李 俊，魏軍平

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053）

甲狀腺功能亢進(jìn)癥是由于甲狀腺激素分泌過(guò)多而引起的循環(huán)、神經(jīng)、消化系統(tǒng)等興奮性增高和代謝亢進(jìn)為主要特征的臨床綜合征，其中80%是由Graves 病（Graves' disease, GD）引起的。甲亢流行病學(xué)因診斷閾值、測(cè)定方法及碘營(yíng)養(yǎng)狀況的差異而不同[1]。歐洲的一項(xiàng)薈萃分析表明患病率約為0.8%，美國(guó)調(diào)查顯示為1.3%，而我國(guó)的患病率約為0.8%[2,3]。GD 是常見(jiàn)的器官特異性自身免疫疾病之一，甲狀腺刺激性抗體是其特征性致病抗體，存在于90%以上的病人。除自身免疫因素以外，碘營(yíng)養(yǎng)狀況、心理壓力、性別、吸煙、硒、免疫調(diào)節(jié)劑等也可能導(dǎo)致疾病的發(fā)展[4‐6]。甲亢的主要治療方法是抗甲狀腺藥物、放射性碘和手術(shù)，在美國(guó)以外地區(qū)首選ATD 作為主要治療方法，但對(duì)于持續(xù)性或復(fù)發(fā)性甲亢患者，應(yīng)使用手術(shù)和放射性碘?？辜谞钕偎幬锟梢种萍谞钕偌に氐暮铣?，但緩解率較低、容易復(fù)發(fā)。放射性碘和手術(shù)見(jiàn)效快，但甲狀腺功能減退、甲狀旁腺功能減退、喉返神經(jīng)損傷等副作用常見(jiàn)，故臨床應(yīng)用受限。中藥治療GD 具有特殊優(yōu)勢(shì)，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的同時(shí)可以可減少抗甲狀腺藥物所致肝功能異常等毒、副作用，降低復(fù)發(fā)率和甲減發(fā)生率[7]。夏枯草(Prunella vulgaris)味辛、性苦寒，歸肝膽經(jīng)，功能清熱瀉火、明目、散結(jié)消腫等，常用以治療瘰疬、癰腫、眩暈頭痛等。藥理研究表明其具有降壓、降糖、抗菌消炎、免疫抑制、清除自由基及抗氧化、抗腫瘤、抑制病毒生長(zhǎng)等多種作用[8]。不少臨床研究表明夏枯草制劑與西醫(yī)治療相結(jié)合可有效降低抗體水平、調(diào)節(jié)異常免疫功能并改善甲狀腺功能，但其臨床作用機(jī)制尚未完全明確[9，10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科[11]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，收集夏枯草的治療GD 的有效成分、探究其治療GD 的作用靶點(diǎn)及機(jī)制，為夏枯草治療GD 的臨床研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）；DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）；STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string‐db.org/）；PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）；DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.6.1軟件；PyMOL 2.3.2軟件；AutoDock‐Tools 1.5.6軟件；AutoDock Vina 1.1.2軟件。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草活性成分及靶點(diǎn)篩選 從TCMSP 平臺(tái)通過(guò)檢索并獲取夏枯草的相關(guān)化學(xué)成分［12］。根據(jù)ADME 特性對(duì)所獲取的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18 為條件，篩選出符合條件的化學(xué)成分［13，14］。同時(shí)應(yīng)用TCMSP 獲取相關(guān)成分的靶點(diǎn)，并通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將相關(guān)靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因。

