鄭朝朝 鄒立宏 劉思桐 郁宏偉 趙玉龍 張新新/瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司 河北保定071000

雞滑液囊支原體（Mycoplasma Synoviae，MS）主要侵害商品肉雞、蛋雞或種雞，引起關(guān)節(jié)滲出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎，是除雞毒支原體之外另一種引起家禽疾病的重要支原體病原，給國(guó)內(nèi)外養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了很大的危害。雞滑液囊支原體病主要通過疫苗免疫和抗菌藥物進(jìn)行控制，目前我國(guó)主要依靠抗菌藥物控制該病。

本實(shí)驗(yàn)旨在篩選敏感的抗菌藥物，為該發(fā)病蛋雞場(chǎng)合理用藥提供依據(jù)，對(duì)分離株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為開發(fā)雞滑液囊支原體疫苗提供材料。

1 材料

1.1 抗菌藥物抗菌藥物原粉均由瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，MS 檢驗(yàn)用菌株均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2 方法

2.1 診斷2018 年，保定某中小型蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)，30%雞只發(fā)生跛行、癱瘓，采食量、產(chǎn)蛋量明顯下降，經(jīng)了解未免疫雞滑液囊支原體疫苗，疑似發(fā)生雞滑液囊支原體疫情。用IDEXX 雞滑液囊支原體抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)雞群ELISA 抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 病料采集及分離培養(yǎng)無(wú)菌采集附關(guān)節(jié)內(nèi)容物和爪墊內(nèi)容物，置于改良Frey 氏液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)基顏色變黃后，接種到新的液體培養(yǎng)基中，穩(wěn)定傳代3 次。

將培養(yǎng)液接種到改良Frey 氏固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7d，每天觀察。待低倍顯微鏡下發(fā)現(xiàn)典型支原體菌落，挑取單個(gè)菌落接種至改良Frey 氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至顏色變黃。

2.3 分離鑒定

2.3.1 雞紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)取雞紅細(xì)胞懸液加入已培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)基表面，室溫下作用20min 后棄去，生理鹽水洗滌2 次，在低倍顯微鏡下觀察菌落表面有無(wú)紅細(xì)胞吸附。

2.3.2 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的菌液經(jīng)12000rpm，30min 離心收集管底菌泥進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)。

2.3.3 代謝抑制試驗(yàn)

2.3.3.1 菌液稀釋 將培養(yǎng)的菌液用改良Frey 氏液體培養(yǎng)基稀釋1000 倍后備用。

2.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清稀釋 取1ml 標(biāo)準(zhǔn)MS 陽(yáng)性血清，用Frey 氏液體培養(yǎng)基進(jìn)行2 倍梯度稀釋至第10 管，第10 管棄去1ml 混合液。

2.3.3.3 培養(yǎng) 將稀釋后菌液加至稀釋后陽(yáng)性血清中，1ml/管，混合均勻后置于37℃培養(yǎng)，每天觀察、記錄培養(yǎng)液顏色變化。

2.3.2.4 對(duì)照設(shè)置 設(shè)置菌液滴度測(cè)定對(duì)照管。

2.3.4 PCR 擴(kuò)增VlhA 基因根據(jù)GenBank 中基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物，預(yù)期片段大小為773kb。試劑盒法提取模板DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

2.3.5 雞胚感染實(shí)驗(yàn)取培養(yǎng)的菌液經(jīng)卵黃囊接種5 枚7日齡SPF 雞胚，0.2ml/胚。另設(shè)5 枚SPF 雞胚作為陰性對(duì)照。置37℃孵化器內(nèi)繼續(xù)孵化，每日觀察并記錄雞胚死亡情況。

2.3.6 人工感染致病性實(shí)驗(yàn)取培養(yǎng)的菌液經(jīng)爪墊接種5只40 日齡SPF 雞，每只接種0.2ml。另設(shè)5 只SPF 雞注射改良Frey 氏液體培養(yǎng)基做為陰性對(duì)照。

2.4 免疫原性實(shí)驗(yàn)和本動(dòng)物攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)分離菌培養(yǎng)物滅活后制備成疫苗，備用。

分離菌制苗后接種21 日齡SPF 雞10 只，頸部皮下注射，0.5ml/只，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照、攻毒對(duì)照各10 只。

免疫后4w 測(cè)定血清抗體，免疫后30d，連同對(duì)照組每雞右腳墊注射0.2ml×106.0CCU 該分離株活菌，隔離飼養(yǎng)觀察14d，判定攻毒保護(hù)率。

2.5 抗菌藥物最小抑菌濃度測(cè)定

2.5.1 抗菌藥物稀釋配制各管抗菌藥物濃度分別為10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.1563μg/ml、0.0781μg/ml、0.0391μg/ml、0.0195μg/ml。

2.5.2 菌液稀釋將培養(yǎng)的菌液用改良Frey 氏液體培養(yǎng)基稀釋1000 倍備用。

2.5.3 最小抑菌濃度測(cè)定將稀釋后菌液加至稀釋后抗菌藥物中，1ml/管，混合均勻后置于37℃培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)液顏色變化，直至第10d。

