張晉毓,田首元,郭志佳

(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院麻醉科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:chinatsyjj@126.com)

在衰老的諸多機(jī)制中,鐵死亡是最近研究的一個(gè)熱點(diǎn)。鐵死亡是鐵依賴(lài)性的新型細(xì)胞死亡形式,其實(shí)質(zhì)是鐵離子催化作用下代謝發(fā)生異常,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[1]。熱量限制(caloric restriction,CR)是在保證機(jī)體功能的前提下,限制每日總熱量攝入的一種措施,被證明能減少氧化應(yīng)激的發(fā)生,延緩老齡相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。SIRT1是熱量限制作用中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白,通過(guò)抑制SIRT1可以影響熱量限制的作用效果[3, 4]。目前,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)鐵死亡和熱量限制關(guān)系的相關(guān)報(bào)道,本研究主要通過(guò)檢測(cè)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等來(lái)研究熱量限制是否對(duì)老年小鼠肝臟的鐵死亡有作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

18月齡雄性C57BL/6J老齡小鼠24只,體質(zhì)量(323)g,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠適應(yīng)2-3 d后,采用數(shù)字表法隨機(jī)將其分為3組(n=8)。自由飲食組(AL組):混合飼料喂養(yǎng),飲水飼料供應(yīng)充足,保持墊料干燥;熱量限制組(CR組):混合飼料分籠喂養(yǎng),自由飲食1周,計(jì)算平均初始每日食量,以后每2周減少初始食量的10%,6周共減30%,建立熱量限制模型[5]。SIRT1抑制劑組(SI組):在熱量限制模型的基礎(chǔ)上,第7周連續(xù)腹腔注射0.3 mg EX-527(SIRT1抑制劑,1652-10,Biovision 公司,美國(guó))1周,1次/d[4]。7周后取肝組織檢測(cè)指標(biāo)。

1.2 病理學(xué)組織染色

肝臟組織4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石臘包埋，切片厚5 μm，展片，烤片，二甲苯脫蠟，酒精至水，蘇木精-伊紅染色，或普魯士藍(lán)染色25 min，核固紅染色10 min，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察肝小葉變化，肝細(xì)胞脂肪變情況及肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。400倍鏡下隨機(jī)取40個(gè)視野，Image J軟件計(jì)數(shù)鐵小粒，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 ROS和GSH含量檢測(cè)

取0.1 g肝臟組織研磨勻漿，預(yù)冷PBS稀釋至50倍待用。取100 μl樣品稀釋液與0.2 μmol/L DCFH-DA熒光染料等體積混合均勻，37 ℃溫箱避光孵育15 min。酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)499 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm條件下檢測(cè)吸光度(A)。用分光光度法檢測(cè)肝組織ROS、GSH含量。以上操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 FTH、TFR和SIRT1蛋白水平檢測(cè)

取每只小鼠肝臟組織30 mg，加入400 μl裂解液，離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，用裂解液稀釋至80 μl，加入20 μl Buffer，95 ℃煮沸5 min。每份樣品取5 μl上樣量，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，用Western blot檢測(cè)FTR、TFR、SIRT1的蛋白含量。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入一抗，F(xiàn)TH(1 ∶1 000，YT4302,Immunoway公司，美國(guó))、TFR(1 ∶1 000，UD282772,Invitrogen 公司，美國(guó))、SIRT 1(1 ∶1 000，abx000615,Biovision 公司，美國(guó))、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶單克隆抗體GAPDH(1 ∶1 000，3777R-100， Biovision 公司，美國(guó))，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜后FTH膜中加入二抗(1 ∶1 000，A21230 Biovision 公司，美國(guó))，TFR、SIRT 1、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶單克隆抗體GAPDH膜中加入二抗(A25022,Biovision 公司，美國(guó))，室溫孵育2 h，洗膜，曝光儀曝光顯影。Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，通過(guò)目的條帶與內(nèi)參灰度值的比值反映相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)染色觀察

