侯志濤 宋曉晨 宋麗穎

摘要 目的：基于網(wǎng)絡藥理學分析預測強心膠囊治療慢性心力衰竭的作用機制。方法：應用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）篩選出強心膠囊所含有效成分和相關靶標蛋白。根據(jù)藥代動力學ADME參數(shù)，以口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，生物半衰期（HL）≥4.00為條件篩選出活性成分。從數(shù)據(jù)庫Uniprot中獲得預測的活性成分作用靶點。通過CTD、TTD、DrugBanK數(shù)據(jù)庫挖掘疾病相關的作用靶點。通過基因注釋工具Matescape分析強心膠囊干預慢性心力衰竭的分子機制。結果：獲得強心膠囊活性成分108個，作用靶點267個，疾病相關靶點32 730個，最終獲得強心膠囊干預心力衰竭關鍵靶點264個。PPI網(wǎng)絡構建篩選出關鍵靶點47個。富集分析強心膠囊干預慢性心力衰竭的關鍵靶點主要參與MAPK、HIF-1、TNF、FoxO、PI3K-AKT、促性腺激素、癌癥、T細胞受體和鈣離子信號通路等。結論：強心膠囊不僅可直接對慢性心力衰竭起到治療作用，還可通過激素、細胞代謝、炎性機制及免疫因子等間接發(fā)揮療效。

關鍵詞 強心膠囊;慢性心力衰竭;網(wǎng)絡藥理學;作用機制

Abstract Objective：To analyze and predict the mechanism of Qiangxin Capsule in the treatment of chronic heart failure based on network pharmacology.Methods：The active ingredients and related target proteins in Qiangxin Capsules were screened by the systematic pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine （TCMSP）.According to the pharmacokinetic ADME parameters，the active ingredients were screened under the conditions of oral bioavailability （OB） ≥ 30%，drug similarity （DL） ≥ 0.18，and biological half-life （HL） ≥ 4.00.The predicted target of active ingredient were obtained from the database （Uniprot）.CTD，TTD，DrugBanK databases were used to explore disease-related targets.The molecular mechanism of Qiangxin Capsule′s intervention in chronic heart failure were analyzed through gene annotation tool Matescape.Results：A total of 108 active components，267 action targets and 32，730 disease-related targets of Qiangxin Capsules were obtained，and finally 264 key targets of Qiangxin Capsules for the intervention of heart failure were obtained.The PPI network was constructed and 47 key targets were selected.Enrichment analysis showed that the key target of Qiangxin Capsule intervention in chronic heart failure mainly involved in MAPK signaling，HIF-1 signaling，TNF signaling，F(xiàn)OXO signaling，PI3K-AKT signaling，gonadotropin signaling，cancer signaling，T-cell receptor signaling and calcium signaling，etc.Conclusion：Qiangxin Capsule can not only directly treat chronic heart failure，but also play an indirect role through hormone，cell metabolism，inflammatory mechanism and immune factors.

Keywords Qiangxin Capsule; Chronic heart failure; Network pharmacology; Mechanism

中圖分類號：R289.5;R541文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.010

心力衰竭指因為心臟結構異常或功能損傷引發(fā)的心室充盈或射血能力受損的一系列復雜綜合征，臨床上以呼吸困難、乏力、體液潴留等為主要表現(xiàn)[1]。心力衰竭呈現(xiàn)進行性進展，為各種心血管疾病的終末期階段，亦是造成心血管疾病患者死亡的重要因素[2]。慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure，CHF）是在其他舊有的心血管病的基礎上出現(xiàn)心力衰竭癥狀及體征時的心力衰竭類型[1]，急性心力衰竭患者經(jīng)治療后癥狀平穩(wěn)大多也可轉為CHF[3]。西醫(yī)治療方法主要包括藥物治療（強心、利尿、擴血管藥以及神經(jīng)內(nèi)分泌抑制劑）和器械治療[1]。根據(jù)相似的臨床表現(xiàn)與發(fā)病特點，可將CHF參照中醫(yī)里“水腫”“心水”“心悸”“喘證”等進行診治，常見脈證表現(xiàn)有心慌氣短、水腫、小便不利、舌淡苔白、脈細等，分為氣陰兩虛、脾腎陽虛、心血瘀阻等證。

強心膠囊的組方成分為茯苓、白術、白芍、附子、紅參、黃芪、丹參、三七、延胡索和葶藶子。其中，茯苓、白術為臨床常用的健脾利水祛濕藥。白芍活血利水。附子溫化陽氣。紅參、黃芪補氣固表。丹參、三七、延胡索化瘀活血定痛。葶藶子具有下氣行水的作用。如此共奏溫補腎陽、強心利水之功。中藥復方由多種藥材以配伍的方式構成，其藥效成分與作用靶點間具有極為復雜的多點對多點的網(wǎng)絡樣關系。強心膠囊可通過多靶點、多通路、多機制的協(xié)同或拮抗作用，改善CHF的癥狀。網(wǎng)絡藥理學是近年來的一門新興學科，具有多學科融合的特征，在對多個數(shù)據(jù)庫進行搜索、整理后，通過建立復雜網(wǎng)絡模型推測藥物的作用機制，這種復雜性恰好與中藥成分和靶點的復雜性相契合，是中醫(yī)藥現(xiàn)代探索的新方向[4]，正好符合中醫(yī)的“整體觀念”。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分、靶點以及疾病靶點的篩選

