楊茜，葉冬雪，馬晏然，胡小媛，李宏，周璇，項鋒鋼,

0 引言

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的六大惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的生命健康[1]。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是肝癌最常見的組織學類型[2]，目前占癌癥相關死亡原因的第二位[3]。在我國，引起HCC高風險的關鍵因素是慢性HBV感染和黃曲霉毒素暴露。由于其高發(fā)病率以及缺乏針對性的藥物[2,4]，患者預后不良，因此迫切需要進一步研究HCC的發(fā)病機制以及尋找有效的靶向標志物。

真核翻譯起始因子5A2（eukaryotic translation initiation factor 5A2,EIF5A2）為EIF家族的重要一員，是一種相對分子質量較小（17 kDa）的保守酸性蛋白質[5]。有研究表明，EIF5A2在上尿路尿道上皮癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，提示預后不良[6-9]，但關于其影響HCC發(fā)生、發(fā)展的研究相對較少。本文旨在通過檢測EIF5A2在人肝細胞癌組織中的表達，揭示其與臨床病理參數(shù)及預后的關系，為尋找腫瘤治療新靶點提供思路。

1 資料與方法

1.1 組織樣本

選取青島大學附屬醫(yī)院2014年2月—2016年10月手術切除的284例肝細胞癌標本（由于所掌握的臨床病理資料中僅有乙型肝炎的情況，因此我們僅進行了EIF5A2與乙肝的相關分析），包括患者的癌組織及相應癌旁非瘤組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）進行此次研究，患者術前均未接受任何放化療，入組病例情況見表1。此外，收集2019年1月至3月經(jīng)手術切除的12對新鮮HCC及相應癌旁非瘤組織，迅速置于-80℃冰箱中凍存。定期對患者進行電話隨訪，隨訪日期截至2020年4月29日，284例HCC患者中術后滿三年且隨訪資料完整者有250例，其中63例死亡；術后滿五年且隨訪資料完整者有83例，其中31例死亡。試驗經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 284例肝細胞癌患者一般臨床資料Table 1 General clinical data of 284 hepatocellular carcinoma (HCC) patients

1.2 主要試劑和耗材

PV6000免疫組織化學檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，EIF5A2兔單克隆抗體（EPR7412-50 cat.no.ab150439）購于英國Abcam公司，免疫組織化學工作濃度1∶50，Western blot工作濃度1∶500；RIPA裂解液購于北京索萊寶科技有限公司，BCA蛋白測定試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司，增強化學發(fā)光試劑盒（ECL）kit購于美國Millipore公司；PrimeScriptTM反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒購于大連寶生物工程有限公司，EIF5A2引物和GAPDH引物均購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 Western blot檢測蛋白和mRNA的表達

在新鮮切除的12對腫瘤組織和相應的毗鄰非瘤組織中加入RIPA裂解液，均質化并在冰上裂解30 min，BCA蛋白測定試劑盒測定提取總蛋白濃度。配制12%SDS-PAGE膠，蛋白上樣、電泳分離后，72 V恒壓電轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入目標一抗室溫孵育2 h，4℃過夜。次日TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h，再次洗膜后于暗室中使用ECL試劑盒顯影。β-actin作為標準化內(nèi)參。

1.4 qRT-PCR檢測EIF5A2的表達

用TRIzol進行組織總RNA的提取，紫外分光光度計測定其純度及濃度，按操作說明反轉錄為cDNA，隨后進行實時熒光PCR測定。每個樣本設置三個復孔，反應條件如下：95℃預變性，30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；共40個循環(huán)。以GAPDH為標準化內(nèi)參，2-△△Ct法計算EIF5A2在HCC及相應癌旁非瘤組織中的相對表達量。EIF5A2及GAPDH引物序列見表2。

表2 EIF5A2及GAPDH的引物序列Table 2 Primer sequences of EIF5A2 and GAPDH

1.5 免疫組織化學檢測

1.5.1 組織芯片構建 取樣前由兩位病理醫(yī)師對蠟塊的HE切片進行鏡下形態(tài)學觀察，圈出典型位置，并在蠟塊確定取樣部位，使用直徑1.5 mm的取樣針在每個蠟塊穿取組織芯轉移到受體蠟塊，53℃陣列融合，4 μm連續(xù)切片。芯片經(jīng)HE染色后進行復檢。

