喬子桐，尹 麗，周旖璇，于琛琛，程 嵐，張純剛

（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連 116620）

蜂花粉（bee pollen）是花粉經(jīng)花蜜和蜜蜂腺體分泌物粘合后堆積在工蜂后腿花粉籃中形成的球粒狀物[1?2]。市售蜂花粉是由蜂農(nóng)通過在蜂箱入口加裝脫粉器收集而來[3]。因其含有較全面的營養(yǎng)成分和多種重要的生物活性物質(zhì)而受到人們的廣泛關(guān)注[4?7]。但以往科研工作者對于蜂花粉成分的研究主要聚焦在蛋白質(zhì)類、脂質(zhì)類、酚類和維生素上[8?13]。直到20世紀60年代多糖作為廣譜免疫促進劑受到關(guān)注后，蜂花粉多糖才漸漸成為新藥研究的熱點之一。蜂花粉多糖的組成十分復雜，不同的植物來源和提取分離技術(shù)均會影響其成分和含量，進而影響其生物活性。本文將對蜂花粉中多糖的組成、提取、分離純化以及生物活性方面近年來的研究工作進行比較和總結(jié)，以期為深入研究蜂花粉多糖提供參考。

1 蜂花粉多糖的提取方法

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是利用溶劑相似相溶的原理提取有效成分。多糖作為一種極性分子，易溶于水，不易溶于醇、醚等有機溶劑[14]。常見的溶劑提取法有：酸提法、堿提法和水提法。其中，酸提法通過增加植物細胞壁的溶脹和破裂提高多糖的溶出率[15]，堿提法對酸性多糖尤其是含糖醛酸多的多糖提取效果較好[16]。但酸性或堿性條件往往會使多糖分子結(jié)構(gòu)破壞[15,17?18]，因此在使用這兩種方法時應嚴格控制酸、堿的用量及作用時間。對于蜂花粉而言，以酸或堿作為溶劑提取多糖還需進一步研究，目前蜂花粉多糖普遍應用水提法（水提醇沉法）進行提取。左紹遠等[19]通過正交試驗確定當提取溫度為90 ℃、浸提時間12 h、料液比1:20 時，紅花蜂花粉多糖最高提取率為2.385%，明顯高于其他試驗組合的結(jié)果，重復三次，紅花蜂花粉多糖平均提取率為2.35%，工藝穩(wěn)定可行。但在提取過程中，蛋白質(zhì)、苷類等易溶于水的成分也將被浸提出來，增加了后續(xù)分離純化的難度，另外，提取溫度高，有可能破壞多糖的結(jié)構(gòu)，相關(guān)數(shù)據(jù)有待進一步說明。

1.2 超聲波提取法

超聲波提取法是利用超聲波的空化作用和機械效應破壞蜂花粉外壁，從而加速蜂花粉內(nèi)容物的溢出。米佳等[20]采用超聲波提取法提取枸杞蜂花粉多糖，以單因素實驗為基礎，得率為指標，結(jié)合Box-Behnken 試驗設計考察了料液比、提取溫度、超聲功率、超聲時間對多糖的得率的影響。實驗結(jié)果表明料液比1:25 g/mL、超聲時間20 min 就可達到較大得率。與無超聲條件下的提取工藝進行相比[19,21]，超聲波提取法能夠明顯縮短提取時間，減少提取過程中溶劑的使用量。已有研究表明超聲波強度越大破壁作用越強，越有利于多糖的釋放，但也極有可能導致糖苷鍵的斷裂破壞多糖結(jié)構(gòu)[22?23]。此外，利用微波提取法提取蜂花粉多糖也出現(xiàn)了同樣的情況。李月等[24]發(fā)現(xiàn)當微波功率超過500 W 時，會導致紅花蜂花粉多糖部分水解，使其工藝優(yōu)化后的提取率低于水提醇沉法。因此，在使用這些方法提取蜂花粉多糖時應該嚴格控制操作條件。

