●陳朝陽 冉俊寧 文啟友 姚 婷 楊佳麗 鄧奕輝

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一組以血糖增高伴脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂的慢性內(nèi)分泌代謝性病群，可導(dǎo)致多器官系統(tǒng)受累并伴有大、小血管及非血管的并發(fā)癥[1]。糖尿病及其并發(fā)癥（如糖尿病心血管病變、視網(wǎng)膜病變、腎病等）的存在導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，全球死亡率增加，已成為全球最大的公共衛(wèi)生問題、十大死亡原因之一[2-6]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會（IDF）評估，若不采取有效的控制方法，至2045年受害患者將增加到6.93億成年人[7]。

脫發(fā)不僅影響美觀更損害心理健康，研究發(fā)現(xiàn)脫發(fā)增加了患者焦慮和抑郁的概率[8]。因此，糖尿病合并脫發(fā)嚴(yán)重危害患者身體、心理健康，必須引起重視。關(guān)于糖尿病脫發(fā)的病因，相關(guān)研究認(rèn)為：（1）血糖、血脂、血壓升高是導(dǎo)致脫發(fā)的危險(xiǎn)因素，同時(shí)亦可促進(jìn)胰島素抵抗（IR），而IR 是造成上述因素的基本環(huán)節(jié)和病理基礎(chǔ)，有研究表明IR 與女性早發(fā)型脫發(fā)存在明顯相關(guān)性，而血糖升高在男性脫發(fā)中尤為突出[9]；（2）DM 人群毛發(fā)的生長速度較正常人減慢[10]；（3）部分降糖藥如利拉魯肽等可通過減少食欲、降低營養(yǎng)吸收或免疫相關(guān)反應(yīng)等直接或間接性導(dǎo)致脫發(fā)[11]。

對于脫發(fā)的中醫(yī)病因病機(jī)，趙暉[12]認(rèn)為可從虛實(shí)兩方面探討，其一為虛，“發(fā)為血之余”，腎藏精，肝藏血，肝腎同源，精血互生，肝腎虧虛則發(fā)失所養(yǎng)；其二為實(shí)，嗜食肥甘厚味使脾失運(yùn)化，水液運(yùn)行受阻而停滯，郁而化熱，濕熱上蒸毛發(fā)使毛孔油膩堵塞可致脫發(fā)，氣行則血行，氣滯則血停，平素情志抑郁，氣血運(yùn)行受阻，氣滯血瘀使血無法濡養(yǎng)發(fā)根，或血熱之人外感風(fēng)熱，耗傷陰血?jiǎng)t發(fā)根失去濡養(yǎng)。徐燦坤[13]也發(fā)現(xiàn)程益春教授多將脫發(fā)歸因于血虛和濕熱，治應(yīng)活血涼血養(yǎng)血及祛濕除熱和疏散風(fēng)邪為主。而崔偉霞[14]亦發(fā)現(xiàn)大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為脫發(fā)的病因病機(jī)主要有以下3個(gè)方面：濕熱、血虛風(fēng)燥及肝腎虧虛。

二至丸由滋補(bǔ)肝腎的女貞子、墨旱蓮組成，后者兼涼血止血之功，二者性平和、偏寒，等量(1∶1)配伍，既滋陰補(bǔ)血，又不滋膩礙脾、阻滯氣機(jī)，具有補(bǔ)腎養(yǎng)肝、烏須發(fā)之功，為經(jīng)典的平補(bǔ)肝腎之方[15-17]。近幾年研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二至丸除具有降糖活性外，還具備改善血液流變性、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能等功效，在治療糖尿病及其并發(fā)癥和相關(guān)代謝綜合征方面具有良好的療效[18-22]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多靶點(diǎn)、多通路的研究，進(jìn)一步探討二至丸治療糖尿病脫發(fā)的作用機(jī)制，為臨床治療糖尿病脫發(fā)提供用藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（https://tcmspw.com/tcmsp.php），Pubchem分子庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，Chemspider 化學(xué)結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（http://www.chemspider.com/），Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），Genecards、TTD、OMIM 數(shù)據(jù)庫，Draw Venn Diagram 數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），imageGP (http://www.Ehbio.com)，Cytoscape3.7.1軟件，Uniprot數(shù)據(jù)庫[23-25]。

