金 逸，胡盈盈，郁繼誠，陳淵成，戴靜怡，王晶晶，張 菁，武曉捷，程潔如，丁玲玲，劉曉雪，龔玉秀

頭孢氨芐為第一代頭孢菌素類口服抗生素，于20世紀(jì)60年代應(yīng)用于臨床，為目前使用最廣、最多的一類抗生素。其抗菌譜與頭孢噻吩相仿，但其抗菌活性較后者為差。除腸球菌屬和甲氧西林耐藥葡萄球菌外，肺炎鏈球菌、溶血鏈球菌、產(chǎn)或不產(chǎn)青霉素酶葡萄球菌的大部分菌株對頭孢氨芐敏感。頭孢氨芐對奈瑟菌屬有較好抗菌作用，但對流感嗜血桿菌的作用較差，對部分大腸埃希菌、奇異變形桿菌、沙門菌和志賀菌有一定抗菌作用。其他腸桿菌科細(xì)菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌、脆弱擬桿菌對頭孢氨芐均耐藥，梭桿菌屬和韋榮球菌一般敏感，厭氧革蘭陽性球菌中度敏感。因其臨床廣泛應(yīng)用，上海新亞藥業(yè)閔行有限公司研發(fā)了國產(chǎn)頭孢氨芐膠囊，并研究比較國產(chǎn)頭孢氨芐膠囊（受試制劑）和原研產(chǎn)品武田藥品工業(yè)株式會社生產(chǎn)的頭孢氨芐膠囊（商品名為Sencephalin?）（參比制劑）的生物等效性，遵循我國《以藥動學(xué)參數(shù)為終點評價指標(biāo)的化學(xué)藥物仿制藥人體生物等效性研究指導(dǎo)原則》[1]及《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范（2020年版）》[2]，于2018年9月在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院Ⅰ期臨床研究中心開展生物等效性臨床試驗。由于藥動學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）研究可以探討量效關(guān)系和時效關(guān)系，使感染病灶維持有效的藥物濃度，保證藥物起效且不產(chǎn)生毒性作用和不良反應(yīng)，實現(xiàn)給藥方案優(yōu)化。因此，本文還同時基于PK數(shù)據(jù)開展PK/PD研究，評價說明書所載給藥方案及其優(yōu)化策略，為該藥臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究設(shè)計

本研究采用單中心、隨機(jī)、開放、單劑量、兩周期、兩交叉、空腹或餐后給藥試驗設(shè)計。入選研究的受試者按照1∶1的比例隨機(jī)進(jìn)入（空腹與餐后）2個試驗組，每組受試者分別按照方案規(guī)定先后給予受試制劑-參比制劑、參比制劑-受試制劑，兩周期自身交叉，空腹給藥或高脂餐后給藥，并按設(shè)計的時間點采集血樣，兩周期間清洗期為7 d。本臨床試驗獲得了復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。藥品審評中心備案號為B201800242-02。

1.2 受試者

所有入組受試者均簽署知情同意書。受試者無臨床嚴(yán)重疾病史或循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、精神疾病及代謝異常等病史，無消化不良、胃炎、食管炎、十二指腸潰瘍或胃潰瘍等胃腸道疾病史以及胃腸道手術(shù)史，無對頭孢菌素類藥物及輔料（玉米淀粉、乳糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、明膠空心膠囊）中任何成份過敏者、無青霉素過敏史者，無過敏體質(zhì)，無食物、藥物過敏史者。人類免疫缺陷病毒抗體、丙型肝炎抗體、乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒檢查結(jié)果陰性，體格檢查、實驗室檢查（血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血檢查、血液生化檢查、血妊娠）正常或異常無臨床意義，且內(nèi)生肌酐清除率＜90 mL/min，心電圖及生命體征正常，篩選前兩周內(nèi)未服用過任何藥品（包括非處方藥、中草藥及維生素），酒精呼吸檢查和煙檢陰性，試驗期間統(tǒng)一飲食，禁止吸煙、飲酒、攝入飲料，禁止劇烈運動。