1.3 酶解法

酶解法能夠利用外源酶作用于蜂花粉壁，使其破裂，促進多糖溶出。孟良玉等[25]根據(jù)單因素實驗結(jié)果設計正交試驗，當料液比1:50 g/mL，加1.75%纖維素酶，酶解溫度47.5℃，酶解時間5 h 時，油菜蜂花粉破壁率高達85.72%，多糖提取率為18.85%?？梢姡附夥娠@著降低提取溫度，降低提取時的能量消耗，能夠避免由于溫度過高而使多糖中的生物活性降低的現(xiàn)象。此外，對于一些外壁異常堅硬的蜂花粉，常采用復合酶制劑對其進行破壁處理。如青藏地區(qū)油菜蜂花粉，因受惡劣氣候的影響，花粉孢子壁異常堅硬，酵母菌、食用菌、曲霉屬等發(fā)酵方法效果很差，甚至用冷凍加熱法亦無法將之破開[26?27]。盧挺[26]采用復合酶（纖維素復合酶輔加適量果膠酶）對其進行破壁，內(nèi)容物溶出率≥90%。酶解法雖然簡單有效，但由于酶的專一性和實驗條件（需嚴格控制如溫度、pH 等實驗條件避免酶失活）的復雜性，與其他提取方法相比酶解法提取蜂花粉多糖的成本較高。

1.4 混合提取法

蜂花粉壁結(jié)構(gòu)十分復雜[28]，其異常堅硬的外壁會影響內(nèi)容物的釋放與吸收。因此，在提取多糖時常與蜂花粉破壁法相結(jié)合。常見的混合提取方法有溫差-酶法、溫差-超聲法、超聲-酶法等。馬福敏等[29]發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲波結(jié)合酶法提取茶花蜂花粉總多糖的含量較其他復合法高。這可能是由于超聲產(chǎn)生的機械振動破壞蜂花粉外壁的同時，還增加了蜂花粉組織在溶劑中的分散性，進而增大了酶與蜂花粉組織的作用面積，使提取率升高[30?31]。且這種方法對松花粉和梨花粉的破壁率、多糖提取率也有較大影響，值得進一步研究。

2 蜂花粉多糖的分離純化

蜂花粉粗多糖中含有大量蛋白質(zhì)、無機鹽、色素等非糖物質(zhì)。分離純化技術(shù)不僅能夠除去蜂花粉多糖中的非糖物質(zhì)，還可有效地對多糖進行分級以得到具有單一對稱峰的多糖化合物[32]。對于蛋白質(zhì)雜質(zhì)可選用Sevage、三氟三氯乙烷及三氯乙酸（TCA 法）等化學試劑，使蛋白質(zhì)形成膠狀物質(zhì)，離心除去，或利用蛋白酶法，二者相比，化學試劑法極易造成多糖的斷裂；而蛋白酶法，由于酶的特異性，在清除蛋白的同時能夠較好的保證多糖的生物活性[33]，但價格較高。若將二者相結(jié)合，就能在有效脫除蛋白的同時，降低多糖的損失，并且能夠節(jié)約成本、降低污染，可應用于工業(yè)生產(chǎn)。李月等[34]探究紅花蜂花粉多糖的最佳脫蛋白工藝，發(fā)現(xiàn)相同條件下Sevage-酶法的效果最好，蛋白清除率可達45.88%，多糖保留率為86.49%，有良好的應用前景。對于蜂花粉粗多糖中色素、低分子化合物和無機鹽，可選用如活性炭吸附法、反膠束法、透析法等進行分離處理。其中活性炭吸附法是目前較為常見的多糖脫色方法，而透析法由于耗時較長，多糖溶液長期在室溫下容易滋生細菌等缺陷，近年來也常采用超濾法代替。