1.5.2 免疫組織化學染色 按照試劑盒說明書采用PV6000法進行免疫組織化學染色。白片經(jīng)60℃恒溫烘箱烤片30 min后，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；置于3%H2O2中浸泡20 min，充分水洗；微波修復（1 mmol/L EDTA，pH8.0），自然冷卻，PBS洗3次；滴加目標一抗，4℃過夜，PBS洗3次；滴加二抗于37℃水浴鍋中孵育30 min，PBS洗3次；DAB顯色，光學顯微鏡下控制顯色時間；蘇木精對比染色，脫水，透明，中性樹膠封片。用已知陽性表達EIF5A2的結腸癌組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5.3 免疫組織化學結果判讀 以胞質或胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色計為EIF5A2陽性表達，評判標準參考文獻[10-11]：陽性細胞染色強度計分標準：0分（陰性）、1分（弱染色）、2分（中等強度染色）、3分（強染色）；陽性細胞所占百分比計分標準：1分（＜25%）、2分（25%～50%）、3分（≥50%～75%）、4分（≥75%）。EIF5A2免疫組織化學染色總得分=染色強度得分×陽性細胞百分比得分，≤4分為低表達，＞4分為高表達。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS23.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析：EIF5A2在肝細胞癌及相應癌旁非瘤組織中的表達應用配對t檢驗、Wilcoxon秩和檢驗進行分析；EIF5A2在肝細胞癌中的表達與臨床病理參數(shù)間的關系采用χ2檢驗進行分析；Kaplan-Meier生存曲線和Log rank檢驗對患者術后生存時間進行分析；Cox比例風險回歸模型對影響患者術后生存時間的因素進行單因素和多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EIF5A2在肝細胞癌及相應癌旁非瘤組織中mRNA水平的表達

qRT-PCR法檢測12對組織中EIF5A2 mRNA水平的表達情況。結果表明，肝細胞癌中EIF5A2的表達水平顯著高于相應癌旁非瘤組織，差異具有統(tǒng)計學意義（t=5.305,P=0.0003），見圖1。

圖1 qRT-PCR法檢測EIF5A2在肝細胞癌及相應癌旁非瘤組織中的表達Figure 1 EIF5A2 expression in HCC and adjacent nontumor tissues detected by qRT-PCR

2.2 EIF5A2在肝細胞癌及相應癌旁非瘤組織中蛋白水平的表達

Western blot法檢測12對組織中EIF5A2蛋白水平的表達情況，發(fā)現(xiàn)相比于癌旁非瘤組織，EIF5A2在肝細胞癌中表達均上調(diào)，且表達差異具有統(tǒng)計學意義（t=10.120,P＜0.001），見圖2。

圖2 Western blot法檢測EIF5A2在肝細胞癌及相應癌旁非瘤組織中的表達Figure 2 EIF5A2 expression in HCC and adjacent nontumor tissues detected by Western blot

2.3 EIF5A2在肝細胞癌及相應癌旁非瘤組織中的表達

免疫組織化學技術檢測結果顯示EIF5A2在胞質和胞核中均有表達，見圖3。肝細胞癌中176例（61.97%）呈高表達，相應癌旁非瘤組織中11例（3.87%）呈高表達，差異有統(tǒng)計學意義（z=-12.186,P＜0.001）。

圖3 EIF5A2在肝細胞癌及癌旁非瘤組織中的表達 (IHC ×200)Figure 3 Expression of EIF5A2 in HCC and adjacent nontumor tissues (IHC ×200)

2.4 EIF5A2的表達與肝細胞癌患者臨床病理特征的關系

EIF5A2的表達與肝細胞癌患者的腫瘤大小、腫瘤是否多發(fā)、分化程度有關（P＜0.05），而與患者的性別、年齡、AFP水平、是否有乙型肝炎、肝硬化、包膜侵犯、脈管侵犯、TNM分期無關（P＞0.05），見表3。

表3 EIF5A2的表達與肝細胞癌患者臨床病理特征的關系Table 3 Relation between EIF5A2 expression and clinicopathological characteristics of HCC patients