HE染色觀察到AL組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞體積變大，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量大小不等的脂肪空泡；CR組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞為圓形，細(xì)胞核居中，胞漿內(nèi)少見(jiàn)脂滴，排列方式為條索狀且肝竇不狹窄；SI組肝細(xì)胞脂滴增多，其病理改變較AL組明顯減輕，可見(jiàn)到正常的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞脂肪變性程度較輕(見(jiàn)圖1)。普魯士藍(lán)染色觀察鐵小粒，與AL組相比，CR組和SI組鐵小粒含量顯著降低(P<0.05)；與CR組相比，SI組鐵小粒含量顯著增高(P<0.05，見(jiàn)圖2，表1)。

圖1 肝臟組織切片HE染色 (×200)Figure 1 HE staining of liver tissue in mice (×200)

圖2 肝臟組織切片普魯士藍(lán)染色 (×400)Figure 2 Prussian blue staining of liver tissue in mice (×400)

2.2 肝組織ROS和GSH含量檢測(cè)結(jié)果

與AL組相比,CR組和SI組ROS含量顯著降低(P<0.05),GSH含量顯著升高(P<0.05);與CR組相比,SI組ROS含量顯著增高(P<0.05),GSH含量顯著降低(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 各組小鼠鐵小粒、ROS和GSH含量的比較Table 1 Comparison of iron granule,ROS,GSH contents in mice between three

2.3 Western blot分析結(jié)果

與AL組相比,CR組和SI組TFR表達(dá)量顯著減少(P<0.05),FTH表達(dá)量顯著增多(P<0.05);CR組SIRT1蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.05),SI組SIRT1蛋白表達(dá)量減少(P<0.05)。與CR組相比,SI組TFR表達(dá)量顯著增多(P<0.05),FTH,SIRT1蛋白顯著減少(P<0.05,見(jiàn)圖3,表2)。

圖3 Western blot檢測(cè)TRF、FTH、SIRT1和GAPDH蛋白表達(dá)Figure 3 The protein expression of TRF, FTH, SIRT1 and GAPDH were detected by Western blot

3 討論

在衰老的過(guò)程中伴隨著鐵死亡的發(fā)生,鐵死亡是導(dǎo)致器官衰老的機(jī)制之一。熱量限制被證明是一個(gè)有效的延緩衰老的非藥物治療方法,但熱量限制與鐵死亡之間是否相關(guān)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)熱量限制通過(guò)影響鐵代謝相關(guān)蛋白及氧化反應(yīng)而抑制肝臟鐵死亡的發(fā)生。

鐵死亡的特征是鐵依賴(lài)的脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生。氧化應(yīng)激水平是衡量鐵死亡程度的主要指標(biāo)[6]。鐵死亡抑制細(xì)胞胱氨酸運(yùn)輸?shù)鞍?耗竭胞內(nèi)GSH;同時(shí),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX4)失效[7]造成膜脂活性氧自由基堆積(ROS)。鐵死亡過(guò)程伴隨著FTH含量顯著降低[8]和轉(zhuǎn)鐵蛋白含量增高[9]。FTH是一種包含24條重鏈和輕鏈的多亞基聚合物,通過(guò)儲(chǔ)存調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵代謝[10]。TFR則將血中二價(jià)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜,經(jīng)過(guò)TFR受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);干擾TFR表達(dá)可降低鐵死亡發(fā)生。本研究通過(guò)檢測(cè)ROS和GSH含量及FTH、TFR水平,提示熱量限制減輕了老年小鼠肝臟鐵死亡的程度,可能是通過(guò)調(diào)節(jié)鐵代謝途徑而實(shí)現(xiàn)。

組蛋白去乙?；?(SIRT1)是熱量限制的關(guān)鍵蛋白之一,以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為輔酶,可通過(guò)調(diào)控抗氧化酶減少氧化應(yīng)激的發(fā)生,起到延緩衰老的作用[11, 12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用SIRT1抑制劑EX-527一定程度上促進(jìn)了鐵死亡的發(fā)生,驗(yàn)證了熱量限制對(duì)鐵死亡的抑制作用。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)熱量限制可以通過(guò)調(diào)節(jié)鐵代謝相關(guān)蛋白及氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著減輕老齡小鼠肝臟鐵死亡水平,SIRT1抑制劑在一定程度上可取消該作用,具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。