包英華，韓 偉，張自斌

（1. 韶關學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院，廣東 韶關 512005；2. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所，廣西 南寧 530007）

0 引言

【研究意義】鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）為蘭科多年生草本植物，具益胃生津，滋陰清熱功效，治療陰傷津虧、胃陰不足、陰虛火旺和目暗不明病癥[1]。鐵皮石斛對生境要求苛刻，自然繁殖率極低，加之環(huán)境的破壞，使得野生資源瀕臨滅絕[2,3]。丹霞地貌鐵皮石斛生長于廣東省韶關市東北部“丹霞地貌”的懸崖上，其莖為紫紅色；葉片紫綠色，莖和葉片多斑點，葉鞘脈紫紅色；節(jié)不顯著；花黃綠色，唇瓣具紫紅色點狀斑塊。由于丹霞地貌鐵皮石斛不斷被采挖，其野生資源逐漸減少，處于瀕危邊緣，筆者利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)已成功建立其人工繁育苗培育體系[4]，對丹霞地貌鐵皮石斛的合理有效利用和可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)保障。比較分析丹霞地貌鐵皮石斛與人工繁育苗的性狀顯微特征及多糖含量研究，以探明丹霞地貌鐵皮石斛在人工繁育和栽培過程中是否發(fā)生品質(zhì)變化，而且對丹霞地貌鐵皮石斛資源的開發(fā)利用和人工繁育苗的質(zhì)量標準制定具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】關于野生鐵皮石斛資源與人工繁育苗的研究報道較少。黃民權(quán)等[5]研究表明，鐵皮石斛愈傷組織與原植物多糖含量、單糖化學組成及其對白細胞抑制指數(shù)具相似性。范俊安等[6]發(fā)現(xiàn)，三年生鐵皮石斛組培品與野生品的形態(tài)相似，組織結(jié)構(gòu)基本相同，總多糖含量差異不顯著。黎萬奎等[7]研究結(jié)果表明，人工栽培鐵皮石斛和野生鐵皮楓斗總多糖含量相近，原球莖組織中總多糖含量最低，膠囊中多糖含量最高。付濤等[8]通過測定仿野生鐵皮石斛與組培苗根莖葉中的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)其差異很大?！颈狙芯壳腥朦c】目前，人工繁育鐵皮石斛種苗技術(shù)較成熟，但人工繁育苗與野生苗的性狀顯微特征和有效成分含量有無存在差異，很少有相關報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究分別以丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗的2年生和3年生莖作為試驗材料，分析其性狀顯微特征和多糖含量變化，比較分析丹霞地貌鐵皮石斛與人工繁育苗的性狀顯微結(jié)構(gòu)特征的差異性和多糖的組織化學定位及含量測定，為其偽品鑒定和鐵皮石斛種內(nèi)鑒別奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

丹霞地貌鐵皮石斛（若干）采自于廣東韶關（24°72′28″N，113°57′98″E），生長狀態(tài)良好；人工繁育鐵皮石斛苗（若干）采自于韶關學院生態(tài)園（24°46′48″N，113°39′25″E），生長狀態(tài)良好。莖鮮 條經(jīng)50 ℃烘干，粉碎，60目過篩獲得粉末。

1.2 形態(tài)特征分析法

丹霞地貌鐵皮石斛株高采用直尺測量，莖直徑、節(jié)間長度、節(jié)長度、葉片長度和寬度等采用游標卡尺測量。每個樣品平行測量15份[4]。采用SPSS 25.0對 試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3 顯微特征分析法

采用徒手切片法，制作樣品鮮莖和粉末切片，番紅-固綠復染后觀察分析其顯微結(jié)構(gòu)特征[4]。用schiff 試劑配方2法[9]，對樣品多糖顆粒進行組織化學定位。每種材料用3組樣品，每組樣品做5個切片，每個切片隨機觀察3個視野，各項測量指標共獲得135個測量數(shù)據(jù)[4]。采用SPSS 25.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

利用形態(tài)分析系統(tǒng)（Image Measuring Software）對圖片進行拍攝和測量，圖片像素分辨率規(guī)格不同時，換算出其倍率，進行測量，因此中圖片均未附加 標尺。

1.4 多糖含量測定方法

采用《中華人民共和國藥典》2015版法，測定樣品多糖含量[1]?；貧w方程Y=11.57X+0.21（R2=0.966，n=5），葡萄糖在3.0～65.0 μg·L-1線性關系良好；穩(wěn)定性試驗表明顯色在4 h內(nèi)穩(wěn)定；RSD為0.33%，符 合測定要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗的形態(tài)特征分析

