王艷煒，李 霞，耿 彬，張鐵軍，苗華為

高血壓發(fā)病機制復(fù)雜，病因多樣，其中基因與環(huán)境為主要致病因素，而高鹽攝入是引起高血壓的一個重要環(huán)境因素[1]。長期處于高鹽環(huán)境可造成內(nèi)皮功能障礙、一氧化氮(NO)的合成減少，而NO是機體抗高血壓的重要保護因子。內(nèi)皮細(xì)胞是合成NO的主要場所，一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase，NOS)是唯一限速酶，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)在催化NO產(chǎn)生方面具有重要作用[2-3]，但關(guān)于其在高鹽所致的高血壓中報道較少。研究顯示，NO在原發(fā)性高血壓的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，具有降壓、抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用[4]。而平滑肌細(xì)胞在高鹽所致高血壓中的作用尚不明確，激活鉀通道廣泛分布于血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)上，與平滑肌細(xì)胞功能關(guān)系密切，但關(guān)于電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流變化的報道較少，大電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channel，BKCa)是電導(dǎo)最大的鈣激活鉀通道[5-6]。因此，觀察BKCa電流變化可反映血管平滑肌細(xì)胞在高鹽所致高血壓中的作用。本研究通過構(gòu)建動物模型，探討長期高鹽所致高血壓大鼠主動脈eNOS蛋白表達及主動脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa電流的變化。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級3周齡Wistar雄性大鼠60只，體重50～70 g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。將60只大鼠隨機分為模型組和對照組，每組30只，對照組予以含0.5%NaCl的嚙齒類飼料喂養(yǎng)，模型組予以含5%NaCl的嚙齒類飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，飲用水為自來水。分別于0周、4周、8周、12周、16周，采用動脈測壓儀測量大鼠處于安靜狀態(tài)鼠尾動脈壓，測量時間為08：00～14：00，每次測量6個數(shù)值的平均值為當(dāng)天收縮壓。16周后模型組收縮壓≥115 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，且比同時點對照組收縮壓均值≥20 mmHg，則判定為造模成功。本試驗中，模型組12周后收縮壓為(138.24±5.33)mmHg，對照組收縮壓為(108.12±4.18)mmHg，模型組高于對照組收縮壓均值20 mmHg以上，確認(rèn)造模成功。

1.2 主要實驗儀器 動物恒溫系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，無創(chuàng)血壓測量儀(BP-600A 型，成都泰盟科技)，倒置顯微鏡系統(tǒng)(XDS-1，重慶光電儀器有限公司)，膜片鉗放大器(Axo-patch 200B 型)，pCLAMP 9.0 軟件程序和DigiData 1200B 型數(shù)/模轉(zhuǎn)換器(Axon 公司，美國)，微電極拉制儀(PC-10型，玉研儀器公司)，電泳儀(DYCZ-24KS型，北京六一儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)。兔抗鼠微管蛋白β-tubulin抗體，兔抗鼠eNOS抗體、羊抗兔IgG抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記)、β-tubulin內(nèi)參均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、蛋白裂解緩沖液、硝酸纖維素膜(PVDF)及其余試劑均購自上海生物工程技術(shù)公司。

1.3 大鼠尾動脈無創(chuàng)性血壓測量 開啟無創(chuàng)血壓測量儀，開啟前預(yù)熱20 min左右，壓力信號定標(biāo)后將清醒大鼠裝入固定盒內(nèi)固定，然后放入固定架，固定完成后將加壓套插入大鼠尾根部，使鼠尾穿過脈搏傳感器插入尾部加熱管內(nèi)，并剛好處于“脈搏信號傳感片”上方，調(diào)節(jié)脈搏傳感器，使傳感片緊貼鼠尾下方的尾動脈，大鼠脈搏穩(wěn)定后，測量血壓。

1.4 主動脈eNOS蛋白表達水平的測定

1.4.1 主動脈采集 喂養(yǎng)16周結(jié)束后，大鼠禁食10 h，用3%戊巴比妥鈉0.15 mL/100 g麻醉大鼠，開胸取出胸主動脈，以4 ℃ PBS沖洗，剪去血管外脂肪組織、結(jié)締組織，濾紙吸干后置入液氮冷凝，置于-70 ℃保存待檢。

1.4.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測主動脈eNOS蛋白的表達水平 取大鼠主動脈組織，加入蛋白裂解緩沖液，充分研磨組織，取上清液，制備成蛋白樣品后，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進行分離，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶的PBS中封閉1 h，加入一抗(兔抗鼠微管蛋白β-tubulin抗體1∶1 000稀釋，兔抗鼠eNOS抗體1∶800稀釋)4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 1∶5 000稀釋)，孵育后，ECL法顯影。電泳條采用凝膠成像系統(tǒng)進行積分光密度值分析，以β-tubulin作為內(nèi)參矯正，以每次電泳對照組第一個樣品蛋白條帶的積分光密度值為1，蛋白質(zhì)表達的相對水平為其余樣品蛋白條與其的比值。