1.2.2 Graves 病相關(guān)靶點(diǎn)獲取 同時(shí)檢索Gene‐Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取GD相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中所得靶點(diǎn)結(jié)果合并去重，并將最終所得靶點(diǎn)名標(biāo)準(zhǔn)化。將夏枯草作用靶點(diǎn)與GD 疾病靶點(diǎn)二者取交集，得到夏枯草治療的GD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.3 構(gòu)建“藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 使用Cy‐toscape 軟件構(gòu)建“藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。以藥物、藥物活性成分、疾病、疾病靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，通過(guò)Excel 表格構(gòu)建相應(yīng)關(guān)系。然后將表格導(dǎo)入Cyto‐scape 軟件中繪制“藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，觀察夏枯草活性成分與疾病靶點(diǎn)之間的相互作用，確定網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)［12］。

1.2.4 構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建夏枯草治療GD 的蛋白‐蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI network），分析關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白之間的作用關(guān)系。PPI 網(wǎng)絡(luò)中，各個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺反映其自由度（Degree）值的大小，其中Degree 值越大代表此節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.2.5 GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析 將得到的夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO（gene ontology）生物學(xué)過(guò)程和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。以閾值P<0.05 為條件篩選排名靠前的生物學(xué)過(guò)程或通路，并使用R 語(yǔ)言繪圖使結(jié)果可視化。

1.2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 從“藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中選取關(guān)鍵活性成分和PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶蛋白，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載成分及靶蛋白的結(jié)構(gòu)文件。利用PyMol 軟件將靶蛋白的配體分離并去除水分子，然后將小分子成分和靶蛋白受體使用AutoDockTools 軟件處理并保存為相應(yīng)格式文件。最后利用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證，評(píng)價(jià)夏枯草關(guān)鍵活性成分與核心靶蛋白之間的對(duì)接情況。

2 結(jié)果

2.1 夏枯草化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到的夏枯草的化學(xué)成分有60 個(gè)，依據(jù)ADME 特性對(duì)成分進(jìn)行篩選（OB≥30%，DL≥0.18），符合條件的化學(xué)成分有11 個(gè)［13］，刪除無(wú)靶點(diǎn)信息的化學(xué)成分，最終獲取10個(gè)活性成分。見(jiàn)表1。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢符合篩選條件的活性成分的作用靶點(diǎn)并去重，結(jié)果顯示有10 個(gè)成分一共作用于198 個(gè)靶點(diǎn)，最后使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將這些靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)基因。

表1 夏枯草化學(xué)成分篩選Tab 1 Selected active constituents of Prunella vulgaris from TCMSP

2.2 夏枯草治療GD 的靶基因篩選

同時(shí)使用GeneCards 及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索GD 的疾病基因。從GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到靶基因1 467 個(gè)，將Relevance score≥20 的155 個(gè)納入研究。從DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到585 個(gè)靶基因，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的靶基因合并去重后共得到靶基因646 個(gè)。比對(duì)夏枯草作用靶點(diǎn)基因與GD 疾病靶基因，共篩選出二者的交集靶基因57 個(gè)并用于后續(xù)分析，見(jiàn)圖1。

圖1 夏枯草化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與Graves病疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Venn diagram of the targets of Prunella vulgaris chemical components and the disease targets of Graves disease

2.3 “藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了深入探究夏枯草的活性成分、作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的關(guān)系。通過(guò)Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)67 個(gè)，其中8 個(gè)節(jié)點(diǎn)代表活性成分，57 個(gè)節(jié)點(diǎn)代表疾病靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)相互作用關(guān)系172 條。其中橢圓形代表GD，圓形代表GD 的靶基因，棱形代表夏枯草及其活性成分，節(jié)點(diǎn)之間的連線代表二者之間的相互作用。相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多，那么圖形的面積越大，顏色越深（橙色>淺黃色>淺綠色>淺藍(lán)色），意味著這個(gè)靶點(diǎn)或化合物越在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的作用就越關(guān)鍵。以degree 值為篩選條件，得到槲皮素、木犀草素、山柰酚這3 個(gè)成分可能是夏枯草治療GD 的關(guān)鍵成分，見(jiàn)表2。

圖2 夏枯草治療Graves 病“藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 "drug-component-disease-target" network diagram of the treatment of Gravse with Prunella vulgans