1.3 試驗用藥品和給藥方式

受試制劑頭孢氨芐膠囊，規(guī)格：0.125g/粒，有效期：2019年11月，批號：9400101，上海新亞藥業(yè)閔行有限公司生產(chǎn)。參比制劑頭孢氨芐膠囊，規(guī)格：0.125 g/粒，有效期：2020年4月，批號：HJ1014，武田藥品工業(yè)株式會社生產(chǎn)。

共入組56名受試者，每周期服藥前禁食至少10 h?？崭菇M中受試制劑組受試者于服藥當(dāng)天早上8點左右按照隨機(jī)表單劑量口服受試制劑1粒（0.125 g），用240 mL溫水送服；參比制劑組受試者單劑量口服參比制劑1粒（0.125 g），用240 mL溫水送服。餐后組中受試者于服藥當(dāng)天早上07:30左右進(jìn)食高脂餐（高脂：脂肪在提供的食物中約占50%的熱量；高熱：約3348.8～4186.0 kJ飲食。其中蛋白質(zhì)約提供627.9 kJ熱量，碳水化合物約提供1046.5 kJ熱量，脂肪約提供2093.0～2511.6 kJ熱量），開始用餐30 min后單劑量口服受試制劑1粒（0.125 g），用240 mL溫水送服；參比制劑組受試者口服參比制劑1粒（0.125 g），用240 mL溫水送服。服藥前1 h及服藥后2 h內(nèi)禁止飲水，此后2 h內(nèi)可以飲水量≤100 mL，之后每2 h可以飲水量≤200 mL，直至采血結(jié)束，10 h內(nèi)飲水量≤900 mL。服藥4 h后進(jìn)食午餐（統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飲食）。第一周期受試者服用受試制劑或參比制劑，則第二周期服用參比制劑或受試制劑，流程與第一周期相同。

1.4 血樣采集及處理

給藥前在受試者前臂靜脈埋置留置針頭，每周期于給藥前0 h（給藥前3 h內(nèi)，視為0 h）和給藥 后10 min、20 min、35 min、45 min、1 h、1 h 20 min、1 h 40 min、2 h、2 h 30 min、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h和10 h共16個時間點采集靜脈血4 mL置于預(yù)冷且已標(biāo)記好的含EDTA-K2抗凝劑真空采血管中，輕柔顛倒混勻，采集后即刻置于冰浴中，采血后30 min內(nèi)于2～8℃、約1 850×g條件下離心10 min，分離出血漿，0.8 mL分裝于檢測管中，剩余量分裝于備份管，存入－60℃以下低溫冰箱中，直至樣本轉(zhuǎn)運至生物樣本檢測單位。從血樣采集到血漿樣品放置到冰箱的過程不能超過1 h，均為黃光燈冰浴下操作。

1.5 測定方法

血漿藥物濃度測定采用液質(zhì)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。

1.5.1 測定條件 色譜柱：SHIMADZU, Shimpack GISS-HPC18（2.1×50 mm）；流動相A：含0.1%甲酸（FA）的水溶液，流動相B：含0.1%FA的100%甲醇溶液。柱溫40℃；流速：0.4 mL/min，自動進(jìn)樣器溫度設(shè)置為4℃，進(jìn)樣量2 μL。頭孢氨芐離子對：m/z 348.15→m/z 174.20，內(nèi)標(biāo)離子對：m/z 353.10→m/z 179.10。

1.5.2 血漿樣本前處理 樣品在濕冰和黃光燈下融化后，渦旋混勻。吸取50 μL樣品至96孔板中，對于雙空白樣品或QC樣品，加入50 μL空白基質(zhì)。加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，對于雙空白樣品加入50 μL 0.1% FA的50%甲醇溶液。加入100 μL的10%三氯乙酸的50%甲醇溶液，然后渦旋約10 min，在約4℃條件下2 000×g離心10 min。轉(zhuǎn)移20 μL上清溶液至已加入280 μL 0.1% FA的50%甲醇溶液的96孔板中，渦旋5 min，待進(jìn)樣。