1.5 主動脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa電流記錄

1.5.1 實驗溶液配制 酶液Ⅰ：木瓜蛋白酶(1.75 g/L)、二硫蘇糖醇(1.75 g/L)、白蛋白(2.5 g/L)。酶液Ⅱ：膠原酶Ⅰ(2.5 g/L)、透明質(zhì)酸酶(2.5 g/L)、白蛋白(2.5 g/L)。溶液Ⅰ：NaCl(127 mmol/L)、MgCl2(1.2 mmol/L)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(10 mmol/L)、葡萄糖(12 mmol/L)、KCl(5.9 mmol/L)、 CaCl2(2.4 mmol/L)，NaOH調(diào)pH值至 7.4。溶液Ⅱ：溶液Ⅰ中不加入CaCl2制成。細(xì)胞外液：NaCl(150 mmol/L)、CaCl2(1.5 mmol/L)、MgCl2(1 mmol/L)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(10 mmol/L)、KCl(6 mmol/L)、葡萄糖(10 mmol/L)，NaOH 調(diào) pH 值至 7.4。電極內(nèi)液：Na2ATP(4mmol/L)、EGTA(0.1mmol/L)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(10 mmol/L)、KCl(40 mmol/L)、K2ASP(100 mmol/L)、MgCl2(1 mmol/L)，KOH 調(diào) pH 值至 7.2。

1.5.2 主動脈平滑肌細(xì)胞采集 兩組分別于0周、4周、8周、12周、16周各取大鼠6只麻醉處死后，取主動脈標(biāo)本，游離出血管中膜，剪開為長2～4 mm、寬2 mm 的條塊，分別加入木瓜蛋白酶(1.75 g/L)、二硫蘇糖醇(1.75 g/L)、白蛋白(2.5 g/L)的酶液Ⅰ和膠原酶Ⅰ(2.5 g/L)、透明質(zhì)酸酶(2.5 g/L)、白蛋白(2.5 g/L)的酶液Ⅱ，使用急性酶分離法獲取單個主動脈平滑肌細(xì)胞。

1.5.3 膜片鉗記錄全細(xì)胞 BKCa電流 從分離出的血管平滑肌細(xì)胞中選取條理清晰、梭性血管平滑肌細(xì)胞置于溶液Ⅱ中，細(xì)胞懸液加于灌流槽中，細(xì)胞貼壁后，采用1～2 mL/min 的電極外液灌流15～20 min，采用微電機拉制儀拉制電極，選取電極經(jīng)拉制拋光后電極電阻為4～7 MΩ的拉制電極，微電極使用前充灌內(nèi)液，持續(xù)均勻負(fù)壓破膜，封接電阻>1 GΩ，完全連通細(xì)胞外液和電極內(nèi)液，形成全細(xì)胞模式，pCLAMP 9.0 軟件對單個全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)和圖形進行轉(zhuǎn)換，繪制電流密度-電壓曲線，并記錄膜電容，計算電流密度(電流強度/膜電容)。電壓鉗模式設(shè)置鉗制電位-60 mV，濾波 5 kHz，除極化至-65 mV，記錄細(xì)胞膜電容(Cm)。使用放大鏡進行信號采集，刺激頻率 2 Hz，采集頻率5 kHz，鉗制電位維持于-60 mV，予以去極化方波刺激，頻率0.2 Hz，維持時間 400 ms，從 HP -50 mV 逐步去極化至70 mV，繼發(fā)外向假電流，電流穩(wěn)定后，記錄電流強度。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠收縮壓變化比較 重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，時點效應(yīng)可以明顯影響大鼠收縮壓的變化(P<0.01)，且鹽分?jǐn)z入可以明顯影響大鼠收縮壓(P<0.01)；時點和鹽分?jǐn)z入之間存在著明顯交互效應(yīng)(P<0.01)，提示大鼠收縮壓隨著時點的變化趨勢會因為鹽分?jǐn)z入的不同而不同。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠8周時收縮壓開始升高，且模型組大鼠8周、12周、16周收縮壓較同時點對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖1。

單位：mmHg

圖1 高鹽飲食對大鼠血壓影響的趨勢圖

2.2 兩組大鼠主動脈eNOS蛋白表達水平比較 模型組eNOS蛋白表達水平為0.62±0.13，明顯低于對照組的1.18±0.18，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 兩組大鼠主動脈組織eNOS蛋白表達條帶圖

與對照組比較，＊P<0.05。

2.3 兩組大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞BKCa電流密度變化比較 重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，時點效應(yīng)可以明顯影響B(tài)KCa電流密度的變化(P<0.01)，且鹽分?jǐn)z入可以明顯影響B(tài)KCa電流密度(P<0.01)，時點和鹽分?jǐn)z入之間存在著明顯交互效應(yīng)(P<0.01)，提示BKCa電流密度隨著時點的變化趨勢會因為鹽分?jǐn)z入的不同而不同。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠8周時BKCa電流密度開始升高，且模型組大鼠8周、12周、16周BKCa電流密度較同時期對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖4。