2.5 EIF5A2的表達與肝細胞癌患者術后生存期的關系

對250例術后滿三年且有完整隨訪資料的患者進行生存預后分析，結果顯示：EIF5A2低表達組和高表達組的生存率分別為88.8%、65.8%，低表達患者術后總體生存期及無病生存期較高表達患者更長（均P＜0.001），見圖4A、B。對83例術后滿5年有完整隨訪資料的患者進行預后分析，結果顯示：EIF5A2低表達組和高表達組的5年生存率分別為91.3%、27.0%，低表達患者術后總體生存期及無病生存期較高表達患者更長（均P＜0.001），見圖4C、D；在腫瘤≥5 cm分組中，低表達組和高表達組的五年生存率分別為100%、23.8%，低表達患者術后總體和無病生存期高于高表達患者（P=0.004、0.002），見圖4E、F。

圖4 EIF5A2的表達與肝細胞癌患者術后三年及五年生存時間的關系Figure 4 Relation between EIF5A2 expression and 3-and 5-year survival time of HCC patients

2.6 Cox比例風險回歸模型分析影響肝細胞癌者術后生存時間的因素

將EIF5A2的表達水平與可能影響HCC術后生存期的臨床病理參數(shù)進行單因素分析，結果發(fā)現(xiàn)影響術后三年總體生存期的因素為：AFP（P=0.002）、腫瘤大?。≒＜0.001）、包膜侵犯（P=0.019）、脈管侵犯（P=0.004）、腫瘤是否多發(fā)（P＜0.001）、分化程度（P＜0.001）、TNM分期（P=0.009）、EIF5A2的表達水平（P＜0.001）；影響術后三年無病生存期的因素為：AFP（P＜0.001）、腫瘤大?。≒＜0.001）、包膜侵犯（P=0.012）、脈管侵犯（P=0.003）、腫瘤是否多發(fā)（P＜0.001）、分化程度（P＜0.001）、TNM分期（P=0.010）、EIF5A2的表達水平（P＜0.001）。進一步行多因素分析發(fā)現(xiàn)影響術后三年總體生存期的獨立預后因素有：腫瘤大小（P=0.021）、腫瘤是否多發(fā)（P=0.004）、EIF5A2的表達水平（P=0.005）；影響術后三年無病生存期的獨立預后因素有：腫瘤大?。≒=0.035）、腫瘤是否多發(fā)（P=0.003）、EIF5A2的表達水平（P=0.007），見表4～5。

表4 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細胞癌患者三年總體生存時間的因素Table 4 Univariate and multivariate Cox regression analyses of factors affecting 3-year overall survival of HCC patients

影響術后五年總體生存期的因素為：腫瘤大?。≒=0.002）、腫瘤是否多發(fā)（P=0.028）、TNM分期（P=0.002）、EIF5A2的表達水平（P＜0.0 0 1）；影響術后五年無病生存期的因素：腫瘤大小（P=0.002）、腫瘤是否多發(fā)（P=0.025）、TNM分期（P＜0.001）、EIF5A2的表達水平（P＜0.001）。進一步多因素分析發(fā)現(xiàn)影響術后五年總體和無病生存時間的獨立預后因素為：EIF5A2的表達水平（P＜0.001），見表6～7。

表5 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細胞癌患者三年無病生存時間的因素Table 5 Univariate and multivariate Cox regression analyses of factors affecting 3-year disease-free survival of HCC patients

表6 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細胞癌患者五年總體生存時間的因素Table 6 Univariate and multivariate Cox regression analyses of factors affecting 5-year overall survival of HCC patients

表7 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細胞癌患者五年無病生存時間的因素Table 7 Univariate and multivariate Cox regression analyses of factors affecting 5-year disease-free survival of HCC patients

3 討論

EIF5A2 最初是從原發(fā)性卵巢癌細胞系UACC-1598中分離出的一種候選癌基因，位于染色體3q26.2位點上[12]。EIF5A是一種包含特殊氨基酸8-羥基2，7，10-三氨基癸酸（hypusine）的細胞蛋白，其家族中的各個成員通過核糖體亞基和mRNA相互作用組成復合體，在蛋白質的翻譯起始階段發(fā)揮作用[13]。EIF5A2作為EIF5A家族的重要一員，與另一成員EIF5A1的廣泛表達不同，EIF5A2只存在于特定的組織（睪丸、腦或部分惡性腫瘤）或細胞中[14]。EIF5A2參與了mRNA相關的核質運輸、轉錄和翻譯等功能，尤其在翻譯過程中起著核心作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)EIF5A2在多種惡性腫瘤中過表達，促進腫瘤形成和癌細胞生長，增加癌細胞轉移，并通過多種手段（誘導上皮間充質轉換、細胞骨架重排和代謝重編程等）促進腫瘤耐藥[16]。