1.2 方法

1.2.1 二至丸活性成分篩選及相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測 將二至丸的墨旱蓮、女貞子兩味藥物在TCMSP 平臺上分別檢索并收集活性成分，篩選條件為：口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18[26]。將篩選后的具有較高活性的藥物輸入PubChem 及ChemSpider 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索、獲取相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，不能獲取相應(yīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)式的藥物予以剔除。將篩選后的化合物在Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，剔除無靶點(diǎn)者，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫使靶點(diǎn)名稱規(guī)范化。

1.2.2 糖尿病脫發(fā)靶點(diǎn)預(yù)測 采用Genecards、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫，以“Diabetic hair loss”為檢索詞，收集并篩選糖尿病脫發(fā)的作用靶點(diǎn)，Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選條件為：Score＞30[25]。

1.2.3 疾病與二至丸共同靶點(diǎn)的收集 通過Draw Venn Diagram 平臺，將墨旱蓮、女貞子與糖尿病脫發(fā)的靶點(diǎn)輸入，分別以MHL、NZZ、Diabetic hair loss 代表，構(gòu)建韋恩圖，得到疾病與二至丸共同靶點(diǎn)。

1.2.4 構(gòu)建共同靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，選定Multiple protein，物種選擇Homo sapiens，最低互動分?jǐn)?shù)為默認(rèn)值（0.400），得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI 信息，將從PPI 獲得的信息node1、node2、combined-score值導(dǎo)出至Excel2016，通過Cyto?scape3.7.1進(jìn)行可視化，利用Network analyzer 進(jìn)行PPI的拓?fù)浞治?，得到Degree值[23]。

1.2.5 共同靶點(diǎn)GO 生物注釋和KEGG 通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫將共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物注釋和KEGG 通路富集分析。設(shè)定靶點(diǎn)為“OFFICIALGENE-SYMBOL”格式，Background 選擇“Homo sapi?ens”，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P＜0.05，Count=2[23]。分別導(dǎo)出基因功能的三個(gè)部分細(xì)胞組分CC、分子功能MF、生物過程BP，進(jìn)行GO 分析。取P值的負(fù)對數(shù)，-lgP越大，說明富集程度越高，根據(jù)-lgP值取CC、MF、BP前10位的相關(guān)信息在imageGP 平臺構(gòu)建氣泡圖[23]。同時(shí)，將排名前20通路的Term、Genes、-lgP值導(dǎo)入至Cyto?scape3.7.1進(jìn)行可視化，構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 二至丸活性成分信息及藥物相關(guān)靶點(diǎn)匯總利用TCMSP共收集到二至丸的活性成分167個(gè)，其中墨旱蓮48 個(gè)，女貞子119 個(gè)，篩選后的候選化合物有23個(gè)，其中墨旱蓮10個(gè)，女貞子13個(gè)，其中墨旱蓮、女貞子共同活性成分2 個(gè)（luteolin/木犀草素、quercetin/槲皮素），見表1。剔除無化學(xué)結(jié)構(gòu)、靶點(diǎn)的化合物：墨旱蓮（MOL003378），女貞子（MOL005169、MOL005195、MOL005212、MOL005147、MOL004576）。得到二至丸相關(guān)靶點(diǎn)764個(gè)，其中墨旱蓮326個(gè)，女貞子438個(gè)。

表1 二至丸候選化合物基本信息

2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)信息利用Genecards、TTD、OMIM 數(shù)據(jù)庫收集并篩選得到糖尿病脫發(fā)相關(guān)靶點(diǎn)291個(gè)。

2.3 共同靶點(diǎn)信息將糖尿病脫發(fā)相關(guān)靶點(diǎn)291 個(gè)與二至丸相關(guān)靶點(diǎn)764 個(gè)通過Draw Venn Diagram 平臺取交集并繪制韋恩圖，得到共同靶點(diǎn)48個(gè)，韋恩圖見圖1，具體共同靶點(diǎn)見表2。

表2 二至丸活性成分化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點(diǎn)

