鐘 山，王正義，郭林旺，林 玉

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院濱江分院全科，海南?？?571100

痛風(fēng)是因?yàn)閱吴c尿酸鹽晶體異常引起的炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為嘌呤代謝和尿酸排泄異常以及障礙[1]。長(zhǎng)期的高尿酸血癥會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)和周圍軟組織尿酸鹽晶體沉淀，進(jìn)而反復(fù)出現(xiàn)急性關(guān)節(jié)炎，軟組織、關(guān)節(jié)損害，以及痛風(fēng)石性關(guān)節(jié)炎[2]。而急性痛風(fēng)則是病情發(fā)展快、疼痛劇烈，且伴隨C反應(yīng)蛋白(CRP)和紅細(xì)胞沉降率(ESR)的升高，但是大部分患者可在一定時(shí)間內(nèi)自行緩解，臨床上僅部分患者可由高尿酸血癥發(fā)展為急性痛風(fēng)，所以尋找更加有效預(yù)測(cè)痛風(fēng)的指標(biāo)顯得較為重要[3]。CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，是機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)時(shí)最敏感的指標(biāo)之一；ESR是指紅細(xì)胞在一定條件內(nèi)的沉降速度，在急性痛風(fēng)發(fā)作期可明顯升高[4]。血清核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NALP3)屬于大分子復(fù)合物，能夠充當(dāng)半胱天冬酶-1活化的平臺(tái)，同時(shí)能夠起到促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-lβ、IL-18等炎性因子生成以及成熟的作用。既往有文獻(xiàn)顯示，NALP3在痛風(fēng)、腎臟疾病當(dāng)中起到重要的作用[5-6]。因此，本研究選取本院收治的152例急性痛風(fēng)患者的臨床資料進(jìn)行分析，探討急性痛風(fēng)患者NALP3炎癥小體表達(dá)及相關(guān)指標(biāo)的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2020年3月本院收治的152例急性痛風(fēng)患者作為試驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《痛風(fēng)的防治》[7]中痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡>18歲；(3)精神意識(shí)正常；(4)雙源CT檢查尿酸鹽結(jié)晶沉積情況，均發(fā)現(xiàn)尿酸鹽沉積，結(jié)晶沉積數(shù)量在120個(gè)以下；(5)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在惡性腫瘤、心肌梗死等重大疾??；(2)存在肺、腦、腎等重要器官障礙；(3)中途退出或死亡。另選取同期體檢健康者151例作為對(duì)照組。試驗(yàn)組男75例，女77例；年齡31～68歲，平均(50.14±5.48)歲；病程10～19 h，平均(15.25±3.19)h。對(duì)照組男74例，女77例，年齡30～69歲，平均(50.21±5.51)歲。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有患者及其家屬知情且簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1NALP3 mRNA檢測(cè) 分別抽取兩組患者空腹靜脈血2.5 mL，高速離心分離血清，參考TIANamp Blood DNA Kit說(shuō)明書(shū)提取DNA，-70 ℃保存。采用熒光定量PCR檢測(cè)NALP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。參考GenBank中NALP3 mRNA的序列，采用Primer Express2.0軟件設(shè)計(jì)引物，NALP3上游引物為5′-CCCCGTGAGTCCCATTA-3′，NALP3下游引物為5′-GAC-GCCCAGTCCAACAT-3′。內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游引物為5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：45 ℃，持續(xù)45 min。采用熒光定量PCR測(cè)定NALP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。95 ℃，預(yù)變性2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃退火，72 ℃延伸45 s，連續(xù)40個(gè)循環(huán)。PCR完成后，分析擴(kuò)增曲線對(duì)應(yīng)循環(huán)閾值(Ct值)。

1.2.2NALP3蛋白檢測(cè) 分別抽取兩組患者外周血2.5 mL，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，嚴(yán)格按照蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉孵育1.5 h；采用NALP3抗體(武漢博士德生物工程公司)及GAPDH抗體(美國(guó)Abcam公司)4 ℃孵育過(guò)夜。第2天加入被辣根過(guò)氧化酶所標(biāo)記的二抗，孵育1 h，隨后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯色，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.3實(shí)驗(yàn)室檢查 觀察兩組受試者尿酸(UA)、空腹血糖(FPG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、ESR、CRP水平。抽取兩組受試者空腹靜脈血3.5 mL，高速離心分層，分離血清，送至檢驗(yàn)科，應(yīng)用美國(guó)貝克曼有限公司的AU5800檢測(cè)UA、ESR、LDL-C、HDL-C水平；應(yīng)用泰康醫(yī)學(xué)系統(tǒng)股份有限公司的血糖檢測(cè)儀檢測(cè)FPG水平；應(yīng)用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)CRP水平，人CRP ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。參考《常見(jiàn)疾病的實(shí)驗(yàn)室檢查》[8]中實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)正常范圍。UA正常范圍：<420 μmol/L；FPG正常范圍：3.9～6.1 mmol/L；LDL-C正常范圍：<3.41 mmol/L；HDL-C正常范圍：1.16～1.42 mmol/L；ESR正常范圍：<20 mm/h；CRP正常范圍：<2.87 ng/L。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的比較 兩組患者FPG、LDL-C、HDL-C水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；試驗(yàn)組UA、ESR、CRP水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的比較