表2 夏枯草治療GD 的關(guān)鍵成分Tab 2 The key active components of Prunella vulgaris in treating GD

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將上述的57 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，從數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)出相應(yīng)數(shù)據(jù)并通過(guò)Cytoscape軟件中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。該網(wǎng)絡(luò)共涉及57個(gè)靶點(diǎn)及688 條作用關(guān)系。圖中各節(jié)點(diǎn)隨著degree值由小到大，則節(jié)點(diǎn)面積逐漸增大、顏色逐漸加深，且節(jié)點(diǎn)越接近圓心。篩選出degree 值靠前的10 個(gè)靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)這些靶蛋白可能是夏枯草治療GD 的核心靶點(diǎn)見(jiàn)表3。

圖3 夏枯草治療Graves 病PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram of Prunella vulgaris treatment of Graves disease

表3 夏枯草治療GD 的核心靶點(diǎn)Tab 3 The key targets of Prunella vulgaris in treating GD

2.5 GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析

為了進(jìn)一步探究夏枯草治療GD 的作用機(jī)制，對(duì)57 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物功能注釋和KEGG信號(hào)通路分析［15］。GO 富集分析分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能。從結(jié)果來(lái)看，夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及的生物過(guò)程有：一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、炎癥應(yīng)答（inflammatory response）、對(duì)乙醇的反應(yīng)（response to ethanol）、衰老（aging）、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（posi‐tive regulation of transcription from RNA poly‐merase Ⅱpromoter）、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、藥物反應(yīng)（response to drug）、基因表達(dá)的正調(diào)控（positive regulation of gene expression）；主要存在于細(xì)胞外間隙（extracel‐lular space）、胞外區(qū)（extracellular region）、質(zhì)膜外側(cè)（external side of plasma membrane）、線粒體（mito‐chondrion）等；主要參與細(xì)胞因子活性（cytokine ac‐tivity）、酶結(jié)合（enzyme binding）、同一蛋白結(jié)合（identical protein binding）等，見(jiàn)圖4。KEGG 通路分析結(jié)果表明夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及了TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、HIF‐1 信號(hào)通路（HIF‐1 signaling pathway）、癌癥相關(guān)通路（pathways in cancer） 、PI3K‐Akt 信 號(hào) 通 路（PI3K‐Akt signaling pathway）、細(xì)胞因子‐細(xì)胞因子‐受體相互作用（cytokine‐cytokine receptor interac‐tion）、癌癥蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）等，見(jiàn)圖5。提示夏枯草可能通過(guò)調(diào)控上述信號(hào)通路發(fā)揮治療GD 的作用。

圖4 GO 富集分析Fig 4 GO enrichment analysis

圖5 KEGG 富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis

2.6 分子對(duì)接

選擇“藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵活性成分槲皮素與PPI 網(wǎng)絡(luò)中3 個(gè)核心靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載AKT1、IL‐6 及TNF的蛋白結(jié)構(gòu)文件，采用Pymol 軟件去掉水分子和配體分子。再用AutoDockTools 軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化并使用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接［16］，其中Full fitness 值越低，說(shuō)明靶蛋白與小分子的結(jié)合越緊密，見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，槲皮素與3 個(gè)靶蛋白均可對(duì)接，且槲皮素與AKT1 的對(duì)接效果最好（圖6），其次是槲皮素與IL‐6 的對(duì)接（圖7），最后是槲皮素與TNF 的對(duì)接結(jié)果（圖8）。故預(yù)測(cè)夏枯草中的槲皮素與疾病靶點(diǎn)AKT1 的相互作用在夏枯草治療GD 中發(fā)揮著重要作用。