除去雜質(zhì)后的多糖需進一步純化，目前應用最廣泛的多糖處理方法是柱層析法。研究者將水提醇沉法得到的紅花蜂花粉粗多糖（PBPC），經(jīng)DEAE-52 cellulose（1.6 cm×40 cm）柱分離，依次用水、0.1、0.2、0.3 和1 mol/L 的NaCl 洗脫，得到5 種組分（PBPC-Ⅰ、PBPC-Ⅱ、PBPC-Ⅲ、PBPC-Ⅳ、PBPC-Ⅴ），再經(jīng)SaphadexG75 進一步分級純化，除PBPC-Ⅰ分離得到PBPC-Ⅰa 和PBPC-Ⅰb 兩個級分外，其余組分均為單一對稱峰[35]。李娟等[36]采用水提醇沉法提取蕎麥蜂花粉粗多糖，經(jīng)木瓜蛋白酶- Sevag法、DEAE-52 cellulose 柱層析法對多糖分離純化，得到三種多糖組分（WFPP-N、WFPP-1、WFPP-2），紫外光譜分析三個組分多糖均不含有蛋白、核酸等雜質(zhì)，但均含β-型糖苷鍵。吳盼盼等[37]利用DEAE-纖維素柱、HW-55F 色譜柱及 Sephacryl 色譜柱、Sepharose 色譜柱對油菜蜂花粉水提醇沉物進行分離，得到具有單一對稱峰的多糖化合物A。再經(jīng)氫譜與碳譜確定其為直鏈型化合物，片段結(jié)構(gòu)為：HOCH2-[CHOH]4-COOH。

3 蜂花粉多糖的組成分析

由于花卉物種來源、提取方法和分離純化技術(shù)的差異，蜂花粉多糖的成分和摩爾比各不相同。表1總結(jié)了近幾年來報道的蜂花粉多糖的組成、摩爾比及其檢測方法。氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）是分析蜂花粉多糖中單糖組成的常用方法。王昀等[39]通過三氟乙酸水解、衍生化、GCMS 技術(shù)對紅花蜂花粉多糖組分PBPC-Ⅱ的單糖組成進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBPC-Ⅱ由鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc）、木糖（Xly）、葡萄糖（Glc）及半乳糖（Gal）構(gòu)成，其摩爾比為1.40:1.53:1:1.11:2.79:9.73。高效液相色譜法也被用來分析蜂花粉多糖的單糖組成。據(jù)報道，經(jīng)高效液相色譜法測定的菊花蜂花粉總多糖（WDPP）主要由鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）和少量的葡萄糖醛酸（GlcA）和甘露糖（Man）組成[41]。此外，王建波等[44]利用毛細管電泳法（HPCE）測定玉米花粉多糖的單糖組成，創(chuàng)新使用含硼砂的緩沖液，在改善糖在水中的解離能力較差、不易帶電荷特性的同時，利用不同單糖與硼砂的絡合物形成有效淌度的差異，再經(jīng)α-萘胺衍生試劑衍生處理，得出玉米花粉多糖主要是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖3 種單糖組成。此法為蜂花粉多糖中單糖組成的分析提供了新思路。

表1 不同來源的蜂花粉多糖的單糖組成及測定方法Table 1 Composition of monosaccharide and determination methods in bee pollen polysaccharides from different sources

4 蜂花粉多糖的生物活性研究

蜂花粉多糖由于來源豐富、種類繁多，近年來漸漸成為食品與藥品研究的熱點。其在抗腫瘤、抗氧化、降糖、降脂等多方面均表現(xiàn)出良好的生物活性（見圖1），極具開發(fā)和利用前景。