圖1 二至丸活性成分化合物與糖尿病脫發(fā)靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 共同靶點(diǎn)PPI分析及核心靶點(diǎn)篩選共同靶點(diǎn)的Degree值見表3，其中根據(jù)Degree值設(shè)定節(jié)點(diǎn)大小，Degree 值越大，節(jié)點(diǎn)越大；根據(jù)Combine score 值設(shè)定邊線粗細(xì)，值越大，邊線越粗；設(shè)定1≤Degree≤10 為綠色，10＜Degree≤20 為藍(lán)色，20＜Degree≤30 為紫色，30＜Degree≤40為紅色。利用Cytoscape3.7.1構(gòu)建共同靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，該圖共有48個(gè)靶點(diǎn)，包含48個(gè)節(jié)點(diǎn)，394條邊，見圖2。由圖及表可知，二至丸治療糖尿病脫發(fā)的重要靶標(biāo)分別為：AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、非受體酪氨酸激酶C（SRC）、V-Ha-Ras 肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、表皮生長因子受體（EGFR）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、腫瘤壞死因子（TNF）、磷脂酰肌醇3 激酶（PIK3CA）、纖連蛋白1（FN1）等。

圖2 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表3 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點(diǎn)蛋白Degree值

2.5 共同靶點(diǎn)GO、KEGG 注釋信息及富集通路結(jié)果48 個(gè)共同靶點(diǎn)GO 富集分析得到CC14 個(gè)、BP59個(gè)、MF13 個(gè)，取PValue 值的負(fù)對數(shù)（-lgP），-lgP值越大表示富集程度越高，依據(jù)-lgP值對CC、BP、MF分別取前10 位構(gòu)建氣泡圖，其中氣泡的大小取決于Count值，X軸為關(guān)聯(lián)基因數(shù)與GO富集分析上總基因數(shù)的比值(Gene Ratio)，Y軸為CC、BP、MF的-lgP前10的靶點(diǎn)名稱，見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共同靶點(diǎn)主要分布于質(zhì)膜、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域等細(xì)胞成分中，通過類固醇結(jié)合、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、雌激素激活的序列特異性DNA 結(jié)合、去甲腎上腺素結(jié)合、腎上腺素結(jié)合等方式，參與蛋白質(zhì)磷酸化、RNA聚合酶II啟動子調(diào)控、絲氨酸磷酸化、DNA復(fù)制、MAP激酶反饋機(jī)制調(diào)控、神經(jīng)元的凋亡過程、基因表達(dá)調(diào)控等生物進(jìn)程，從而發(fā)揮治療糖尿病脫發(fā)的作用。

圖3 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點(diǎn)GO富集分析

48 個(gè)共同靶點(diǎn)KEGG 富集分析得到80 個(gè)信號通路，根據(jù)-lgP值取富集程度前20 的信號通路[25]，見表4。同時(shí)將富集程度排名前20 位的通路相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 構(gòu)建共同靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，其中紅色菱形代表信號通路、綠色長方形代表共同靶點(diǎn)，見圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共同靶點(diǎn)參與的通路以癌癥途徑（包括蛋白聚糖、碳代謝）、催乳素信號通路、HIF-1 信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路等為主。由此表明，二至丸主要通過以上通路發(fā)揮治療糖尿病脫發(fā)的作用。

圖4 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表4 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果

3 討論

二至丸具有滋腎養(yǎng)肝、烏須發(fā)的功效，是傳統(tǒng)的平補(bǔ)肝腎之良方。本研究通過對二至丸中墨旱蓮、女貞子的活性成分的收集和篩選，得到具有較高活性的候選化合物23 個(gè)，部分活性成分已被證實(shí)具有調(diào)節(jié)糖類和脂肪代謝等功能，如亞麻酸（Linarin）可降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），減輕肝損傷，從而降低血脂，韋地內(nèi)酯（wede?lolactone）亦通過ERK（細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶）途徑抑制人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hAMSCs）的脂肪形成分化，有利于血液的流通，促進(jìn)血液循環(huán)，利于頭部供血提供營養(yǎng)[27-28]，槲皮素（quercetin）可減少脂質(zhì)過氧化，抗血小板聚集和提高毛細(xì)血管通透性，滑石粉（Taxifolin）通過體外抑制Aβ纖絲的形成，改善腦血流量，同時(shí)具有抗氧化和抗糖化活性的功能[2,29-31]。