丹霞地貌鐵皮石斛的莖呈紫紅色，葉為深紫綠色，節(jié)間長度不明顯（圖1-1，圖1-2）；但人工繁育苗的莖則呈深綠色，葉為淺綠色，節(jié)間長度明顯（圖1-3，圖1-4）。人工繁育苗的莖直徑明顯比丹霞地貌鐵皮石斛苗粗，見表1。丹霞地貌鐵皮石斛的株高、莖直徑、節(jié)間長度、葉片長度和寬度與人工繁育苗之間存在顯著差異，見表1。但丹霞地貌鐵皮石斛的2年生莖和3年生莖之間株高、莖直徑、節(jié)間長度等指標無顯著差異；除了株高外，人工繁育苗的2年生莖和3年生莖之間莖直徑、節(jié)間長度等指標也無顯著差異。

圖1 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗的形態(tài)特征Fig. 1 Morphology of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

表1 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗的形態(tài)特征分析Table 1 Morphology of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

2.2 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗的莖顯微結(jié)構(gòu)特征分析

鐵皮石斛莖組織構(gòu)造由角質(zhì)層、表皮、皮下層細胞與基本組織、維管束組成。角質(zhì)層被復染后呈橘黃色；表皮細胞是扁平的一層細胞，排列較緊密，屬于不均勻加厚型，外壁及側(cè)壁稍增厚，微木化，草酸鈣針晶束多見于近表皮細胞處；皮下層細胞一般1～3列，細胞大小不一、形狀各異；基本組織細胞呈多角形，其間分布散生的外韌型維管束，維管束外圍排列具厚壁的鞘纖維（圖2）。

圖2 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗莖顯微結(jié)構(gòu)特征Fig. 2 Microstructures of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

從表2可知，丹霞地貌鐵皮石斛與人工繁育苗的10種莖顯微結(jié)構(gòu)均存在顯著性差異。其中丹霞地貌鐵皮石斛3年生莖的角質(zhì)層厚度（10.85 μm）、表皮細胞直徑（22.23 μm）、鞘纖維直徑（0.66 μm）、維管束直徑（15.22 μm）、鞘纖維數(shù)目（171.53個）、木質(zhì)部厚度（38.88 μm）和韌皮部厚度（44.12 μm）等指標均大于其他樣品；維管束數(shù)目（54.4個）在2年生丹霞地貌鐵皮石斛中最多；皮下層細胞層數(shù)（2.02個）和皮下層細胞直徑（39.84 μm）在3年生人工繁育苗中較大。

表2 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗的莖顯微結(jié)構(gòu)特征比較分析Table 2 Microstructures of stems of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

在丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗莖粉末中均可檢測出草酸鈣針晶，形狀為沿一方向成束緊湊排列，中間寬，兩端逐漸變窄成針尖狀（圖3）；草酸鈣針晶直徑在丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗間無顯著差異；但長度間具有顯著差異，其中2年生人工繁育苗的最長，可達70.13 μm，2年生丹霞地貌鐵皮石斛的最短，是52.25 μm（表3）。

從圖3可見，粉末導管為螺紋或網(wǎng)紋狀。導管直徑在2年生和3年生丹霞地貌鐵皮石斛之間無顯著差異，與人工繁育苗間具顯著差異，3年生人工繁育苗的導管直徑最大，可達13.85 μm（表3）。

丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗的莖粉末淀粉粒直徑間無顯著差異（表3）。淀粉粒多為單粒、部分為復粒形式存在。單粒淀粉粒呈類圓形或橢圓形或多半圓形狀，臍點不明顯，層紋隱約可見；而復粒淀粉粒中，大小相近的單粒聚合呈直線狀、或大小不相同的單粒聚合、或三?；蛩牧瘟＞酆闲纬蓮土，F(xiàn)象，少見五粒以上的單粒聚合現(xiàn)象，雖顆粒較小但顆粒分明；復粒層紋較為清晰，臍點均不太明顯（圖3）。

粉末木薄壁細胞排列緊密且整齊，多為長梭形（如五邊形，六邊形），細胞壁具增厚現(xiàn)象，木化，細胞直徑間具顯著差異（圖3）。2年生丹霞地貌鐵皮石斛的木薄壁細胞直徑最大，可達59.08 μm，3年生丹霞地貌鐵皮石斛、2年生和3年生人工繁育苗依次變小，3年生人工繁育苗的僅為34.01 μm（表3）。

粉末維管束鞘細胞多數(shù)成紡錘形，少數(shù)長六邊形（圖3）。鞘細胞壁厚度在2年生和3年生丹霞地貌鐵皮石斛之間無顯著差異，與人工繁育苗間具顯著差異，3年生人工繁育苗的細胞壁厚度最厚，可達6.39 μm（表3）。

表3 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗莖粉末顯微結(jié)構(gòu)特征比較分析Table 3 Microstructures of powdered stems of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

圖3 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗莖粉末顯微結(jié)構(gòu)特征Fig. 3 Microstructures of powdered stem of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

