王 杰,徐嘉偉,楊寶輝,李浩鵬

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨二科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:lhp-3993@163.com)

近年來,隨著醫(yī)療水平及材料科技水平的提高,對于骨科種植體的量的需求及質(zhì)的需求也日益提高?，F(xiàn)階段臨床中,在骨科種植體應(yīng)用最為廣泛的材料當(dāng)屬Ti-6Al-4V鈦合金。Ti-6Al-4V鈦合金由于其良好的生物相容性和力學(xué)性能而被廣泛應(yīng)用于負(fù)重骨的大空隙填充物和關(guān)節(jié)假體的制造[1,2]。但是,在臨床實際應(yīng)用過程中,鈦合金種植體材料仍存在些許不足之處,如偶爾可出現(xiàn)與骨組織融合遲緩,甚至是融合失敗的現(xiàn)象,從而導(dǎo)致骨科種植體手術(shù)失敗等。從種植體設(shè)計的角度來看,強調(diào)種植體的幾何形狀、表面修飾、生物功能化和促血管系統(tǒng)的形成對提高功能性骨再生和延長種植體壽命具有重要意義[3-6]。因此,本研究團隊設(shè)計利用噴砂表面改性技術(shù)對鈦合金材料表面進行改性處理,從而希望能夠進一步提高鈦合金材料的生物相容性,進而減少和避免鈦合金種植體與骨組織融合遲緩甚至是融合失敗的發(fā)生。應(yīng)用新技術(shù)對鈦合金種植體材料表面進行處理并期望其能夠應(yīng)用于臨床,這勢必需要對經(jīng)表面處理的鈦合金材料進行生物毒性的檢測,以及探究其對細(xì)胞黏附、增殖及分化的影響。因此,本實驗旨在研究以噴砂表面改性技術(shù)制備出的鈦合金種植體對成骨細(xì)胞黏附、增殖以及分化的影響,以此為骨科種植體材料的發(fā)展及臨床實際應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Ti-6Al-4V鈦合金片(φ10 mm×1 mm)(西北有色金屬研究院,中國,西安)、鈦砂(西北有色金屬研究院,中國,西安)、砂紙(上海蕓博檢測技術(shù)有限公司,中國,上海)、胰酶(武漢普諾賽生命科技有限公司,中國,武漢)、戊巴比妥鈉(北京邁瑞達(dá)科技有限公司,中國,北京)、雙抗溶液(上海素爾生物科技有限公司,中國,上海)、Ⅱ型膠原酶(上海澤葉生物科技有限公司,中國,上海)、MTT溶液(北京索萊寶科技有限公司,中國,北京)、DMSO(北京索萊寶科技有限公司,中國,北京)、0.5%結(jié)晶紫溶液(北京索萊寶科技有限公司,中國,北京)、甲醇(南京森貝伽生物科技有限公司,中國,南京)、10%醋酸(南京森貝伽生物科技有限公司,中國,南京)、TritonX-100裂解液(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司,中國,上海)、ALP活性檢測試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,中國,北京)。

1.2 儀器設(shè)備

多用噴砂機(銘輝噴砂機械有限公司,中國,東莞);超凈工作臺(蘇凈安泰公司,中國,南通);Primo vert倒置相差顯微鏡(Carl Zeiss AG公司,德國,耶拿);MCP-17AIC二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(SANYO公司,日本,大阪);SC-3610低速離心機(武漢華科達(dá)實驗設(shè)備有限公司,中國,武漢)。

1.3 樣品制備

將Ti-6Al-4V鈦合金片表面經(jīng)500目、1 000目、1 500目和2 000目砂紙逐步打磨拋光,然后置于蒸餾水中超聲蕩洗20 min,再放入多用噴砂機中進行表面噴砂改性處理,制備出噴砂表面鈦合金樣品,以此作為實驗組,記為噴砂處理組。將Ti-6Al-4V鈦合金片表面經(jīng)500目、1 000目、1 500目和2 000目砂紙逐步打磨拋光,然后置于蒸餾水中超聲蕩洗20 min,后進行干燥處理,以此作為對照組,記為Ti-6Al-4V對照組。

