蔣曉穎，王東亮，魏蓮花，李 丹，胡一弋，何天鵬，張麗琴，趙 婧，袁 媛

腸桿菌科細菌是廣泛分布于人和動物腸道的革蘭陰性桿菌，是臨床最常見的病原菌。肺炎克雷伯菌屬于腸桿菌目、腸桿菌科、克雷伯菌屬，為醫(yī)院及社區(qū)獲得性感染常見的病原菌之一。隨著臨床抗菌藥物的廣泛應(yīng)用以及產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）菌株的流行，碳青霉烯類抗生素用于治療產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌感染[1]并取得良好的效果。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）自1997年被Mackenzie等[2]首次報道以來，已在多個國家被檢出，并造成局部暴發(fā)流行，給抗感染治療和醫(yī)院感染防控帶來巨大挑戰(zhàn)。本研究收集甘肅省人民醫(yī)院臨床連續(xù)分離的肺炎克雷伯菌611株，對其中19株CRKP菌株進行分析。醫(yī)院地處西北重鎮(zhèn)，擁有全省最大的檢驗質(zhì)控中心和微生物檢驗室，了解醫(yī)院CRKP的分布特征及耐藥性，可一定程度上反映西北地區(qū)CRKP分子流行病學特點，旨在為臨床合理用藥、醫(yī)院感染預(yù)防控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 選取甘肅省人民醫(yī)院2018年1月—2019年8月臨床分離的肺炎克雷伯菌株共935株，剔除同一患者同一部位分離的重復(fù)菌株后共納入本研究611株。篩選標準為至少對3種碳青霉烯類抗菌藥物（亞胺培南、美羅培南、厄他培南）中的1種耐藥或中介即判定為CRKP[3]。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗 菌株純分后采用布魯克公司的全自動時間飛行質(zhì)譜儀進行細菌鑒定，藥物敏感試驗采用紙片擴散法，結(jié)果判讀參照2017年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）標準[3]，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。目前因CLSI無替加環(huán)素紙片法藥敏判讀折點，故參照美國FDA制定的折點判讀標準[4]。

1.2.2 碳青霉烯酶表型篩選 參照文獻[5]，CRKP菌株使用生理鹽水配置成0.5麥氏濁度單位菌懸液，均勻涂布于4 mg/L氯唑西林MH瓊脂平板（MH-CLX）上，干燥 3～5 min；每塊平板貼1片美羅培南（10 μg/片），3片厄他培南（10 μg/片），3片厄他培南紙片中1片不加任何試劑，另2片分別迅速滴加6 μL 50 g/L 3-氨基苯酚硼酸（3-aminophenylboronic acid，APBA）溶液或10 μL 0.1 mol/L的EDTA溶 液。平 板 置 于 35℃培 養(yǎng)16～18 h，測量其抑菌圈直徑。美羅培南抑菌圈直徑＜25 mm認定為產(chǎn)碳青霉烯酶，產(chǎn)酶株3片厄他培南紙片中加入試劑APBA比不加任何試劑的藥敏紙片抑菌圈直徑≥5 mm推測為產(chǎn)A類碳青霉烯酶，加EDTA的紙片比不加任何試劑的藥敏紙片抑菌圈直徑≥5 mm推測為產(chǎn)B類碳青霉烯酶。

1.2.3 基因PCR檢測 采取煮沸法[6]提取細菌DNA模板，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法擴增碳青霉烯酶耐藥基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaGES、blaOXA-48，ESBL基因blaSHV、blaCTX-M及頭孢菌素類耐藥基因（AmpC）blaMOX、blaCIT、blaDHA、blaACC、blaEBC、blaFOX，膜孔蛋白基因（Ompk35、Ompk36），引物序列參照文獻[7-8]合成，見表1。PCR陽性產(chǎn)物送上海杰李基因公司測序，序列通過BLAST比對確定基因亞型。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，包括DNA模板1 μL、相應(yīng)上、下游引物各0.5 μL，PCR反 應(yīng)試 劑Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR擴增條件95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火40 s；72 ℃延伸40 s；共循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。

表1 各種耐藥基因引物Table 1 Primers used in this study for amplification of various resistance genes

1.2.5 菌株間親緣關(guān)系分析 通過脈沖場凝膠電泳（PFGE）[9]，分析CRKP菌株之間的同源性關(guān)系，37℃過夜培養(yǎng)的菌株調(diào)至4.0麥氏濁度單位，將其包埋入膠塊，后經(jīng)過裂解、洗滌，限制性內(nèi)切酶XbalI消化，在0.5×TBE緩沖液中電泳19 h，電泳參數(shù)：溫度14 ℃、電壓6 V/cm、脈沖時間2.16～54.17 s，然后經(jīng) Gelred染色30 min成像。采用BioNumerics軟件分析電泳凝膠成像圖譜,相似百分比≥85%為同一菌株的不同克隆亞型。