1.6 方法學(xué)驗證

標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度水平分別為：20.0、40.0、160.0、640.0、1 600.0、6 400.0、8 000.0和10 000.0 μg/L。檢測得到頭孢氨芐峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比和濃度線性回歸方程為：y=0.764302x-0.000683，R2＞0.985。線性范圍20.0～10 000.0 μg/L，定量下限為20.0 μg/L。在測定條件下，待測物頭孢氨芐和內(nèi)標(biāo)保留時間均約為0.2 min，頭孢氨芐和內(nèi)標(biāo)保留處峰面積未見明顯干擾，未見明顯殘留。精密度和準(zhǔn)確度采用3個分析批5個濃度水平[極低濃度、低濃度、中濃度（幾何均值）、中濃度和高濃度]（LLOQC、LQC、GMQC、MQC、HQC）的質(zhì)控樣品，每個濃度水平6個平行。批內(nèi)相對誤差百分率平均在－2.6～3.3，變異系數(shù)在1.5～6.4。批間相對誤差百分率平均在－1.2～1.9，變異系數(shù)在2.8～5.8。HQC、MQC、LQC血漿質(zhì)控樣品的提取回收率分別為97.0%、94.5%、94.0%，變異系數(shù)為1.7。內(nèi)標(biāo)平均提取回收率約為101.5%，變異系數(shù)為2.7。低、高濃度下，LQC、HQC濃度質(zhì)控內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子變異系數(shù)分別為2.0、1.0。脂血、溶血基質(zhì)對待測物和內(nèi)標(biāo)測定無顯著影響。待測物儲備液和工作溶液在－20℃條件下24 d穩(wěn)定，在濕冰黃光條件下分別為26、25 h穩(wěn)定；全血在濕冰條件下，黃光燈或日光燈條件下均2 h穩(wěn)定；血漿基質(zhì)樣品室溫黃光燈與濕冰日光燈條件下，均2 h穩(wěn)定，濕冰黃光燈下21 h穩(wěn)定，－20℃條件下40 h穩(wěn)定，－60℃條件下62 d穩(wěn)定；處理后樣品在4℃條件下42 h穩(wěn)定；血漿基質(zhì)樣品在－60℃條件下4次反復(fù)凍融后穩(wěn)定。

1.7 PK參數(shù)計算及生物等效性判定

采用Phoenix WinNonlin軟件（版本8.1，美國Pharsight公司）根據(jù)實際的采血時間點進(jìn)行非房室模型PK參數(shù)計算。對主要PK參數(shù)（Cmax、AUC0-t、AUC0-∞）進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析，對Tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗。以方差分析結(jié)果為基礎(chǔ)，采用90%置信區(qū)間分析法，當(dāng)受試制劑與參比制劑PK參數(shù)AUC0-t、AUC0-∞和Cmax的幾何均值比的90%置信區(qū)間均在80.00%～125.00%等效區(qū)間內(nèi)，則認(rèn)為兩制劑生物等效。

1.8 PK/PD分析

1.8.1 PK/PD指數(shù)計算 對頭孢氨芐個體PK數(shù)據(jù)建立房室模型，模型結(jié)構(gòu)包括一室模型或二室模型，吸收分為延遲或無延遲，權(quán)重從1、1/C或1/C2中選取。藥品說明書所載的給藥方案為：250～500 mg、1次/6 h，高劑量4 g/d，本研究針對說明書中給藥方案開展PK/PD研究?；趥€體房室模型PK參數(shù)模擬頭孢氨芐多次給藥的PK特征，并計算頭孢氨芐多次給藥達(dá)穩(wěn)態(tài)時濃度高于MIC時間占給藥間隔的百分比（%T＞MIC），公式為（t2-t1）/τ×100%，其中t1和t2分別為MIC與藥時曲線相交的左邊時間點和右邊時間點。MIC為最低抑菌濃度，取值0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 mg/L。采用Matlab軟件（R2014a, 美國Mathworks公司）開展本部分工作。

1.8.2 蒙特卡洛模擬 根據(jù)文獻(xiàn)報道[2]，①設(shè)頭孢氨芐%T＞MIC靶值為40%；②計算MIC取特定數(shù)值時頭孢氨芐空腹給藥%T＞MIC達(dá)到靶值的概率（PTA）： 各房室模型參數(shù)按對數(shù)正態(tài)分布產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)（2 000個），采用Matlab軟件計算%T＞MIC并統(tǒng)計超過該靶值個數(shù)占總體的百分比。

1.9 結(jié)果表示和統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS軟件22.0版（美國IBM公司）開展統(tǒng)計學(xué)檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者情況