在中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp）及收錄了4 500余種中草藥的化學成分庫里查找強心膠囊所含有的藥物活性成分，并運用TCMSP根據(jù)成分藥動學ADME參數(shù)，按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18進一步篩選。將篩選后所得的活性成分對應的靶點運用Uniprot數(shù)據(jù)庫的UniprotKB功能經(jīng)過人類基因名規(guī)范化處理，即獲得藥物的可能靶點蛋白。分別在CTD數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和DrugBan數(shù)據(jù)庫中搜索關鍵詞“chronic heart failure”，手動篩選后取得CHF的發(fā)病基因。

1.2 活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構建

使用Venny在線繪畫工具繪制強心膠囊的藥物靶點與CHF的疾病靶點的關系圖，其交集所得即或許為強心膠囊干預CHF的潛在作用靶點。再借助Cytoscape3.7.1展示分子間作用關系的可視化平臺畫出藥物干預CHF的活性成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構建

為明確強心膠囊干預CHF潛在靶點之間的作用關系，將交集靶點蛋白輸入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）信息圖。設置選取最高置信度0.90的PPI關系數(shù)據(jù)，構建強心膠囊對治療CHF的PPI網(wǎng)絡圖。

1.4 KEGG通路分析和GO功能富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：///david.ncifcrf.gov/home.jsp）對關鍵靶點進行KEGG信號通路和GO功能富集分析，研究強心膠囊干預CHF可能靶點的關鍵作用通路及生物學過程。

2 結果

2.1 強心膠囊活性成分、靶點和CHF相關靶點

應用TCMSP查找強心膠囊所含的化合物，并以OB≥30%和DL≥0.18作為篩選條件，篩選出活性化合物共126種。其中白芍7種，白術3種，丹參48種，茯苓5種，附子4種，紅參3種，黃芪15種，三七6種，葶藶子9種，延胡索26種。所有活性化合物經(jīng)去重后共108種。各化合物詳細信息如表1。獲得藥物靶點267個，CHF靶點32 730個。

2.2 活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡

CHF相關靶點共32 730個。通過Venny取交集得到強心膠囊中參與CHF的靶點267個（圖1）。將獲得的公共靶蛋白運用Cytoscape3.7.1網(wǎng)絡繪圖軟件繪制并分析強心膠囊干預CHF成分-靶點網(wǎng)絡圖（圖2）。度與介數(shù)中心性量化各個節(jié)點在網(wǎng)絡中的重要性的重要拓撲參數(shù)，前者表示網(wǎng)絡圖中和節(jié)點相連的路線條數(shù)，后者是網(wǎng)絡中所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑的數(shù)目與最短路徑總數(shù)的比。根據(jù)度和介數(shù)中心性預測強心膠囊干預CHF關鍵化合物，深入分析發(fā)現(xiàn)強心膠囊中活性成分按度值排序前8位的為槲皮素（表2），度=602;山柰酚，度=189;beta-谷甾醇，度=152;異鼠李素，度=72;常春藤皂苷元，度=68;豆甾醇，度=64;木犀草素，度=55;丹參酮ⅡA，度=42。

2.3 強心膠囊治療CHF的PPI網(wǎng)絡

利用String將靶點構建PPI網(wǎng)絡圖，并利用Cytoscape可視化（圖3），按照度值排列，節(jié)點由內(nèi)向外，度值由大變小，顏色越來越淺。度均值為10.597，介數(shù)中心性均值為0.009，共得到47個高于度均值的靶點，介數(shù)中心性也位于前列。關鍵靶點詳細拓撲參數(shù)分析見表3。

2.4 GO功能富集分析結果和KEGG通路分析

對取交集后所得到結果借助DAVID線上應用軟件依次采取GO功能富集的方法與KEGG通路分析的方法。經(jīng)基因本體論方法獲得43條相關結果（圖4），分別是生物過程28條、細胞組分4條、分子功能11條。強心膠囊干預CHF的關鍵靶點主要參與MAPK信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、PI3K-AKT信號通路、促性腺激素信號通路、癌癥通路、T細胞受體信號通路和鈣離子通路等。見圖5。

