charge and water holding capacity[26，62]

3.2 風(fēng)味、色澤與營(yíng)養(yǎng)

風(fēng)味是M & MP 重要的品質(zhì)特征之一。脂肪氧化為M & MP 風(fēng)味變化的主要原因得到證實(shí)。Rhee 等[64]認(rèn)為PO 對(duì)風(fēng)味變化的潛在作用不能被忽視。首先，蛋白降解產(chǎn)生的游離氨基酸可以和PO 產(chǎn)生的羰基化合物通過(guò)Strecker 降解反應(yīng)影響M&MP 的風(fēng)味。Strecker 降解是指在α-二羰基存在的情況下，使游離氨基酸氧化脫氨、氧化脫羧生成Strecker 醛等具有香味的物質(zhì)，是美拉德反應(yīng)中生成香氣物質(zhì)的關(guān)鍵反應(yīng)，如AAS、GGS 可與亮氨酸、異亮氨酸生成SB，再生成Strecker 醛。其次，Lorido 等[60]發(fā)現(xiàn)凍藏組相比對(duì)照組酸敗味增加，認(rèn)為這可能是因?yàn)镻O 使M & MP 變硬，增加了咀嚼時(shí)間，從而增加了風(fēng)味物質(zhì)的釋放。與此同時(shí)咸味也有所增加，這可能是PO 改變了Na+和蛋白的相互作用，并且這兩種風(fēng)味的變化都與SB 生成顯著相關(guān)（P＜0.01）。

色澤變化是消費(fèi)者最容易察覺(jué)到的品質(zhì)特征，影響肉色的兩大主要因素是肌紅蛋白和血紅蛋白的含量，在放血充分的情況下，肉色主要取決于氧合肌紅蛋白（鮮紅色）、肌紅蛋白（暗紅色）和高鐵肌紅蛋白（褐色）間的相對(duì)含量[65]。在凍藏過(guò)程中，冰晶造成的機(jī)械損傷促使活性氧與肌紅蛋白接觸，加速氧化過(guò)程[66]。凍藏期間紅度值顯著下降，這是由于凍藏過(guò)程加速了肌紅蛋白的氧化，使高鐵肌紅蛋白大量積累。鯉魚(yú)[40]（Cyprinus carpio L.）魚(yú)片在凍藏過(guò)程中白度值、紅度值無(wú)顯著變化，而黃度值顯著上升，這可能是由于氧化產(chǎn)物與游離氨基酸反應(yīng)生成SB 等有色化合物。

M & MP 是膳食蛋白的重要來(lái)源，保證了各種氨基酸的充足供應(yīng)。PO 對(duì)M & MP 營(yíng)養(yǎng)的影響主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：必需氨基酸損失和蛋白質(zhì)消化性質(zhì)的改變。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)氨基酸側(cè)鏈被氧化修飾形成羰基化合物及其它衍生物時(shí)，賴氨酸、精氨酸、組氨酸等必需氨基酸大量損失。同樣作為必需氨基酸的苯丙氨酸、色氨酸容易被ROS 攻擊而大量損失。Utrera 等[48]發(fā)現(xiàn)牛肉餅在凍藏過(guò)程中色氨酸含量顯著下降。PO 對(duì)蛋白消化性的作用機(jī)理十分復(fù)雜，Davies[67]認(rèn)為輕微氧化造成的結(jié)構(gòu)變化有助于蛋白酶的識(shí)別，從而提升其消化特性。而高度PO 則使蛋白發(fā)生聚集，不易與蛋白酶相結(jié)合。與此同時(shí)，精氨酸、賴氨酸及芳香族氨基酸等作為蛋白酶的酶切位點(diǎn)，其氧化修飾也使蛋白消化性下降。豬肉在凍藏后蛋白酶體（proteasome）活性顯著下降[68]，這可能與PO 存在一定關(guān)聯(lián)。綜上所述，凍藏引發(fā)的PO 使M & MP 的質(zhì)構(gòu)和色澤發(fā)生劣化，而對(duì)持水性、風(fēng)味及消化特性等則存在兩面性，這主要取決于PO 的程度。

4 結(jié)論與展望

隨著制冷設(shè)備升級(jí)和冷鏈物流的快速發(fā)展，凍藏在M & MP 貯藏中發(fā)揮的作用日益增加。過(guò)去對(duì)凍藏過(guò)程中M & MP 品質(zhì)變化的研究主要集中在冰晶、嗜冷微生物、干耗等，PO 提供了一個(gè)全新的研究角度。從PO 的發(fā)生來(lái)看，雖然凍藏條件下溫度較低，但是仍會(huì)發(fā)生蛋白氧化。在商業(yè)凍藏溫度下，細(xì)胞中仍有部分水未被凍結(jié)，這導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)濃縮，ROS 濃度進(jìn)一步提高，使蛋白質(zhì)處于一個(gè)強(qiáng)氧化環(huán)境中。另外，由于冰晶造成的細(xì)胞機(jī)械損傷，也進(jìn)一步促進(jìn)PO。在M & MP 實(shí)際加工、流通過(guò)程中，原料特性、凍前處理、凍藏溫度、凍藏時(shí)間、溫度波動(dòng)、反復(fù)凍融是影響凍藏過(guò)程中PO程度的6 大因素，各種因素并非單獨(dú)發(fā)揮作用，而是相互作用、影響。PO 對(duì)M & MP 的質(zhì)構(gòu)、色澤產(chǎn)生劣化作用，而對(duì)持水性、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)等食用品質(zhì)表現(xiàn)出兩面性。具體表現(xiàn)在輕微PO 會(huì)提升某些食用品質(zhì)，而劇烈PO 則會(huì)使其劣化。在長(zhǎng)期凍藏條件下因PO 程度難以控制，故M & MP 品質(zhì)發(fā)生劣變。

今后M & MP 凍藏條件下PO 的研究可以從以下幾個(gè)方面開(kāi)展：①深入研究?jī)霾剡^(guò)程中PO與品質(zhì)劣化的相互作用關(guān)系，尤其是區(qū)分PO 與冰晶生長(zhǎng)、蛋白變性等凍品品質(zhì)劣化因素間的差異；②目前對(duì)冷凍品PO 的分析都是在解凍后測(cè)定的，而解凍過(guò)程中必然也會(huì)產(chǎn)生不同程度的PO，今后研究應(yīng)利用物理方法探究未解凍狀態(tài)下凍品的真實(shí)氧化程度；③凍結(jié)方式、凍藏溫度、凍藏時(shí)間、溫度波動(dòng)等雖然是引發(fā)凍品PO 的關(guān)鍵因素，然而這些因素在實(shí)際貯運(yùn)流通過(guò)程中往往難以控制，今后可探究?jī)銮疤幹脤?duì)凍后PO 氧化程度的影響，實(shí)現(xiàn)其源頭靶向調(diào)控。