空腹組28名受試者和餐后組28名受試者全部完成試驗。空腹組平均年齡（28.7±5.3）歲，平均體重（61.16±6.47） kg，平均體重指數(shù)（22.46±1.85）kg/m2。餐后組平均年齡（28.7±6.1）歲，平均體重（61.40±7.94） kg，平均體重指數(shù)（22.17±1.93） kg/m2。

2.2 頭孢氨芐PK

頭孢氨芐膠囊空腹組受試者血藥濃度結(jié)果見圖1，餐后組試驗受試者血藥濃度結(jié)果見圖2。無論空腹或餐后給藥，服用受試制劑和參比制劑后藥時曲線均相似。

圖1 28名受試者空腹口服頭孢氨芐后平均血藥濃度-時間曲線Figure 1 The mean concentration - time curves after oral administration of cefalexin under fasted condition in 28 healthy subjects

圖2 28名受試者餐后口服頭孢氨芐后平均血藥濃度-時間曲線Figure 2 The mean concentration - time curves after oral administration of cefalexin under fed condition in healthy subjects

空腹和餐后口服頭孢氨芐受試制劑和參比制劑后主要PK參數(shù)見表1?？崭菇M參比制劑和受試制劑給藥后吸收迅速，于給藥后0.73 h（中位數(shù)）達(dá)峰，兩制劑Cmax和AUC相近，消除半衰期均較短，約為1.3 h。

表1 空腹或高脂餐后口服頭孢氨芐膠囊受試制劑和參比制劑主要藥動學(xué)參數(shù) Table 1 Pharmacokinetic parameters of cefalexin capsules and reference preparation after oral administration under fasting or high-fat diet condition

進(jìn)高脂餐后口服頭孢氨芐較空腹給藥，受試制劑和參比制劑吸收均延遲，達(dá)峰時間約為2.50 h，Cmax均降低至一半左右，但AUC與空腹組相似。

頭孢氨芐空腹給藥時的PK符合吸收有延遲的二房室模型。對于受試制劑，頭孢氨芐吸收速率（ka）和吸收延遲時間（Tlag）分別為（3.05±1.09）L/h和（0.27±0.03） h，中央室清除率（CL）和中央室-外周室之間清除率（Q）分別為（14.23±1.92） L/h和（9.55±5.43） L/h，中央室和外周室分布容積分別為（8.71±2.59）L和（7.65±2.15）L。

2.3 生物等效性評價

空腹口服受試制劑和參比制劑后，主要PK參數(shù)Cmax、AUC0-∞、AUC0-t幾何均值比（受試制劑/參比制劑）分別為106.91%、101.22%、101.16%，90%置 信 區(qū) 間 分 別 為101.45%～112.66%、99.14%～103.34%、99.07%～103.29%；經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗，Tmax差異無統(tǒng)計學(xué)意義。高脂餐后服用受試制劑和參比制劑后，主要PK參數(shù)Cmax、AUC0-∞、AUC0-t的 幾 何 均 值 比 分 別 為102.29%、102.08%、101.83%，90%置信區(qū)間分 別 為94.41%～110.84%、100.24%～103.95%、99.86%～103.84%；經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗，Tmax差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？崭够虿秃罂诜茉囍苿┖蛥⒈戎苿┖?，Cmax、AUC0-∞、AUC0-t的幾何均值比值（受試制劑/參比制劑）90%置信區(qū)間均落在80.00%～125.00%范圍內(nèi)，因此兩制劑生物等效。

2.4 安全性評價

空腹?fàn)顟B(tài)下服用受試制劑的28例受試者共發(fā)生6例（6/28，21.4%）9例次的不良事件，服用參比制劑的28例受試者共發(fā)生7例（7/28，25.0%）12例次的不良事件。餐后狀態(tài)下服用受試制劑的28例受試者共發(fā)生9例（9/28，32.1%）16例次的不良事件，服用參比制劑的28例受試者共發(fā)生4例（4/28，14.3%）9例次的不良事件?？崭菇M與餐后組所有不良事件均為1級（輕度），呈一過性，自行恢復(fù)，均與研究藥物無關(guān)。受試制劑和參比制劑單劑給藥后安全性好。