3 討論

對于心力衰竭的中醫(yī)理論研究認為，其病因多見于心病遷延日久或氣血陰陽虧損，從而引發(fā)臟腑功能失調(diào)，氣血水液運行失常，形成瘀血、水飲等病理產(chǎn)物;病機可歸納為臟腑虛損為本，血瘀、水停等為標[5]。如《素問·逆調(diào)論篇》言“若心氣虛衰，可見喘息持續(xù)不已”及“夫不得臥則喘者，是水氣之客也”，將心力衰竭的病機闡述為心陽虛衰，水飲上泛。《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治第十二》言：“凡食少飲多，水停心下，甚者則悸，微者短氣?！睂⑿牧λソ叩牟C歸納為氣虛痰飲積聚心下。陳瑩等[6]認為脾氣虛損，生化不足，則氣血虧虛，無力運化，則痰飲瘀血內(nèi)生，為心力衰竭的病理機制?！秱卫分幸灿涊d了類似的觀點：“氣虛停飲，陽氣內(nèi)弱，心下空虛，正氣內(nèi)動而悸也?！鼻宕跚迦卧凇夺t(yī)林改錯》中曾提出：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣必停留而瘀?！睆闹嗅t(yī)解剖層面上揭示了CHF的病機為氣虛血瘀，元氣虧虛不能充盈血脈，推動作用不足，氣血運行不暢，必將發(fā)生瘀血等病理產(chǎn)物的停滯，同時造成心失濡養(yǎng)。因此，對于心力衰竭的治療方法應以溫陽益氣為首，輔以活血化瘀、化飲利水等，進行標本同治。為此，根據(jù)溫陽化飲、益氣活血的治療方法所創(chuàng)立的強心膠囊，其基本方主要由丹參、黃芪、紅參、茯苓等組成。且強心膠囊已經(jīng)實驗研究證實具有降低Caspase-12蛋白表達、減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的心肌細胞凋亡發(fā)生的作用[7]。

通過網(wǎng)絡藥理學分析結合目前已報道的文獻，本研究發(fā)現(xiàn)強心膠囊發(fā)揮抗心力衰竭作用的主要信號通路包括：MAPK信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、PI3K-AKT信號通路、促性腺激素信號通路、癌癥通路、T細胞受體信號通路和鈣離子信號通路等。MAPK信號通路和一些常見的心血管疾病，如心肌梗死、CHF等的發(fā)病關系緊密[8]。實驗證實，CHF的疾病進程中多存在線粒體結構異常及功能受損，影響正常的能量合成途徑，MAPK信號通路則在心肌細胞線粒體發(fā)生結構改變時為關鍵環(huán)節(jié)[9]。HIF-1在心血管的生理及病理方面發(fā)揮了重要作用。正常或應激狀態(tài)下，HIF-1對心肌細胞的大小、結構和功能具有保護作用[10]。實驗顯示，心肌細胞凋亡對急性心力衰竭有重要意義，而HIF-lα表達的增加有利于心肌細胞的成活[11]。同時，CHF患者急性失代償期時的HIF-lα水平與其臨床癥狀、體征正相關，說明在CHF急性失代償過程中，HIF-lα水平代償性升高。且HIF-lα對于CHF急性失代償?shù)念A測作用與BNP基本相似，提示HIF-lα可能對于CHF急性失代償期的轉歸具有潛在的預測作用[10]。TNF-α作為一種常見的炎癥介質(zhì)，對于免疫炎癥反應和心力衰竭發(fā)病及進程具有關鍵意義[12]。TNF-α可直接減弱心肌的收縮力，并可激發(fā)心肌細胞的凋亡，介導心肌重塑[13]。臨床試驗證明，TNF-α水平與心力衰竭的程度具有正比例關系。FoxO對細胞的一系列生命活動如代謝、應激和凋亡均具有一定的意義[13]，其中FoxO3a的表達部位大多為心臟，對心肌細胞功能的調(diào)節(jié)具有正向作用[14]。研究結果顯示，AKT活化可通過誘導蛋白酶體降解，導致其下游分子FoxO3a總蛋白水平下降[15];同時FoxO3a能夠干擾前凋亡蛋白BIM表達，降低其含量，阻斷細胞凋亡發(fā)生。PI3K主要由調(diào)節(jié)亞基P85和催化亞基P110兩部分構成。當接收刺激信號時，使P85募集到質(zhì)膜周圍，P110與P85結合，將PIP2催化成PIP3;PIP3激活AKT，從而將AKT由細胞質(zhì)轉移到細胞膜，激活AKT[16]。過度活化的AKT可減少心肌細胞增殖，誘導BAX基因表達，增加心肌細胞凋亡，引發(fā)CHF的發(fā)生和發(fā)展[17-18]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法對強心膠囊治療CHF多成分、多靶點、多通路的復雜網(wǎng)絡進行探究，發(fā)現(xiàn)其主要活性成分不僅可以直接對CHF起到治療作用，還可以通過激素、細胞代謝、炎性機制及免疫因子等間接發(fā)揮療效?；诰W(wǎng)絡藥理學的作用機制探索為治療CHF提供了重要線索，同時強心膠囊干預CHF的多成分-多靶點-多通路，體現(xiàn)了復方君臣佐使及七情配伍協(xié)同增效的中醫(yī)整體思想的作用特點。

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（2020-07-07收稿 責任編輯：楊覺雄）