1.4 掃描電鏡觀察鈦合金樣品表面

利用導(dǎo)電膠將兩組鈦合金樣品分別固定在樣品臺上,進行噴金處理后在掃描電鏡下進行鈦合金樣品表面形態(tài)觀察。

1.5 兔成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)

取2月齡日本大耳白兔(1.5-2 kg)，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心提供。耳緣靜脈注射過量戊巴比妥鈉致死，備皮并消毒兔髂骨區(qū)域，仔細(xì)操作分離兔髂骨，去除肌肉軟組織及表面骨膜結(jié)締組織，置于雙抗溶液中浸泡5 min，后將髂骨移至無菌操作臺中，將髂骨剪碎成2 mm×2 mm×2 mm的小塊，然后再次置于雙抗溶液中浸泡5 min，后過濾除去雙抗溶液并以PBS沖洗3次。之后轉(zhuǎn)移至裝有5 ml胰酶的15 ml離心管，37 ℃水浴消化30 min，并且每10 min震蕩1次。棄上清，在離心管中加入0.1% Ⅱ型膠原酶10 ml，37 ℃消化40 min，期間每10 min震蕩1次，留取上清液，以1 000 r/min，10 min條件進行離心處理，重懸后接種至培養(yǎng)瓶中，加入成骨細(xì)胞培養(yǎng)基并放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3 d換液1次。

1.6 掃描電鏡觀察共培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)

成骨細(xì)胞按5×104/ml的密度分別接種于兩組鈦合金樣品表面,之后便放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3,7 d。之后用PBS清洗2-3遍,進行固定、脫水處理后噴金觀察。

1.7 MTT比色法實驗檢測細(xì)胞毒性

成骨細(xì)胞按5×104/ml的密度分別接種于兩組鈦合金樣品表面,待上述兩組鈦合金共培養(yǎng)兔成骨細(xì)胞培養(yǎng)至1,4,7 d后,用0.25%胰蛋白酶將其消化,并用移液槍進行吹打處理,重懸制得細(xì)胞懸液并接種至96孔板中。并將單獨經(jīng)成骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的成骨細(xì)胞也按照上述時間點培養(yǎng)作為MTT比色法實驗的空白對照。之后每孔加入20 μl MTT(5 g/L),繼續(xù)放入恒溫箱中培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加150 μl DMSO。室溫下震蕩15 min,調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀設(shè)置波長為490 nm,檢測吸光度(OD)值。實驗重復(fù)3次,最終實驗數(shù)據(jù)取3次實驗數(shù)據(jù)的平均值。細(xì)胞相對增殖率=(實驗組OD值均值/空白對照組OD值均值)×100%。根據(jù)細(xì)胞相對增殖率將細(xì)胞毒性分為5級:80%-100%為0級;60%-80%為1級;40%-60%為2級;20%-40%為3級;0-20%為4級。根據(jù)5級細(xì)胞毒性標(biāo)準(zhǔn)分級,對檢測結(jié)果進行分級。

1.8 結(jié)晶紫染色實驗檢測細(xì)胞黏附

成骨細(xì)胞按5×104/ml的密度接種于兩組鈦合金樣品表面,培養(yǎng)12,24 h后,去除培養(yǎng)基并用PBS清洗,用冰甲醇固定20 min,PBS清洗20 min,之后加入0.5%結(jié)晶紫溶液(含20%甲醇)染色30 min,此后去離子水清洗3次,10%醋酸洗脫,調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀設(shè)置波長為490 nm,檢測吸光度(OD)值。OD值與細(xì)胞黏附呈正相關(guān)關(guān)系,因此可以借助檢測細(xì)胞的OD值間接評估樣品表面的細(xì)胞黏附情況。

1.9 細(xì)胞成骨分化的ALP活性檢測

成骨細(xì)胞按5×104/ml的密度接種于兩組鈦合金樣品表面,成骨細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)1,4,7 d,TritonX-100裂解液裂解處理1 h,取上清液離心,按照ALP活性檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,采用單因素方差分析及LSD檢驗,兩組間計量資料的差異比較采用兩獨立樣本t檢驗分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料樣品展示