2.5 PK/PD分析

多劑空腹給予頭孢氨芐達(dá)穩(wěn)態(tài)時%T＞MIC見圖3。MIC=0.5 mg/L時，125、250、500和1 000 mg（均為1次/6 h）給藥方案%T＞MIC均值分別為60%、79%、96%和100%；MIC=1 mg/L時，四種給藥方案%T＞MIC分別為41%、60%、79%和96%。

圖3 多劑空腹給予頭孢氨芐受試制劑達(dá)穩(wěn)態(tài)時的%T＞MICFigure 3 The %T＞MIC of cefalexin （test preparation） at steady state following multiple oral doses under fasted condition

多劑空腹口服頭孢氨芐不同劑量250、500、1 000 mg 1次/6 h達(dá) 穩(wěn) 態(tài) 時%T＞MIC的PTA見圖4。隨著頭孢氨芐劑量增加，PTA出現(xiàn)不同程度增加。當(dāng)對致病菌MIC≤0.5 mg/L時，250 mg（1次/6 h）的給藥方案PTA超過90%。當(dāng)對致病菌MIC≤1 mg/L時，500 mg（1次/6 h）給 藥 方案PTA超過90%。當(dāng)對致病菌MIC≤2 mg/L時，1 000 mg （1次/6 h）給藥方案PTA超過90%。因此當(dāng)PTA≥90%時，對致病菌三種給藥方案可覆蓋MIC值分別為0.5、1和2 mg/L。

圖4 多劑空腹口服頭孢氨芐達(dá)穩(wěn)態(tài)時%T＞MIC的達(dá)標(biāo)概率Figure 4 Probablity of target attainment of %T＞MIC at steady state following multiple oral doses of cefalexin （test preparation） under fasted condition

3 討論

臨床試驗中關(guān)于樣本操作要求全程避光，故從采血至樣本存入冰箱均使用黃光燈。但據(jù)文獻(xiàn)報道[3]，頭孢氨芐光照10 d試驗，各項指標(biāo)無顯著變化，都在合格范圍內(nèi)，表明頭孢氨芐對光較為穩(wěn)定。因此，后續(xù)的頭孢氨芐研究中無須采取避光措施。

本研究結(jié)果顯示，空腹給藥頭孢氨芐吸收較快，血藥濃度在2 h內(nèi)可達(dá)最高值。鑒于空腹和餐后達(dá)峰時間不同，空腹時在體內(nèi)達(dá)峰時間短而進(jìn)餐后則延遲，因此本研究兼顧兩者進(jìn)行了采血時間設(shè)置，在1 h前增加采血點，在2 h后也增加了2.5 h、3 h，使結(jié)果更易分析和評估。

從血藥濃度-時間曲線圖可以明顯看出進(jìn)餐對頭孢氨芐PK存在影響：吸收速率明顯下降。空腹口服頭孢氨芐，吸收速率較快且達(dá)峰時間短；餐后口服頭孢氨芐，吸收速率較慢且達(dá)峰時間延長。

按劑量校正后，本試驗所得頭孢氨芐Cmax和AUC與文獻(xiàn)[4]接近，包括空腹和餐后。此外，本研究所得Cmax還與文獻(xiàn)[5]接近，但AUC低于文獻(xiàn)[5]報道結(jié)果。

PK/PD研究顯示，頭孢氨芐250、500、1 000 mg（1次/6 h）給藥方案，對于MIC≤0.5、1、2 mg/L致病菌引起的感染，%T＞MIC達(dá)標(biāo)概率高于90%。因此臨床應(yīng)用頭孢氨芐治療時，可根據(jù)藥敏結(jié)果采用不同的給藥方案，實現(xiàn)個體化給藥策略。本試驗餐后組進(jìn)食高脂餐，不是普通餐，因而該組PK研究結(jié)果不能代表進(jìn)普通餐后頭孢氨芐PK，因而未開展餐后組PK/PD分析。

頭孢氨芐受試制劑和參比制劑吸收速度/程度以及消除均接近，PK具有生物等效性。對于MIC≤0.5 mg/L細(xì)菌引起的感染，采用頭孢氨芐250～500 mg 1次/6 h治療方案可預(yù)期取得較好微生物學(xué)療效。