王 開， 荊得寶， 于素平， 劉雪陽

（海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院口腔科，上海 200135）

炎性衰老的典型表現(xiàn)是牙槽骨喪失導(dǎo)致的牙齒脫落和面型改變。因此，抑制口腔牙周炎癥，促使口腔頜骨再生，維持牙齒穩(wěn)定，成為我們面臨的問題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一種異質(zhì)的基質(zhì)細(xì)胞群，具有自我更新及多向分化的潛能，能生成分化為多種其他細(xì)胞系，是現(xiàn)代組織工程研究、基因治療和細(xì)胞免疫替代治療中的種子細(xì)胞，尤其在維持骨吸收和骨形成的骨穩(wěn)態(tài)中具有極其重要的作用[1-2]。

沉默信息調(diào)控因子6（Sirt6）是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）的脫乙?；?，具有腺二磷酸（adenosine diphosphate,ADP）核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可保護(hù)機(jī)體免受衰老和疾病的侵襲。此外，Sirt6通過減少活性氧類（reactive oxygen species,ROS）的產(chǎn)生和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）的磷酸化，抑制了腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的血管外膜成纖維細(xì)胞的炎癥[3]。過表達(dá)Sirt6可通過誘導(dǎo)椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD）模型中NP細(xì)胞的自噬來抑制NP細(xì)胞的衰老和凋亡[4]。本研究采用脂多糖（LPS，10 μg/mL）來誘導(dǎo)大鼠BMSCs的炎癥反應(yīng)，檢測Sirt6在炎癥大鼠BMSCs中的骨生成作用，為進(jìn)一步加深對Sirt6生物學(xué)功能的理解，也為研究Sirt6在BMSCs成骨分化中的作用提供新見解。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

3～4周齡SD大鼠2只，體質(zhì)量為250～300 g/只，雌雄不限，由同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司，美國）；胎牛血清（杭州四季青公司，中國）；L-抗壞血酸400 μL、β甘油磷酸鈉2 mL、地塞米松20 μL、ELISA檢測試劑盒（Sigma公司，美國）；TRIzol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；Sirt6抗體（1∶2 000）、OCN抗體（1∶2 000）、ALP抗體（1∶1 000）、BSP抗體（1∶2 000）（Abcam公司,英國）；GAPDH（1∶2 000）（CST公司，美國）；山羊抗兔IgG（Beyotime公司，中國）；低溫冷凍離心機(jī)（盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，中國）；酶標(biāo)儀（BMG LABTECH公司，德國）；Nano Drop2000分光光度計(jì)（Thermo公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；RT-qPCR熒光定量儀（ABI公司，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SD大鼠BMSCs體外分離培養(yǎng)與鑒定將SD大鼠處死后，用75%乙醇消毒浸泡，取出其股骨及脛骨，去除周圍肌肉組織，隨后將其浸泡于適量培養(yǎng)液中。用5 mL注射器吸取一端干垢端，將骨髓中的細(xì)胞吸取后沖至培養(yǎng)皿中，反復(fù)幾次，收集此細(xì)胞懸液，用200目濾網(wǎng)過濾去除雜質(zhì)后，將細(xì)胞懸液收集至離心管中，800 r/min離心5 min，棄去上清液，加入適量DMEM培養(yǎng)液混勻后，將其接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)48～72 h后更換培養(yǎng)液，每3天更換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞長滿瓶底70%～80%時，用0.25%胰酶消化后，1∶2傳代培養(yǎng)，待鑒定后，取P3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[5-6]。

1.3.2 ELISA檢測炎性因子TNF-α、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-6的表達(dá)用10 μg/mL的LPS刺激BMSCs，參照試劑盒說明書，使用ELISA試劑盒檢測不同時間點(diǎn)（12、24、48、72 h）的對照組及LPS誘導(dǎo)組培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，酶標(biāo)儀波長為450 nm，讀取吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 過表達(dá)Sirt6質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，構(gòu)建過表達(dá)載體，選用質(zhì)粒pcDNA3.1（+），利用NCBI數(shù)據(jù)庫查找目的基因的mRNA序列，針對蛋白質(zhì)編碼區(qū)域（coding sequence，CDS）選用載體設(shè)計(jì)引物及酶切位點(diǎn)。Sirt6（NM_001031649.1）基因CDS區(qū)域全長993 bp，根據(jù)載體信息選擇酶切位點(diǎn)為上游HindⅢ、下游EcoRⅠ，合成含有酶切位點(diǎn)的目的基因CDS區(qū)域序列。引物序列如下，下劃線為酶切位點(diǎn)。Sirt6-F：5′-CCCAAGCTTATGTCGGTGAATTATGCAGCAG-3′（HindⅢ）；Sirt6-R：5′-CGGAATTCTCAGCTGGCGGCAGCC-3′（EcoRⅠ）。