2.2兩組患者血清NALP3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況比較 試驗(yàn)組NALP3 mRNA表達(dá)水平及NALP3蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2。

圖2 兩組NALP3蛋白表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3急性痛風(fēng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析 經(jīng)多因素Logistic回歸分析，NALP3炎癥小體、UA、ESR和CRP是導(dǎo)致急性痛風(fēng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

表3 急性痛風(fēng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析

2.4NALP3炎癥小體表達(dá)水平與血清指標(biāo)相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，健康者和急性痛風(fēng)患者NALP3 mRNA的表達(dá)水平與UA、CRP、ESR均呈正相關(guān)(r=0.559、0.548、0.727，P<0.001)。

3 討 論

痛風(fēng)是目前風(fēng)濕免疫科較為常見(jiàn)關(guān)節(jié)炎性疾病之一，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)周圍紅腫、劇烈疼痛等，往往在1周左右可自行緩解，但是隨著時(shí)間的變化，痛風(fēng)的次數(shù)會(huì)逐漸增加，出現(xiàn)痛風(fēng)石，最終引起關(guān)節(jié)畸形[9]。痛風(fēng)急性發(fā)作期存在較為明顯的特異性，急性發(fā)作期患者患病側(cè)關(guān)節(jié)可出現(xiàn)紅腫、灼燒以及疼痛感導(dǎo)致行動(dòng)受到限制，如果影響到大關(guān)節(jié)甚至?xí)饾B液，患者多伴隨發(fā)熱的癥狀，往往會(huì)出現(xiàn)寒戰(zhàn)、倦怠、頭痛等情況，由于痛風(fēng)急性發(fā)作期出現(xiàn)的皮膚暗紅也會(huì)隨之消失，大部分患者會(huì)出現(xiàn)脫屑、瘙癢等情況[10-12]。通常采用激素類藥物進(jìn)行治療痛風(fēng)急性發(fā)作期患者，雖可緩解病情，但其治療效果受到治療是否及時(shí)的影響，因此對(duì)于痛風(fēng)急性發(fā)作的預(yù)測(cè)和診斷顯得極其重要[13-15]。

NALP3炎癥小體屬于炎性復(fù)合體的一類。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎生成的尿酸炎結(jié)晶體是一種活化劑，能夠活化炎性體，促進(jìn)活性氧簇的分泌，激活NALP3的炎性信號(hào)通道，進(jìn)而促進(jìn)TNF-α、TL-1β等一系列炎性因子的分泌，使機(jī)體的炎性反應(yīng)得到進(jìn)一步擴(kuò)大[16]。NALP3炎癥小體的主要由NALP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶(caspase)組成，這3種因子均能抑制IL-1β的成熟，表明NALP3炎性體與痛風(fēng)炎性反應(yīng)緊密相關(guān)，而有研究證實(shí)IL-1β能夠促進(jìn)炎癥因子的分泌，引起炎癥應(yīng)答，與痛風(fēng)急性發(fā)作密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組NALP3 mRNA及蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且NALP3炎癥小體是痛風(fēng)急性發(fā)作的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與據(jù)李芳等[18]研究一致。提示痛風(fēng)的急性發(fā)作期同樣與NALP3炎癥小體的表達(dá)升高有關(guān)。UA水平的升高是痛風(fēng)的主要特征之一，本研究結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，試驗(yàn)組UA水平顯著升高，且UA是痛風(fēng)急性發(fā)作的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，分析原因，UA的代謝異常會(huì)導(dǎo)致尿酸鹽結(jié)晶堆積于關(guān)節(jié)腔內(nèi)部，促進(jìn)炎性因子，進(jìn)而引發(fā)痛風(fēng)急性發(fā)作[19]。CRP是一種在IL-1、IL-6等炎性因子刺激下由肝細(xì)胞所合成的蛋白，健康人體內(nèi)表達(dá)水平較低，但是在患者體內(nèi)出現(xiàn)炎性因子的情況下，其水平會(huì)急劇升高。ESR升高多見(jiàn)于各種炎癥。本研究中，試驗(yàn)組CRP、ESR水平較對(duì)照組顯著升高，提示其能夠作為痛風(fēng)急性發(fā)作的檢測(cè)指標(biāo)。本研究結(jié)果還顯示，痛風(fēng)急性發(fā)作期體內(nèi)NALP3 mRNA的表達(dá)與患者UA、CRP、ESR呈正相關(guān)。分析原因：患者在痛風(fēng)急性發(fā)作期體內(nèi)，因?yàn)檠仔苑磻?yīng)導(dǎo)致NALP3 mRNA的表達(dá)急劇升高，而在炎性反應(yīng)的促進(jìn)下，CRP水平急劇升高，ESR也隨之升高[20]。

綜上所述，NALP3炎癥小體在急性痛風(fēng)患者中的表達(dá)水平明顯升高，NALP3炎癥小體、血清UA、ESR、CRP是急性痛風(fēng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)NALP3炎癥小體與UA、ESR、CRP的表達(dá)水平呈正相關(guān)。