2.5.4 對(duì)照設(shè)置設(shè)置菌液滴度測(cè)定管。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床診斷ELISA 抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，抽檢的96 份血清樣本中有78 份呈現(xiàn)陽(yáng)性，雞滑液囊支原體抗體陽(yáng)性率高于80%。

該雞場(chǎng)病雞狀態(tài)和病變符合雞滑液囊支原體發(fā)病特點(diǎn)，未進(jìn)行免疫情況下ELISA 抗體陽(yáng)性率高于80%，初步確定該場(chǎng)發(fā)生雞滑液囊支原體疫情。

3.2 病料采集及分離鑒定分離菌經(jīng)瑞氏染色在油鏡下呈圓形或橢圓形，固體培養(yǎng)基上菌落表現(xiàn)為細(xì)小、光滑、半凹陷于培養(yǎng)基內(nèi)，低倍鏡下觀察到菌落形態(tài)為特征性的“煎蛋狀”。

3.2.1 雞紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)分離菌菌落與紅細(xì)胞作用、鹽水洗滌后，在低倍顯微鏡下可見菌落表面有紅細(xì)胞吸附。

3.2.2 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)平板凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌能與MS 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生凝集反應(yīng)，而與MG 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清不發(fā)生凝集反應(yīng)。血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明該分離菌為雞滑液囊支原體。

3.2.3 代謝抑制試驗(yàn)培養(yǎng)至第5d，代謝抑制試驗(yàn)對(duì)照管的培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，菌液滴度對(duì)照管第6 管變?yōu)辄S色，血清對(duì)照管培養(yǎng)液顏色無(wú)變化，加有抗血清的第7 管變?yōu)辄S色，其余3 管未變色。

培養(yǎng)至第7d，菌液滴度對(duì)照管第9 管變?yōu)辄S色，血清對(duì)照管培養(yǎng)液顏色無(wú)變化，加有抗血清的第7 管為黃色，其余3 管未變色。

該分離菌的代謝抑制效價(jià)為128。

3.2.4 PCR 擴(kuò)增Vlh A 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示分離株和檢驗(yàn)用株均能擴(kuò)增出特異性的目的片段，大小約773bp，而MG-CR 株未能擴(kuò)增出任何條帶。（圖4）

圖4 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

測(cè)序結(jié)果顯示，分離菌株與NCBI 登陸的基因同源性為90%。

3.2.5 雞胚感染實(shí)驗(yàn)接種該分離菌的SPF 雞胚于120～144h 全部死亡，對(duì)照組正常。卵黃液PCR 可擴(kuò)增出特異性片段。

3.2.6 人工感染實(shí)驗(yàn)接種該分離株的5 只SPF 雞均出現(xiàn)特征性病變：爪墊腫脹突出，剪開后有淡黃色黏性滲出物，PCR 能擴(kuò)增出雞滑液囊支原體預(yù)期大小的片段。對(duì)照組SPF雞后食欲正常，關(guān)節(jié)處均未見腫脹。

3.3 免疫原性實(shí)驗(yàn)和本動(dòng)物攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)抗體檢測(cè)結(jié)果顯示：免疫后2 周血清MS 抗體陽(yáng)性率30%，免疫后3 周血清MS 抗體陽(yáng)性率50%，免疫后4 周血清抗體陽(yáng)性率為100%。

攻毒保護(hù)結(jié)果顯示：攻毒對(duì)照組攻毒后6d 開始個(gè)別雞只跗骨、胸骨腫脹，免疫組無(wú)明顯眼觀變化。攻毒后14d，攻毒對(duì)照組7/10 發(fā)病，免疫組3/10 發(fā)病。（表1）

表1 分離株制苗后免疫原性

3.4 抗菌藥物最小抑菌濃度測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：稀釋前菌液滴度為109.0CCU，陽(yáng)性對(duì)照管于培養(yǎng)第4d 全部變色，而陰性對(duì)照管培養(yǎng)至第10d 未變色；抗菌藥物的實(shí)驗(yàn)管不同程度變色。

表2 各抗生素對(duì)分離株最小抑菌濃度

上述結(jié)果顯示該分離菌對(duì)沃尼妙林敏感性最高，MIC 約為0.0195μg/ml；對(duì)林可大觀、泰萬(wàn)菌素、泰妙菌素、泰樂菌素較為敏感；而對(duì)氟苯尼考、替米考星和恩諾沙星有耐受。

4 討論

本研究對(duì)病雞跗關(guān)節(jié)、爪墊滲出液樣品進(jìn)病原分離鑒定，分離菌在固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為特征性＂煎蛋狀”，結(jié)合進(jìn)一步的紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、代謝抑制試驗(yàn)、PCR擴(kuò)增及人工感染試驗(yàn)確診為雞滑液囊支原體。

本研究中分離的MS 菌株對(duì)SPF 雞有較強(qiáng)的致病性，動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)可致SPF 雞出現(xiàn)典型的臨床癥狀，將此分離株制備成滅活疫苗對(duì)攻毒有7/10 保護(hù)，可做為MS 疫苗株候選株。

本研究對(duì)分離菌株選用了8 種抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，對(duì)臨床防治雞滑液囊支原體有重要的指導(dǎo)意義?！?/p>