圖1 蜂花粉多糖生物活性Fig.1 Biological activity of polysaccharide from bee pollen

4.1 抗腫瘤作用

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全球有13%的人死于癌癥[45]。目前治療癌癥的放療與化療藥物均表現(xiàn)出極大的細胞毒性而致患者產(chǎn)生脫發(fā)、貧血等不良反應。據(jù)報道，天然多糖在一系列癌細胞系中除表現(xiàn)出良好的抗癌活性外，對惡性腫瘤患者的毒副作用較小，是一種新型的抗癌候選藥物[46?47]。王昀等[48]發(fā)現(xiàn)紅花蜂花粉多糖組分PBPC-Ⅱ?qū)DA -MB231細胞（人乳腺癌細胞）具有明顯的抑制作用，通過抑制C-myc、Bcl-2 基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達，增強P53、Bax基因及蛋白的表達，抑制MDA -MB231 細胞的生長并加速其凋亡。這也表明紅花蜂花粉多糖組分PBPC-Ⅱ可能是一種治療人類乳腺癌的潛在藥物。與此同時，研究人員進行了大量的動物模型試驗。發(fā)現(xiàn)枸杞蜂花粉多糖可顯著調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)Bax、Bcl-2的表達水平，活化Caspase-9 和Caspase-3[49]。這可能與癌細胞的線粒體凋亡途徑有關(guān)。即通過抑制PI3K/AKT 信號通路，降低線粒體膜電位，促進半胱氨酸蛋白酶（Caspase，引起細胞凋亡的活性物質(zhì)）生成，誘導癌細胞凋亡[50]。目前，這種信號通路的抑制劑已經(jīng)被認為是抗腫瘤潛在的候選藥物。此外，紅花蜂花粉多糖組分PBPC-Ⅰ對肝癌小鼠的抑癌作用也被證實[51]。其抗腫瘤機理被認為是多糖通過宿主免疫系統(tǒng)間接發(fā)揮其抗腫瘤作用，而不是通過直接細胞毒性。PBPC-Ⅰ能夠促進T細胞生長因子的分泌增強免疫細胞活性，保護免疫器官，調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平，進而調(diào)節(jié)Bcl-2、C-myc、Bax、P53 表達促進腫瘤細胞凋亡，間接抑制腫瘤的分裂增殖與生長。

4.2 抗氧化作用

許多疾病，如心血管疾病、代謝性疾病、退行性疾病（關(guān)節(jié)炎、帕金森氏病、阿爾茨海默?。┖湍承┠[瘤疾病均與機體氧化現(xiàn)象有關(guān)[52]。目前研究蜂花粉多糖的體外抗氧化活性，常采用如1,1 -二苯基-2-苦基肼法（DPPH）、鐵還原/抗氧化能力法（FRAP）和2,2 ' -阿茲諾比斯-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）法（ABTS）進行評定。王昀等[48]發(fā)現(xiàn)紅花蜂花粉多糖組分PBPC-Ⅱ?qū)αu自由基、超氧陰離子和 DPPH 均有清除作用，且在一定范圍內(nèi)隨著PBPC-Ⅱ濃度的增加其清除活性增強。同時，從枸杞蜂花粉中提取的多糖對 ABTS 和 DPPH 的清除作用也得到了證實[20]。值得注意的是，周望庭等[53]比較枸杞蜂花粉中水提物、水提醇沉上清液（多酚）和水提醇沉物（粗多糖）的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)三者均具有顯著的 ABTS 清除作用，與 VC對 ABTS 的最高清除率相比無顯著性差異。另外，粗多糖對 Fe2＋的螯合作用明顯較其余二者更強。這表明粗多糖中的其他因素，如蛋白質(zhì)、某些功能性基團以及多酚的含量可能在抗氧化活性中起到了一定作用。蜂花粉多糖在體外的抗氧化作用的機制仍不確定。

為進一步證明蜂花粉多糖抗氧化損傷的作用，近年來研究者還進行了一些動物試驗，發(fā)現(xiàn)云南產(chǎn)油菜蜂花粉多糖（RBPP）對CCl4建立的肝損傷小鼠模型具有良好的抗氧化作用，在明顯減輕肝損傷小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、細胞條索狀結(jié)構(gòu)解離、肝細胞水腫等現(xiàn)象的同時，RBPP 各劑量組均可增強CCl4所致急性肝損傷小鼠的抗氧化能力，使小鼠肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯回升、丙二醛（MDA，過氧化反應的最終產(chǎn)物）含量顯著下降，且高劑量組SOD 活性已恢復到了正常水平[54]。這表明蜂花粉多糖對小鼠氧化型肝損傷具有治療作用。此外，蜂花粉多糖還可以通過保護小鼠細胞膜免受脂質(zhì)過氧化反應的損傷、維持細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能、清除自由基以及提高小鼠體內(nèi)肝糖原和肌糖原含量，達到延緩小鼠紅細胞的衰老、提升機體抗疲勞能力的作用，防治氧化損傷[55?57]?？梢姺浠ǚ鄱嗵亲鳛榭寡趸幱没蚴秤锰烊惶砑觿┲档眠M一步研究。