Ti-6Al-4V對照組樣品,肉眼觀察可見樣品表面光滑,無劃痕(見圖1A);噴砂處理組樣品,肉眼觀察可見樣品表面較粗糙(見圖1B)。

A.Ti-6Al-4V對照組 B.噴砂處理組圖1 鈦合金種植體實驗片F(xiàn)igure 1 Specimens of titanium alloy implants

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果

Ti-6Al-4V對照組樣品表面呈現(xiàn)出光滑表面,散在分布有細(xì)小不規(guī)則隆起(見圖2A);噴砂處理組樣品表面呈現(xiàn)出“疊瓦”樣的不規(guī)則隆起,其表面相較Ti-6Al-4V對照組樣品表面而言較為粗糙(見圖2B)。

圖2 鈦合金種植體表面形貌的掃描電鏡觀察Figure 2 Surfaces of titanium alloy implants under scanning electron microscopy

2.3 原代培養(yǎng)兔成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

待兔成骨細(xì)胞培育至48 h后,觀察發(fā)現(xiàn)兔成骨細(xì)胞貼壁生長,折光性強。鏡下細(xì)胞形態(tài)主要呈現(xiàn)出梭形和多邊形,細(xì)胞輪廓清晰,生長良好,排列較為緊密規(guī)則(見圖3)。

圖3 兔成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 (×100)Figure 3 Morphology of rabbit osteoblasts (×100)

2.4 掃描電鏡觀察共培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)

觀察在兩組鈦合金樣品表面接種3 d的成骨細(xì)胞,細(xì)胞體部下存在有陰影,Ti-6Al-4V對照組樣品表面的成骨細(xì)胞貼附成長,有少量的絲狀偽足生出;噴砂處理組樣品表面的成骨細(xì)胞貼附生長,有較多的絲狀偽足生出并且偽足相互之間有連接(見圖4)。在兩組鈦合金樣品表面接種7 d的成骨細(xì)胞數(shù)量有了一定的增長,Ti-6Al-4V對照組樣品表面的成骨細(xì)胞的絲狀偽足生出數(shù)目有所增加,并且相互之間連接成網(wǎng)狀;噴砂處理組樣品表面的成骨細(xì)胞的絲狀偽足大量生長,并且連接成近乎片狀分布,有向著生長為細(xì)胞集落的趨勢發(fā)展(見圖4)。

2.5 MTT實驗結(jié)果

在第1,4,7天,三組間成骨細(xì)胞種植后的OD值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。噴砂處理組鈦合金種植體實驗片在第1,4,7天的細(xì)胞相對增殖率分別為(91.98±1.21)%、(95.09±1.62)%以及(97.07±1.72)%;而Ti-6Al-4V對照組鈦合金種植體實驗片在第1,4,7天的細(xì)胞相對增殖率分別為(88.17±1.13)%、(91.03±1.33)%及(93.56±1.67)%,兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。噴砂處理組和Ti-6Al-4V對照組鈦合金種植體實驗片在第1,4,7天的細(xì)胞毒性標(biāo)準(zhǔn)分級均為0級。并且經(jīng)兩獨立樣本t檢驗分析,噴砂處理組鈦合金種植體實驗片的兔成骨細(xì)胞增殖率高于Ti-6Al-4V對照組,兩組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

表1 三組成骨細(xì)胞種植后的OD數(shù)值對比表Table 1 Comparison of OD values of osteocytes after

與Ti-6Al-4V對照組相比,*P<0.05圖5 MTT比色法檢測細(xì)胞相對增殖率柱形圖Figure 5 Relative cell proliferation rate by MTT colorimetry

2.6 結(jié)晶紫染色實驗檢測細(xì)胞黏附效果

由于細(xì)胞的OD值與細(xì)胞黏附呈正相關(guān)關(guān)系,因此可以借助檢測細(xì)胞的OD值間接評估樣品表面的細(xì)胞黏附情況。成骨細(xì)胞接種于兩組鈦合金材料表面培養(yǎng)12 h和24 h,噴砂處理組表面的細(xì)胞OD值高于Ti-6Al-4V對照組(P<0.05,見圖6),因此,可以認(rèn)為噴砂處理組表面的細(xì)胞黏附效果優(yōu)于Ti-6Al-4V對照組,噴砂處理可以增強成骨細(xì)胞黏附效果。