單位：pA/pF

圖4 高鹽飲食對大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞BKCa電流密度影響的趨勢圖

2.4 16周時eNOS蛋白表達、收縮壓、BKCa電流密度相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，eNOS蛋白表達與收縮壓、BKCa電流密度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.755，P<0.05；r=-0.863，P<0.05)，電流密度與收縮壓呈正相關(guān)(r=0.972，P<0.05)。詳見圖5～圖7。

圖5 eNOS蛋白表達與收縮壓的相關(guān)性

圖6 eNOS蛋白表達與電流密度的相關(guān)性

圖7 BKCa電流密度與收縮壓的相關(guān)性

3 討 論

在我國高血壓患病率較高，約為20%，而在全世界范圍內(nèi)患病率可達30%，已成為威脅人類健康的重要疾病，因此，控制高血壓是改善社會公共衛(wèi)生問題，防治心血管疾病的關(guān)鍵[7]。有研究顯示，高血壓病人中50%～60%為鹽敏感者，較血壓正常者高出20%～30%[8]。目前認(rèn)為鹽敏感性高血壓由遺傳、內(nèi)皮功能障礙、RAAS等多種機制共同作用的結(jié)果[9]。本研究以含5%NaCl的高鹽飼料和含0.5% NaCl的常規(guī)飼料喂養(yǎng)大鼠16周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠8周時收縮壓開始升高，且高鹽喂養(yǎng)的模型組大鼠自第8周起收縮壓較同時期對照組升高明顯，結(jié)果與文獻[10]報道結(jié)果一致。

一般說來，血管舒張和血管收縮功能平衡是維持機體血壓正常的關(guān)鍵，當(dāng)這種平衡遭到破壞時則會發(fā)生高血壓或低血壓，如當(dāng)血管舒張功能降低時，發(fā)生高血壓風(fēng)險明顯增高[11]。NO具有舒緩平滑肌的作用，在高血壓發(fā)生、發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。一氧化氮合酶包括腦型一氧化氮合酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶以及eNOS。目前eNOS活性變化是反映血管內(nèi)皮功能的公認(rèn)指標(biāo)。本研究中模型組eNOS蛋白表達水平明顯低于對照組，說明eNOS蛋白低表達，可能為鹽敏感高血壓的誘導(dǎo)因素之一。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，高鹽所致高血壓大鼠eNOS蛋白及其mRNA表達水平降低，可能參與了降壓機制[13]。因此，模型組eNOS蛋白低表達的可能原因為大鼠長期攝入高鹽后，RAAS機制激活，腸系膜動脈組織醛固酮合酶基因高表達，血管內(nèi)皮組織長期處于高醛固酮環(huán)境，內(nèi)皮組織發(fā)生損傷，由內(nèi)皮細(xì)胞生成的eNOS釋放量降低，NO合成量下降，平滑肌舒緩不足，收縮功能占上風(fēng)，平衡遭到破壞，血壓升高[14-15]。

血管平滑肌細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)血管收縮功能而影響血壓[16]。有學(xué)者認(rèn)為，高鹽飲食可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+水平升高，而 Na+和Ca2+可通過細(xì)胞膜交換體進行交換，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量升高，從而引起血管平滑肌收縮、血壓升高[17-18]。BKCa通道在各種平滑肌細(xì)胞中普遍存在，可調(diào)節(jié)膜電壓和鈣離子內(nèi)流，限制去極化和抵抗血管收縮[19]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高時，BKCa通道被持續(xù)激活，導(dǎo)致超極化，并作為超極化因素抑制電壓依賴鈣通道的開放，減少鈣離子內(nèi)流，以此使血管擴張，對抗血管收縮。既往研究表明，BKCa是電壓依賴性鈣敏感鉀通道，對維持靜息狀態(tài)下血管張力具有重要作用[20]。本研究中兩組大鼠8周時BKCa電流密度開始升高，且模型組大鼠8周、12周、16周BKCa電流密度較同時期對照組明顯升高，說明BKCa電流密度隨著高鹽喂養(yǎng)時間的延長而增大，隨著血壓的升高而增加。究其原因是高鹽可導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，刺激BKCa通道開放，有研究認(rèn)為，BKCa通道在鹽敏感高血壓模型中為反饋性調(diào)節(jié)因素，血壓升高可刺激其大量開放[17，21-22]。此外，本研究中Pearson相關(guān)性分析顯示，eNOS蛋白表達與收縮壓、BKCa電流密度呈負(fù)相關(guān)，BKCa電流密度與收縮壓呈正相關(guān)。而目前關(guān)于高血壓血管平滑肌 BKCa電流密度的研究也大多認(rèn)為BKCa電流密度增加是機體為對抗血壓升高而產(chǎn)生的保護性機制[23-24]。

綜上所述，長期高鹽所致高血壓大鼠主動脈eNOS蛋白低表達，主動脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa電流密度增大，且主動脈eNOS蛋白低表達可能為導(dǎo)致主動脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa電流密度增大重要原因。本研究不足在于研究中心較為單一，而BKCa電流變化受多種因素影響，仍有待進一步研究。