4.3 降糖、降脂作用

山茶蜂花粉多糖能有效降低實驗性糖尿病小鼠的血糖值，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，但對正常小鼠的血糖值無影響[58]?？梢?，蜂花粉多糖對小鼠血糖值表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)的作用，又因其毒副作用極小、可長期使用，對輕、中度及老年性糖尿病的防治有一定的應用價值[59?60]。此外，蜂花粉多糖還可使糖尿病大鼠血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量下降。且高劑量蕎麥蜂花粉多糖（300 mg·kg?1·d?1）能使糖尿病模型大鼠的高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量明顯升高，表明蕎麥蜂花粉多糖能有效對抗四氧嘧啶（ALX）所致大鼠血脂代謝紊亂，其調(diào)脂作用接近或優(yōu)于陽性對照藥苯乙雙胍，對預防高血脂和動脈粥樣硬化也有一定作用[60]。

蜂花粉多糖也是一種可以用于治療肥胖的新型潛在藥物。宮海全等[61]發(fā)現(xiàn)，玫瑰蜂花粉酸性多糖可通過特異性激活飲食誘導肥胖小鼠AMPK/mTOR介導的自噬水平，顯著抑制脂質(zhì)堆積。

4.4 其他作用

4.4.1 抗菌和抗凝血作用 植物多糖對腸道微生物環(huán)境有積極影響[62?63]。枸杞蜂花粉多糖能顯著提高短鏈脂肪酸的產(chǎn)量，通過增加普雷沃菌屬、Dialister屬、巨單胞菌屬，減少類桿菌屬、梭狀芽孢菌屬、弗雷桿菌屬、大腸桿菌、志賀氏桿菌的數(shù)量調(diào)節(jié)腸道菌群[49]。此外，蜂花粉多糖對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和大腸埃希菌均有抑制作用[64]。

蜂花粉多糖的抗凝血作用主要表現(xiàn)在體外抗凝血。紅花蜂花粉多糖（PBPC-Ⅱ）能延長人體血漿APTT（活化部分凝血活酶時間）與PT（凝血酶原時間），且呈劑量依賴關(guān)系[35]。蜂花粉多糖的抗菌及抗凝血活性雖不及臨床常規(guī)藥物（青霉素和肝素），但其來源于天然產(chǎn)物，具有低毒、安全、低耐藥性等特點，具有良好的應用前景。

4.4.2 應用于家禽飼料的作用 有研究表明蜂花粉多糖作為飼料飼喂肉雞可以促進肉雞的肝、胰腺、小腸腺等免疫器官的生長發(fā)育，提高肉雞的免疫器官指數(shù)（免疫器官重量/活雞重），增強肉雞的消化功能和代謝功能[65]。此外，蜂花粉多糖對家禽生長速度也有一定促進作用[66]，但對其體態(tài)結(jié)構(gòu)的性狀影響不大[67]。

5 結(jié)論及展望

有研究者利用體外抗氧化活性實驗對比多糖中不同成分的生物活性，經(jīng)傅立葉變換紅外光譜（FTIR）發(fā)現(xiàn)多糖較強的抗氧化活性和肝保護作用均由其特殊的單糖組成C-O-Se 鍵型決定[68]。可見，闡明多糖的結(jié)構(gòu)特征對探索多糖結(jié)構(gòu)與生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系具有重要的意義。但蜂花粉多糖結(jié)構(gòu)復雜，其復雜性不僅僅只體現(xiàn)在其種類繁多上，多糖鏈間的連接方式和糖基構(gòu)型的差異也對蜂花粉多糖的結(jié)構(gòu)分析造成了困難。因此，蜂花粉多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性的構(gòu)效關(guān)系有待進一步發(fā)展。此外，人們對蜂花粉多糖的許多藥理作用及其機理的研究并不深入，藥物代謝動力學數(shù)據(jù)缺失嚴重，關(guān)于蜂花粉多糖的質(zhì)量標準也尚不完善。為了更好的開發(fā)蜂花粉多糖類產(chǎn)品，臨床應用試驗和對蜂花粉多糖的結(jié)構(gòu)分析仍然是目前發(fā)展的重點。