通過Degree 值預(yù)測出二至丸改善糖尿病脫發(fā)作用的前10 位的重要靶點(diǎn)分別為：AKT1、SRC、HRAS、EGFR、STAT3、TNF、PIK3CA、FN1、MTOR、ESR1，PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示二至丸靶標(biāo)與糖尿病脫發(fā)靶標(biāo)之間存在著復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。AKT1 參與胰島素信號傳導(dǎo)，內(nèi)皮功能和代謝調(diào)節(jié)，通過調(diào)控細(xì)胞增殖和生長，參與葡萄糖代謝的細(xì)胞過程，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和預(yù)防異常的血管通透性[32]；SRC 通過調(diào)節(jié)RAS/ERK 途徑的活性[33]，HRAS 通過調(diào)控RAS/MAPK 信號通路途徑[34]，EGFR激活導(dǎo)致受體酪氨酸激酶的自磷酸化啟動下游信號通路[35]，影響細(xì)胞的增殖從而在糖尿病脫發(fā)的病理過程中發(fā)揮作用；PIK3CA 的突變可提高PI3Ks 活性，從而使細(xì)胞內(nèi)含有PH 結(jié)構(gòu)域的信號蛋白AKT 和PDK1(phosphoinositide dependent kinase-1)結(jié)合,促使PDK1磷酸化AKT 蛋白的Ser308 導(dǎo)致AKT 活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，減少細(xì)胞凋亡[36]。此外，二至丸還可以通過STAT3、TNF發(fā)揮抗炎作用保護(hù)血管的通透性，維持血液循環(huán)的暢通，炎癥是使血管粥樣硬化的重要驅(qū)動力，STAT3通過促進(jìn)白細(xì)胞介素-6（IL-6）分泌[37]，TNF促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖[38]，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗炎的作用。因此，二至丸可通過調(diào)節(jié)上述靶蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)胰島素代謝、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，保護(hù)血管通透性等作用防治糖尿病脫發(fā)。

GO 富集分析表明，二至丸防治糖尿病脫發(fā)的靶點(diǎn)存在于多種細(xì)胞成分，通過多種方式參與蛋白質(zhì)磷酸化、DNA復(fù)制、基因表達(dá)調(diào)控等生物過程，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝[39]，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡，通過改善內(nèi)分泌代謝紊亂、血液循環(huán)等在防治糖尿病脫發(fā)的過程中發(fā)揮重要作用。

KEGG 富集通路分析顯示，共同靶點(diǎn)可通過催乳素信號通路、HIF-1 信號通路、Rap1 信號通路、Ras 信號通路等方式改善糖尿病脫發(fā)。已有研究發(fā)現(xiàn):催乳素（PRL）作為激素和細(xì)胞因子在垂體、免疫系統(tǒng)等組織合成，其信號通路通過跨膜催乳素受體（PRL-R）發(fā)生，參與體內(nèi)代謝，影響繁殖、控制營養(yǎng)細(xì)胞的動態(tài)平衡、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[40-42]；HIF-1可參與體內(nèi)糖代謝和影響血管生成的蛋白（如血管內(nèi)皮生長因子和促紅細(xì)胞生成素）的表達(dá)[43]；血小板是發(fā)揮止血功效的重要成分，RAP1是影響血小板粘附的關(guān)鍵，能通過感應(yīng)細(xì)胞質(zhì)的微小鈣濃度變化，發(fā)揮調(diào)節(jié)血小板的粘附性的作用，從而保持血管的通透性，調(diào)節(jié)血液循環(huán)[44]；RAS 通過參與控制細(xì)胞的過程，影響細(xì)胞的增殖、遷移[45]，從而發(fā)揮改善糖尿病脫發(fā)的作用。李春夢[46]等網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)二至丸可通過調(diào)節(jié)Regulation of ac?tin cytoskeleton、Insulin signaling pathway 等信號通路，影響細(xì)胞遷移、改善胰島素抵抗而發(fā)揮治療糖尿病腎病的作用，與本研究預(yù)測靶點(diǎn)契合。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的多靶點(diǎn)、多通路的藥物分子設(shè)計(jì)模式，其整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)藥提倡的整體觀、辨證論治原則相統(tǒng)一。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法得到了二至丸改善糖尿病脫發(fā)的作用靶點(diǎn)及其通路，初步揭示了二至丸治療糖尿病脫發(fā)的作用機(jī)制，為臨床及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供了依據(jù)。