1.2.6 統(tǒng)計方法 采用Excel 2016錄入數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 院內(nèi)CRKP檢出分布情況

甘肅省人民醫(yī)院2018年1月—2019年8月臨床分離肺炎克雷伯菌共611株，其中CRKP 19株，檢出率為3.1%。2019年7—8月CRKP檢出數(shù)最高，分別為4株、3株。分離的19株CRKP，10株（52.6%）來自成人重癥監(jiān)護病房（ICU），3株（15.8%）來自燒傷科病房，2株（10.3%）來自普外一科病區(qū)，1株（5.3%）來自泌尿外科病房，3株（15.8%）來自兒科病房。

2.2 菌株標本來源分布

19株CRKP主要來源于患者痰液、導管尿、血液、傷口分泌物等標本，患者臨床信息見表2。

表2 19例CRKP感染患者臨床信息 Table 2 Clinical data of 19 patients with carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection

2.3 藥敏試驗結(jié)果

共收集611株肺炎克雷伯菌，對常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果見表3。其中19株CRKP為多耐藥或泛耐藥菌株[10]。19株CRKP對哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦耐藥率接近100%，對頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢噻肟、亞胺培南耐藥率為100%，對頭孢吡肟、頭孢西丁耐藥率≥90%，對甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率為84.21%，對氨基糖苷類耐率高達52%～80%，對氟喹諾酮類耐藥率接近60%。19株CRKP對替加環(huán)素、多黏菌素敏感率分別高達70%、100%。

表3 611株臨床分離肺炎克雷伯菌株對常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果Table 3 Susceptibility of 611 clinically isolates of Klebsiella pneumoniae to commonly used antibacterial agents（%）

2.4 碳青霉烯酶表型和基因檢測結(jié)果

9株CRKP通過碳青霉烯酶表型篩選試驗檢測結(jié)果顯示為陽性（美羅培南抑菌圈直徑＜25 mm），陽性率為47.4%（9/19），且9株均產(chǎn)A類碳青霉烯酶，未檢出B類金屬酶。PCR結(jié)果顯示19株CRKP均檢 出blaSHV，其 中blaSHV-11型8株、blaSHV-12型11株；10株blaCTX-M型 陽 性 中，blaCTX-M-9型4株、blaCTX-M-1型6株。頭孢菌素類耐藥基因僅檢出blaDHA-1型，共8株。9株CRKP檢出blaKPC-2，檢出率為47.4%（9/19）。6株膜孔蛋 白Ompk35基 因 缺 失，14株Ompk36基 因缺失。對耐藥基因抽取部分陽性結(jié)果進行測序，結(jié)果均為目標基因。未檢出blaNDM、blaIMP、blaGES、blaVIM、blaOXA-48、blaCTX-M-8、blaMOX、blaCIT、blaACC、blaEBC、blaFOX。見表4。

表4 19株CRKP基因型及分子分型Table 4 Beta-lactamase genotypes and molecular typing of 19 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains

2.5 PFGE結(jié)果

19株CRKP經(jīng)PFGE均成功分型，分為A～O 15種不同的克隆型，根據(jù)聚類分析，優(yōu)勢條帶型為同一克隆型的5株（菌株編號1、3、4、5、18號），其余的14株分別為14種不同的克隆型（A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L、M、N、O型）。見圖1。

圖 1 19株CRKP菌株的PFGE分析Figure 1 Pulsed-field gel electrophoresis analysis of 19 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains

3 討論

2018年CHINET監(jiān)測報告數(shù)據(jù)顯示，CRKP檢出率呈逐年上升趨勢，全國平均水平為10.1%，各地區(qū)間差異顯著[11]，甘肅省人民醫(yī)院檢出率為3.1%，低于全國平均水平。研究數(shù)據(jù)顯示該院CRKP菌株大部分分離自成人ICU患者的痰液標本，患者基礎(chǔ)疾病多、病情嚴重、免疫力低下，較易感染耐藥菌株。該院作為甘肅地區(qū)CHINET和全國細菌耐藥監(jiān)測的牽頭醫(yī)院，而ICU是CRKP的重點監(jiān)測部門，患者住院時間長、醫(yī)療操作和機械通氣頻繁、長期使用抗菌藥物均是導致CRKP檢出率高的危險因素[12]。這一結(jié)果提示該院應(yīng)加強對于ICU分離CRKP菌株的嚴密監(jiān)測。