與Ti-6Al-4V對照組相比,*P<0.05圖6 結(jié)晶紫染色實驗檢測細(xì)胞黏附效果Figure 6 The cell adhesion detected by crystal violet staining assay

2.7 細(xì)胞成骨分化的ALP活性檢測

噴砂處理組在第1,4,7天的ALP活性均高于Ti-6Al-4V對照組(P<0.05,見圖7),并且,噴砂處理組相較Ti-6Al-4V對照組在第4天和第7天均顯示出更為明顯的ALP活性優(yōu)勢。這提示噴砂處理組的成骨分化活性高于Ti-6Al-4V對照組。

與Ti-6Al-4V對照組相比,*P<0.05圖7 噴砂處理組和Ti-6Al-4V對照組ALP活性比較Figure 7 Comparison of ALP activity between sandblasting treatment group and Ti-6Al-4V control group

3 討論

噴砂表面改性處理技術(shù)可以在材料表面形成一層薄的噴砂材質(zhì)涂層,以改變被處理材料的表面形貌特征。本研究將噴砂表面改性處理技術(shù)應(yīng)用至鈦合金種植體制備過程中,在鈦合金種植體表面形成一層噴砂涂層,以改變鈦合金種植體的表面形貌特征。本研究對兩組鈦合金種植體材料樣品表面進行電鏡掃描檢測發(fā)現(xiàn),與Ti-6Al-4V對照組相比,噴砂處理組鈦合金種植體樣品表面形貌明顯更為粗糙。細(xì)胞在材料表面的黏附、生長與材料的表面理化性質(zhì)有關(guān),尤其是與材料表面的形貌特征相關(guān),粗糙的表面往往有利于細(xì)胞的黏附及生長[7-10]。本研究通過電鏡掃描觀察兩組共培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、MTT實驗及結(jié)晶紫染色實驗發(fā)現(xiàn),噴砂處理組鈦合金種植體樣品并未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性,并且噴砂處理組鈦合金種植體樣品表面的成骨細(xì)胞黏附及生長狀況明顯優(yōu)于Ti-6Al-4V對照組,這說明經(jīng)過噴砂表面改性處理可以明顯促進成骨細(xì)胞的黏附及生長。究其原因,本研究分析這是由于噴砂表面改性處理改變了原有鈦合金種植體材料的表面形貌,即增加了粗糙程度,從而促進了細(xì)胞的黏附與生長,這也與以往的研究結(jié)論[11-13]相一致。材料表面粗糙的形貌特征在一定程度上可以促進成骨細(xì)胞的生長與分化[14-19]。而成骨細(xì)胞的生長、分化與成骨細(xì)胞所分泌的ALP密切相關(guān),ALP在成骨細(xì)胞的生長、分化及以后的礦化過程中起到了極其重要的作用,在一定程度上可以促進成骨細(xì)胞的生長、分化[20-23]。本研究通過對兩組共培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的ALP活性進行檢測發(fā)現(xiàn),噴砂處理組鈦合金種植體樣品表面的成骨細(xì)胞的ALP活性明顯高于Ti-6Al-4V對照組,這提示噴砂表面改性處理可以通過提高成骨細(xì)胞的ALP的活性,間接促進成骨細(xì)胞的生長及分化。而噴砂表面改性處理之所以能夠提高成骨細(xì)胞的ALP的活性,可能是由于噴砂表面改性處理增加了材料表面的粗糙程度,從而提高了成骨細(xì)胞的ALP的活性。

綜上所述,與普通Ti-6Al-4V鈦合金種植體材料相比,經(jīng)噴砂表面改性處理的鈦合金材料無細(xì)胞毒性,并且可以增強成骨細(xì)胞的黏附、生長及分化能力。然而,由于體外細(xì)胞實驗與生物體內(nèi)環(huán)境仍存在有差異,因此在今后的研究中,本課題組會相繼開展一系列的體內(nèi)動物實驗來進一步加以證實。