圖6 槲皮素與AKT1 分子對(duì)接Fig 6 Molecular docking of quercetin and AKT1

圖7 槲皮素與IL‐6 分子對(duì)接Fig 7 Molecular docking of quercetin and IL-6

圖8 槲皮素與TNF 分子對(duì)接Fig 8 The docking of quercetin and TNF molecule

表4 分子對(duì)接結(jié)果Tab 4 Molecular docking results

3 討論

從“藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖可知槲皮素、木犀草素、山柰酚等化學(xué)成分是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)。槲皮素作為一種常見(jiàn)的黃酮類化合物，已證實(shí)是一種抗甲狀腺激素功能的物質(zhì)，對(duì)甲亢和甲狀腺毒性作用有改善效果。在槲皮素抑制FRTL‐5 細(xì)胞的生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)槲皮素可下調(diào)與甲狀腺合成相關(guān)的部分基因的表達(dá)，包括NIS、TSHR、TPO和TG等，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明槲皮素能夠抑制SD 大鼠體內(nèi)碘的攝取［17］。槲皮素能夠有效改善甲亢誘導(dǎo)的甲狀腺功能變化及肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化，提高SOD 和CAT 活性，并恢復(fù)肝臟D1 活性［18］。另一方面研究證實(shí)山奈酚、槲皮素等均能顯著增加D2 活性，上調(diào)D2 基因的表達(dá)并使局部T3 的生成增加，提高骨骼肌細(xì)胞氧氣及能量消耗［19］。木犀草素具有廣泛的抗炎作用，但尚缺乏木犀草素治療GD 的實(shí)驗(yàn)研究。此外，“藥物‐成分‐疾病‐靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析顯示，GD 的靶基因PPARG、PIK3CG、CASP9、AKT1、TNF、ICAM1、BCL2、BAX等與夏枯草活性成分相互作用較多，提示這些靶點(diǎn)是夏枯草治療GD 的潛在靶基因。GD 眼?。℅raves' ophthalmopathy，GO）中眼眶成纖維細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體G 依賴性過(guò)程，其對(duì)于GO 致病組織重塑至關(guān)重要［20］。細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）是是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1（LFA1）分子的配體，在炎癥和免疫介導(dǎo)中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)高水平血清ICAM1 與自身免疫性甲狀腺疾病有關(guān)，且抗甲狀腺素過(guò)氧化物酶陽(yáng)性的GD 患者的血清循環(huán)ICAM1 濃度明顯高于陰性的患者［21］。GD 患者甲狀腺濾泡周圍的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和具有單核細(xì)胞聚集病變的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ICAM1 表達(dá)增強(qiáng)，LFA1/ICAM1 通路可能是導(dǎo)致單核細(xì)胞遷移到GD 患者甲狀腺的原因［22］。細(xì)胞凋亡在多細(xì)胞生物的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用，細(xì)胞凋亡與Graves 病甲狀腺實(shí)質(zhì)的重塑有關(guān)，并與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，凋亡的開(kāi)始與細(xì)胞內(nèi)聚力的喪失和Bcl‐2表達(dá)的下降有關(guān)［23］。原癌基因Bcl-2與Bax 對(duì)細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用，其中Bcl-2是對(duì)細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用。過(guò)度表達(dá)的Bcl‐2 不僅能抑制甲狀腺細(xì)胞凋亡，同時(shí)可減少淋巴細(xì)胞對(duì)甲狀腺細(xì)胞的破壞［24］。Casp9 是細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子成員之一，通過(guò)與Bcl‐2 家族等蛋白因子的相互作用來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡的進(jìn)程［25］。因此，對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)節(jié)在夏枯草治療GD 中可能發(fā)揮著重要作用。

從PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果可知：AKT1、IL‐6、TNF、VEGFA、TP53、IL‐10、CXCL8 等是夏枯草治療GD的核心靶點(diǎn)。其中，IL‐6、TNF、TP53 等的遺傳變異與GD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著關(guān)聯(lián)，也顯示了炎癥相關(guān)基因的多態(tài)性與GD 的發(fā)病機(jī)制的密切關(guān)系［26，27］。CD40 是一種腫瘤壞死因子受體，是GD 以及多種自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)敏感性基因。甲狀腺CD40 過(guò)表達(dá)會(huì)增加甲狀腺特異性抗體的產(chǎn)生，CD40 通過(guò)激活下游細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)介導(dǎo)這種作用，主要包括IL‐6、IL‐8、TNF‐α 等［28］。GD以甲狀腺實(shí)質(zhì)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，在甲狀腺組織中，輔助Th1 淋巴細(xì)胞可能增強(qiáng)TNF‐α 的產(chǎn)生，CXCL8 分泌隨TNF‐α 濃度的增加而呈劑量依賴性增加。這些因子間會(huì)建立一個(gè)放大的反饋回路，從而啟動(dòng)并延續(xù)自身免疫過(guò)程，CXCL8 可能與疾病的后期慢性持續(xù)階段有關(guān)［29］。IL‐6 是參與B 細(xì)胞活化和調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞代謝的細(xì)胞因子，IL‐6 可能通過(guò)增加眼眶脂肪/結(jié)締組織內(nèi)自身抗原的表達(dá)而在GO的發(fā)病中起重要作用［30］。此外，活動(dòng)性GO 的甲狀腺毒性患者的血清VEGF 升高可能反映了眼眶和甲狀腺組織中長(zhǎng)期存在的自身免疫過(guò)程以及甲狀腺中血管生成的增強(qiáng)，也反映了眼部炎癥活動(dòng)的程度［31］。這些核心蛋白廣泛參與了GD 發(fā)病中的免疫及炎癥過(guò)程，尤其在GO 的發(fā)病中顯得更為重要。

從GO 富集分析結(jié)果可知，夏枯草主要影響GD的炎癥應(yīng)答、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程等。在Graves 病的初期以Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)為主，而疾病后期主要是Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)。因此炎癥應(yīng)答過(guò)程的調(diào)節(jié)在GD 的各個(gè)時(shí)期都是有效的。正常甲狀腺細(xì)胞分裂不活躍，細(xì)胞凋亡保持在一個(gè)較低水平，這種低水平有利于維持腺體的大小和功能的穩(wěn)定［32］。而GD 發(fā)生時(shí)甲狀腺細(xì)胞增生活躍并伴有細(xì)胞凋亡水平的增加。對(duì)于凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控可能有利于減少毒性淋巴細(xì)胞對(duì)甲狀腺細(xì)胞的破壞作用。KEGG 富集分析結(jié)果表明，夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及包括TNF 信號(hào)通路、HIF‐1 信號(hào)通路、PI3K‐Akt 信號(hào)通路及癌癥相關(guān)通路。TNF 通路、PI3K‐Akt 通路主要是對(duì)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡相關(guān)過(guò)程的調(diào)控。此外，這些通路與GO 關(guān)系密切，甲狀腺相關(guān)眼病中TSHR 信號(hào)直接通過(guò)PI3K‐Akt 信號(hào)刺激增殖［33］。缺氧也可通過(guò)激活眼眶成纖維細(xì)胞中的HIF‐1 依賴性途徑來(lái)刺激血管生成和脂肪生成，從而影響GO 的組織重塑［34］。GD 與甲狀腺癌發(fā)生率之間的關(guān)系仍存在較大爭(zhēng)議，癌癥相關(guān)通路在疾病中的作用尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)夏枯草治療GD 的主要活性成分、關(guān)鍵作用靶點(diǎn)及重要信號(hào)通路進(jìn)行了探討，并通過(guò)分子對(duì)接對(duì)部分成分和靶點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，夏枯草的多種活性成分可通過(guò)炎癥及細(xì)胞凋亡等相關(guān)過(guò)程參與GD 的治療，更值得注意的是這些靶點(diǎn)在GO 中表現(xiàn)得更為重要，也為進(jìn)一步研究其相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。