該院檢出的CRKP菌株標本來源以痰標本（57.9%）最多，以呼吸機相關(guān)性肺炎（VAP）最為常見。通常情況下，人的呼吸道有正常菌群定植，當長期使用抗菌藥物使菌群失調(diào)、呼吸道黏膜屏障受到損害，才會導致細菌入侵。有文獻報道提示，患者接受氣道有創(chuàng)操作（氣管插管、氣管切開）及使用消毒不徹底的呼吸機，也是感染和傳播CRKP的危險因素[13]。需加強VAP預(yù)防呼吸機相關(guān)性肺炎的集束化策略實施及對機械通氣患者呼吸道病原學監(jiān)測，有助于CRKP的盡早檢出和及時治療。

本研究結(jié)果顯示，該院檢出的CRKP菌株進行體外藥敏試驗結(jié)果對常用的抗菌藥物耐藥率均高達50%以上，導致部分患者治療方案受到限制，給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。因此醫(yī)院應(yīng)大力規(guī)范抗菌藥物的使用、積極做好接觸隔離、采取有效可行的預(yù)防措施。有文獻報道多學科協(xié)作在CRKP醫(yī)院感染防控中起著重要作用，以醫(yī)院感染管理科為中心聯(lián)合多部門積極控制可取得良好效果（多學科協(xié)作）[14]。

目前臨床用藥多根據(jù)藥敏結(jié)果選擇可用的抗生素，該院CRKP對第一、二、三代頭孢菌素及其酶抑制劑、碳青霉烯類耐藥率接近100%，考慮與該院臨床科室預(yù)防性使用第三、四代頭孢菌素及其β內(nèi)酰胺酶抑制劑這類廣譜抗菌藥物有關(guān)，由此可見臨床在治療CRKP感染患者時抗菌藥物的選擇十分有限。體外藥敏試驗顯示19株CRKP菌株對替加環(huán)素、多黏菌素具有良好的敏感性，這對于該院臨床治療具有良好的指導意義。替加環(huán)素作為新一代的甘酰胺類藥物，因其體外藥敏結(jié)果顯示對肺炎克雷伯菌具有優(yōu)良的抗菌活性，可推薦用于泛耐藥或多耐藥肺炎克雷伯菌的治療[15]，且聯(lián)合治療方案效果優(yōu)于單一藥物治療方案[15-16]。當碳青霉烯類耐藥，聯(lián)合碳青霉烯類抗菌藥物并不能取得良好的效果，可考慮使用多黏菌素、或美羅培南-vaborbactam為基礎(chǔ)的聯(lián)合藥物治療[17-19]，但其在血液和尿液中無法達到高濃度，一定程度上限制了其使用。有文獻報道多黏菌素毒性作用及近年來多黏菌素耐藥菌株出現(xiàn)帶來的問題[20]。提示在選用這兩種藥物進行治療時，應(yīng)警惕臨床難治性感染。

大量研究表明CRKP耐藥機制復(fù)雜[21]，主要包括：①產(chǎn)碳青霉烯酶；②高產(chǎn)ESBL或AmpC酶合并外膜蛋白缺失；③外排泵表達上調(diào)；④作用靶位改變、細菌生物被膜形成等。我國腸桿菌科細菌產(chǎn)碳青霉烯酶的常見基因類型為KPC-2[22]。本研究中9株經(jīng)碳青霉烯酶表型篩選試驗陽性菌株，PCR結(jié)果顯示均攜帶KPC-2基因，符合我國國內(nèi)形勢。另外10株CRKP未檢出產(chǎn)碳青霉烯酶，而ESBL基因檢出率100%、AmpC酶基因檢出率80%，同時合并膜孔蛋白Ompk36和/或Ompk35基因的缺失，因此這些菌株的耐藥機制為高產(chǎn)ESBL或AmpC酶合并外膜蛋白缺失[23-24]。PFGE分析結(jié)果顯示19株CRKP可以分為多種克隆型，其中5株確定為同一克隆型且都在集中于ICU（2019年7—8月），醫(yī)院感染暴發(fā)定義為在醫(yī)療機構(gòu)或其科室的患者中，短時間內(nèi)發(fā)生3例以上同種同源感染病例[25]，因此提示該病區(qū)存在醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，制定針對性的防控措施、規(guī)范抗菌藥物的使用、做好重點病區(qū)的客觀環(huán)境衛(wèi)生的清潔消毒、落實感染預(yù)防控制及感染患者隔離措施、強化臨床醫(yī)務(wù)工作者院感防控意識及普及操作規(guī)范流程必不可少。

綜上所述，西部該三甲醫(yī)院CRKP對多種抗菌藥物耐藥率均較高，為臨床工作帶來嚴峻挑戰(zhàn)，重點加強CRKP的監(jiān)測和院感控制刻不容緩。