Zheng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，EIF5A2在膽囊癌組織中過表達。Lu等[18]通過免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)EIF5A2在72例前列腺癌組織中表達上調(diào)；實時熒光定量PCR以及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)EIF5A2在3例前列腺癌組織中的表達水平高于癌旁非瘤組織。本研究采用免疫組織化學檢測284對HCC和相應癌旁非瘤組織標本，顯示EIF5A2在HCC組織中的表達顯著上調(diào)，與上述結果一致。此外，我們還通過qRT-PCR和Western blot檢測了12對新鮮HCC及相應癌旁非瘤組織中EIF5A2的表達水平，發(fā)現(xiàn)EIF5A2在HCC中的mRNA和蛋白水平均上調(diào)。以上結果提示EIF5A2可能與肝細胞癌的發(fā)生過程有關。

進一步分析EIF5A2與肝細胞癌的臨床病理參數(shù)的關系發(fā)現(xiàn)，EIF5A2的表達與肝細胞癌的腫瘤大小、腫瘤是否多發(fā)及分化程度有關。與高-中分化組相比，低分化肝細胞癌組中的EIF5A2表達水平明顯上調(diào)；腫瘤直徑≥5 cm組的EIF5A2表達水平高于腫瘤直徑＜5 cm組，這與Yang等[19]在胃癌中的研究結果一致，該研究發(fā)現(xiàn)EIF5A2的表達與胃癌的腫瘤大小相關；此外，腫瘤多發(fā)組中EIF5A2的表達水平高于腫瘤單發(fā)組，以上結果提示EIF5A2可能與肝細胞癌的發(fā)展過程有關。已有研究表明，EIF5A2在腫瘤增殖中發(fā)揮重要作用[20]，提示在肝細胞癌中，EIF5A2可能通過影響其增殖過程進一步影響HCC的進展。然而目前關于EIF5A2影響肝細胞癌增殖的具體分子機制研究較少，值得我們在今后的研究中進一步深入探討。

染色體3q26.2擴增是在實體瘤中發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳改變之一，而位于染色體3q26的eIF5A2基因也經(jīng)常在多種人類惡性腫瘤中擴增。Meng等[20]發(fā)現(xiàn)EIF5A2表達上調(diào)與胃癌患者預后差有關。在HGC27細胞中沉默EIF5A2可顯著降低細胞的增殖能力，進一步研究顯示EIF5A2可能通過上調(diào)細胞周期蛋白D1（cyclinD1）和細胞周期蛋白D3（cyclinD3）促進胃癌細胞增殖。Yang等[19]研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中，EIF5A2表達上調(diào)患者的三年及五年術后總體生存時間較低表達者更短，并未對EIF5A2影響患者的術后無病生存時間進行評估。我們應用Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)高表達EIF5A2的HCC患者術后三年及五年總體生存時間和無病生存時間均較低表達者短；此外，我們還發(fā)現(xiàn)在腫瘤直徑≥5 cm的HCC患者中，EIF5A2高表達組的五年總體生存期和無病生存期較低表達組短。由于患者術后沒有經(jīng)過抗腫瘤治療，只進行了營養(yǎng)支持治療，因此無法分析抗腫瘤治療是否對預后產(chǎn)生影響，有待在今后研究中加以探討。隨后進一步行Cox回歸模型分析，發(fā)現(xiàn)EIF5A2的表達水平、腫瘤大小及腫瘤是否多發(fā)是影響HCC患者三年總體生存期和無病生存期的獨立預后因素；EIF5A2的表達水平是影響HCC患者五年總體生存期和無病生存期的獨立預后因素。以上Cox回歸統(tǒng)計結果所顯示的因素有所不同，推測可能與樣本數(shù)量有關（284例HCC患者中術后滿三年病例數(shù)為250例，滿五年病例數(shù)僅83例），因此有待今后繼續(xù)隨訪，增加五年病例數(shù)進一步統(tǒng)計證實。綜合以上結果，提示EIF5A2高表達與HCC患者預后差關系密切，EIF5A2可能成為評估肝細胞癌患者術后生存期的潛在標志物。

綜上所述，EIF5A2可能在肝細胞癌的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演十分重要的角色，EIF5A2高表達的HCC患者術后預后不良，因此具有判斷HCC患者的預后指標的潛在應用價值，但EIF5A2在HCC中發(fā)揮的具體生物學作用及分子機制還需要在以后的研究中繼續(xù)探討。