郝雪斌 牛秀嶺 張海成 邵小秦 張春霞 王英/金宇保靈生物藥品有限公司 010100

弓艷春/內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 010051

BVD 和IBR 均為OIE 法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，在我國(guó)分別為三類和二類動(dòng)物疫病，嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)的安全。該病的根治方法是陽(yáng)性牛檢出與捕殺，而預(yù)防的主要措施是接種疫苗。國(guó)外已有大量BVD 和IBR 的商品化單苗或聯(lián)苗，但國(guó)內(nèi)由于起步較晚，對(duì)該兩種疾病未引起足夠重視，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所與金宇保靈生物藥品有限公司聯(lián)合研制的牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗實(shí)現(xiàn)了兩種病同時(shí)預(yù)防接種技術(shù)，解決目前國(guó)內(nèi)無(wú)疫苗的現(xiàn)實(shí)難題。針對(duì)目前BVD 和IBR 較為嚴(yán)重的流行形勢(shì)，采用流行優(yōu)勢(shì)毒株制備安全高效的滅活疫苗應(yīng)為防控這兩種疾病的首選。對(duì)其免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而確定免疫評(píng)價(jià)方法，指導(dǎo)疫苗使用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 疫苗牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗（BVDV/NMG 株+IBRV/LY 株）3 批（批號(hào)：S19001、S19002、S19003）。由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物2～6月齡健康易感牛（BVDV 血清中和抗體效價(jià)不高于1∶2 或ELISA 抗體陰性、IBRV 血清中和抗體效價(jià)不高于1∶2 或ELISA 抗體陰性、BVDV 抗原陰性、IBRV 抗原陰性）100 頭，購(gòu)于錫林郭勒盟正藍(lán)旗和包頭市達(dá)茂旗。

1.1.3 檢測(cè)試劑盒、試劑BVDV 間接免疫熒光試劑盒購(gòu)至中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

BVDV PCR 引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為288bp。

1.1.4 細(xì)胞中和試驗(yàn)用細(xì)胞和抗原MDBK 傳代細(xì)胞，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

BVDV 中和試驗(yàn)用病毒，為NMG 株：病毒含量為107.5TCID50/ml。由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

IBRV 中和試驗(yàn)用病毒，為L(zhǎng)Y 株中和毒：病毒含量為108.0TCID50/mL。由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.1.5 試驗(yàn)器材96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液器及配套尖頭、二氧化碳培養(yǎng)箱、1.5～2mL 離心管及架子、倒置顯微鏡、生物安全柜，旋渦混合器、德國(guó)BiometraPCR 擴(kuò)增儀、Tanon-1600 凝膠成像系統(tǒng)、DYY-6C 電泳儀等均由金宇保靈生物藥品有限公司檢測(cè)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫每批試驗(yàn)疫苗免疫30 頭2～6 月齡健康易感牛（BVDV 血清中和抗體效價(jià)不高于1 ∶2 或ELISA 抗體陰性、IBRV 血清中和抗體效價(jià)不高于1 ∶2 或ELISA 抗體陰性、BVDV 抗原陰性、IBRV 抗原陰性），每頭牛頸部肌肉注射2mL 疫苗。3 批疫苗共免疫90 頭牛，并同條件飼養(yǎng)陰性對(duì)照試驗(yàn)牛10 頭。初免后21d，以相同免疫劑量和免疫途徑進(jìn)行二免。

1.2.2 采血及抗體檢測(cè)各批次免疫牛分別在一免14 日、21 日和二免后14 日、21 日、60 日、90 日、120 日、150 日、180 日分別采血分離血清檢測(cè)中和抗體。

1.2.3 BVDV、IBRV 血清中和抗體測(cè)定

（1）材料待檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清、病毒液、含2%新生牛血清的DMEM 細(xì)胞維持液、胰酶-EDTA 消化液、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液器及配套尖頭、二氧化碳培養(yǎng)箱、1.5～2mL 離心管及架子、倒置顯微鏡、生物安全柜，旋渦混合器等。

（2）操作程序

1）血清滅活用前將待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清經(jīng)56℃熱滅活30min。

2）血清稀釋用含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基對(duì)滅活后的待檢樣品在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)版中進(jìn)行2 倍系列稀釋，每份血清加4 孔，每孔50μL。標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性對(duì)照血清根據(jù)實(shí)際效價(jià)進(jìn)行適當(dāng)稀釋（一般作1 ∶2 稀釋）。

3）中和用病毒稀釋用含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將中和用病毒稀釋到200TCID50/0.1mL。

4）中和向每份血清樣品的每個(gè)稀釋度中加入50μL 中和病毒工作液，振搖混勻后，置37℃中和1h，期間振搖2～3 次。

5）加細(xì)胞懸液將生長(zhǎng)成良好單層的MDBK 細(xì)胞用胰酶-EDTA 消化液消化分散后，用生長(zhǎng)液配制成含20 萬(wàn)/mL 的細(xì)胞懸液同步加到血清-病毒中和孔中，每孔100μL。加樣完成后做好標(biāo)記，然后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3日。