2.3 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗莖多糖顆粒的組織化學定位與總含量分析

莖組織化學定位結(jié)果表明，丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗莖的基本組織中分布著大量多糖顆粒，呈較深的紫紅色，為小塊聚集狀或顆粒狀，在表皮細胞與維管束內(nèi)少有分布。丹霞地貌鐵皮石斛相比，人工繁育苗的多糖顆粒主要呈小塊聚集狀，被染色程度會更明顯。丹霞地貌鐵皮石斛莖多糖顆粒直徑與人工繁育苗多糖顆粒直徑間存在顯著差異，但2年生和3年生丹霞地貌鐵皮石斛多糖顆粒直徑間無顯著差異；其中3年生人工繁育苗莖多糖顆粒直徑最大，可達28.61 μm（圖4、表4）。

圖4 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗莖多糖組織化學定位Fig. 4 Histochemical localization of polysaccharides in stems of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗莖的總多糖含量間具顯著差異。丹霞地貌鐵皮石斛的總多糖含量高于人工繁育苗，2年生和3年生丹霞地貌鐵皮石斛的總多糖含量分別高達35.46%和32.37%（表4）。

表4 丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗莖多糖的組織化學定位與含量分析Table 4 Histochemical localization and polysaccharide content in stems of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

3 討論與結(jié)論

鐵皮石斛具有較高的藥用和保健作用，市場需求量大。由于鐵皮石斛野生資源緊缺，藥材基源復雜，導致商品藥材混亂[10?11]。本研究結(jié)果顯示，丹霞地貌鐵皮石斛和人工繁育苗在性狀特征上充分反映出其遺傳變異。丹霞地貌鐵皮石斛的莖顏色為紫紅色，葉為深紫綠色；人工繁育苗的莖為深綠色，葉為淺綠色；人工繁育苗的株高、莖直徑、節(jié)間長度、葉片長、寬度均比丹霞地貌鐵皮石斛大，說明這些性狀特征均可作為鑒別丹霞地貌鐵皮石斛和其人工繁育苗甚至不同居群鐵皮石斛的鑒定和評價指標。

顯微構(gòu)造分析結(jié)果表明，丹霞地貌鐵皮石斛與人工繁育苗鮮莖的10種顯微結(jié)構(gòu)指標均存在顯著差異，為兩者的鑒別提供依據(jù)。2年生與3年生人工繁育苗的維管束直徑和韌皮部厚度間無顯著差異，說明人工繁育苗從異養(yǎng)生長逐漸變?yōu)樽责B(yǎng)生長，輸導系統(tǒng)的發(fā)育在栽培后的2～3年內(nèi)變化小，但栽培時間的延長，輸導系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)有何變化，有待于進一步研究。莖粉末中的草酸鈣針晶成束排列，導管為螺紋或網(wǎng)紋狀，淀粉粒多為單粒、部分為復粒；這與秦文等[12]研究結(jié)果相吻合。木薄壁細胞排列緊密，長梭形，細胞壁具增厚現(xiàn)象，木化；維管束鞘細胞多為紡錘形。草酸鈣針晶長度、導管直徑、木薄壁細胞直徑、維管束鞘細胞厚度等顯微特征對丹霞地貌鐵皮石斛與人工繁育苗間具顯著差異，可作為其鑒別特征。

利用組織化學技術(shù)在藥用植物有效成分（多糖、生物堿、黃酮、香豆素和皂苷等）的分布規(guī)律和動態(tài)變化等方面研究發(fā)揮越來越重要的作用[9,13?14]。組織化學定位方法能夠快速而簡單地觀察和分析出，丹霞地貌鐵皮石斛與人工繁育苗莖多糖顆粒的分布特征。多糖顆粒集中分布在基本組織中，表皮細胞和維管束內(nèi)少有分布。多糖顆粒直徑在丹霞地貌鐵皮石斛莖與人工繁育苗間存在顯著差異，可作為其鑒別特征。

在鐵皮石斛糖類成分中，可溶性多糖具有一定的生理活性，也是評價鐵皮石斛品質(zhì)的重要指標。本研究結(jié)果表明，2年生和3年生丹霞地貌鐵皮石斛的總多糖含量分別可達35.46%、32.37%，這與龔慶芳等[15]研究結(jié)果基本一致，達到《中華人民共和國藥典》（2015版）[1]中以無水葡萄糖為標準，標定鐵皮石斛多糖含量不少于25.0%的水平。但人工繁育苗的總多糖含量未達藥典要求水平。試驗結(jié)果初步說明，丹霞地貌鐵皮石斛大規(guī)模種植應以原生境仿野生栽培為佳，這不僅保持丹霞地貌鐵皮石斛固有的形態(tài)特征，也可保證其總多糖含量的穩(wěn)定性。