6）試驗(yàn)需做下列對(duì)照：

陽(yáng)性血清對(duì)照：2 倍稀釋血清50μL +中和病毒工作液50μL +細(xì)胞懸液100μL。

陰性血清對(duì)照：2 倍稀釋血清5L0μL+中和病毒工作液50μL +細(xì)胞懸液100μL。

正常細(xì)胞對(duì)照：細(xì)胞懸液100μL+維持液100μL。

血清毒性對(duì)照：2 倍稀釋血清50μL+維持液50μLl +細(xì)胞懸液100μL。

中和病毒對(duì)照：中和病毒工作液50μL+稀釋液50μL +細(xì)胞懸液100μL。

7）結(jié)果判定

每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞孔是否出現(xiàn)CPE，統(tǒng)計(jì)待檢血清病變孔數(shù)，按Reed-Muench 法計(jì)算血清中和抗體效價(jià)。試驗(yàn)成立條件為：中和病毒對(duì)照、陰性血清對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)CPE，血清毒性對(duì)照應(yīng)無(wú)血清毒性，陽(yáng)性血清對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照應(yīng)不出現(xiàn)CPE。

2 結(jié)果

2.1 免疫后牛不同時(shí)間BVDV 中和抗體滴度測(cè)定結(jié)果由表1、2 和圖1 可知，3 批疫苗二免后21日BVDV 和IBRV 抗體滴度達(dá)到最高峰并維持至90 日，比二免后其他時(shí)間段抗體滴度高，二免后180 日（6 個(gè)月）時(shí)BVDV 中和抗體滴度大于1:128在50%以上，顯示二聯(lián)滅活疫苗BVD 部分免疫原性良好。

表1 二免后牛不同時(shí)間BVDV 中和抗體滴度大于1 ∶128 比例

表2 二免后牛不同時(shí)間BVDV 中和抗體效價(jià)平均值（log2）

圖1 二免后牛不同時(shí)間BVDV 中和抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律

2.2 免疫后牛不同時(shí)間IBRV 中和抗體滴度測(cè)定結(jié)果由表3、4 和圖2 可知，3 批疫苗二免后21 日IBRV 抗體滴度達(dá)到最高峰并維持至90 日，比二免后其他時(shí)間段抗體滴度高，二免后180 日（6 個(gè)月）時(shí)IBRV 抗體中和抗體滴度大于1:64在55%以上，也顯示二聯(lián)滅活疫苗IBR 免疫原性良好。

表3 二免后不同時(shí)間IBRV 中和抗體滴度大于1 ∶64 比例

表4 二免后牛不同時(shí)間IBRV 中和抗體效價(jià)平均值（log2）

圖2 二免后牛不同時(shí)間IBRV 中和抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律

3 討論

試驗(yàn)牛在免疫以后未出現(xiàn)精神食欲異常和其他不良反應(yīng)，說(shuō)明疫苗使用安全，也反映出疫苗制備工藝中抗原純化徹底和熱源物質(zhì)控制嚴(yán)格。

通過(guò)牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗免疫后不同時(shí)間BVD 和IBR 中和抗體檢測(cè)表明，BVD 和IBR中和抗體在一免后14 日和21 日均不能達(dá)到較高的中和抗體滴度，只有進(jìn)行二免才可以達(dá)到較高中和抗體滴度。從中和抗體達(dá)到高峰的時(shí)間分析，BVD 和IBR 兩種抗原在牛體免疫應(yīng)答并未互相拮抗，均在二免后21 日出現(xiàn)中和抗體高峰，與趙月蘭等2009 年制備牛病毒性腹瀉油乳劑滅活苗免疫效果評(píng)價(jià)和冷雪等2010 年評(píng)價(jià)牛傳染性鼻氣管炎滅活疫苗效力時(shí)抗體達(dá)到高滴度時(shí)間是一致的。并且高抗體滴度持續(xù)6月以上，此結(jié)論與1982 年Joseph R.Kolar 等完成的實(shí)驗(yàn)結(jié)論也是一致的。表明該二聯(lián)滅活苗二免后維持6 月以上的高中和抗體水平是有保障的。

通過(guò)牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗免疫后不同時(shí)間BVD 和IBR 中和抗體滴度消長(zhǎng)分析，從一次免疫后14 日中和抗體檢測(cè)表明IBR 產(chǎn)生中和抗體比BVD產(chǎn)生中和抗體要高，且中和抗體滴度IBR 比BVD 高一個(gè)滴度。二次免疫后21 日檢測(cè)表明BVD 和IBR 中和抗體滴度均達(dá)到1:128 以上，并維持90d 左右逐漸下降，值得注意的是在中和抗體滴度下降過(guò)程中發(fā)現(xiàn)IBR 中和抗體下降速度快于BVD 中和抗體下降速度。說(shuō)明免疫牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗后產(chǎn)生抵御IBR 感染的中和抗體比抵御BVD 感染的中和的抗體產(chǎn)生更快，但BVD 中和抗體高滴度持續(xù)時(shí)間比IBR 長(zhǎng)。

4 結(jié)論

牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗（BVDV/NMG 株+IBRV/LY 株）免疫牛后，一免后14 日產(chǎn)生抗體，二免后21 日平均抗體滴度達(dá)到最高值并維持至少90 日，隨時(shí)間延續(xù)抗體滴度逐步下降，到120 日時(shí)BVDV 中和抗體不低于1 ∶128 和IBRV 中和抗體不低于1 ∶64 在80%以上，180 日時(shí)BVDV 中和抗體不低于1 ∶128 在50%以上，IBRV 中和抗體不低于1 ∶64 在55%以上。說(shuō)明該疫苗兩次免疫后牛維持較高BVDV 和IBRV 中和抗體至少6 個(gè)月，可以指導(dǎo)牛場(chǎng)免疫程序的制定，保護(hù)牛免受BVDV 和IBRV感染，提高牛場(chǎng)經(jīng)營(yíng)效益。