根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA測序比對。將Sirt6過表達(dá)質(zhì)粒（約1.5 μg）溶于245 μL Opti-mem無血清培養(yǎng)液中，此為A液,而后將5 μL lipo2000溶于245 μL Optimem無血清培養(yǎng)液中，此為B液，混勻后室溫下靜置5 min。然后將A液與B液混合，室溫靜置20 min。棄去原培養(yǎng)液，用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗1次，再加入2 mL不含血清的培養(yǎng)液。把復(fù)合物緩緩加入對應(yīng)培養(yǎng)液中，搖勻，置37℃培養(yǎng)箱6 h，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，放入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 RT-qPCR檢測Sirt6 mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為LPS組、LPS+空載體組及LPS+過表達(dá)Sirt6組。用TRIzol試劑盒分別從各組細(xì)胞中提取總RNA，用cDNA合成試劑盒轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA（cDNA）。使用SYBR Green Master Mix的實(shí)時檢測分析。引物序列如下。Sirt6上游引物：5′-AGGGTTGTCGCCATACGC-3′；下 游 引 物：5′-GGAGGACTGCCACATCAGC-3′。GAPDH上 游 引 物：5′-GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC-3′；下游引物：5′-ATGAGCCCTTCCACGATGC-3′。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性60 s；95℃30 s，54℃45 s，72℃60 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。檢測Sirt6的擴(kuò)增效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.5 Western blot技術(shù)檢測BMSCs細(xì)胞中Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白的表達(dá)用RIPA裂解緩沖液分別提取各組總蛋白。在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）中將蛋白質(zhì)分級，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，放入5%牛血清白蛋白置室溫封閉過夜。然后，用一抗和適量的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔IgG對膜進(jìn)行探測。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min,使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)信號。GAPDH作為內(nèi)源性參照。逐項(xiàng)分析各組Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白的表達(dá)。

1.3.6 茜素紅染色法檢測BMSCs礦化情況將各組細(xì)胞以1×105個/mL的密度接種于含有成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中。該培養(yǎng)液是根據(jù)先前研究中的方法制備的，每2天更換1次。誘導(dǎo)21 d后，用4%甲醛固定細(xì)胞0.5 h，用茜素紅（0.1%，pH 8.3）染色3～5 min。然后，用XDS-600C型顯微鏡（上海蔡孔光學(xué)儀器有限公司，中國）觀察各組礦化骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)，放大倍數(shù)為200倍。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的兩均數(shù)比較采用Student-t檢驗(yàn)，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)。結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

鏡下可見聚集的不規(guī)則多角形伸長細(xì)胞，為BMSCs，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長滿瓶底70%～80%時，貼壁的BMSCs細(xì)胞典型，呈梭形、網(wǎng)狀，聚集鋪開生長。詳見圖1。

圖1 倒置顯微鏡觀察BMSCs的形態(tài)特點(diǎn)（×100）Figure 1 Morphological characteristics of BMSCs by reverse microscopy(×100)

2.2 ELISA檢 測 炎 性 因 子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)

與對照組相比，同一時間點(diǎn)的LPS誘導(dǎo)組中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均呈現(xiàn)高表達(dá)，并且TNF-α的含量明顯高于IL-1β、IL-6，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨著時間的延長，TNF-α的含量未見明顯下降，而IL-1β、IL-6的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢。詳見圖2。

圖2 TNF-α、IL-1β、IL-6在不同時間點(diǎn)的表達(dá)量對比Figure 2 Expression comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 at different time point

2.3 過表達(dá)Sirt6重組真核載體測序結(jié)果

通過測序比對，Sirt6無錯配、缺失及反向鏈接。該結(jié)果表明過表達(dá)Sirt6重組真核載體構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 RT-qPCR檢測Sirt6的mRNA 水平

與LPS組和LPS+空載體組相比較，LPS+過表達(dá)Sirt6組中Sirt6的mRNA水平顯著升高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 RT-qPCR檢測不同組Sirt6的mRNA表達(dá)水平Figure 3 mRNA expression of Sirt6 in different groups by RTqPCR

2.5 Western blot檢測BMSCs中Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白的表達(dá)

與LPS組相比較，LPS+空載體組中Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白的表達(dá)量未見明顯加強(qiáng)（P>0.05），而LPS+過表達(dá)Sirt6組中，Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白水平表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著加強(qiáng)（P<0.05）。詳見圖4。

圖4 不同組BMSCs中Sirt6、OCN、ALP、BSP的蛋白表達(dá)Figure 4 Protein expression of Sirt6,OCN,ALP and BSP in different groups of BMSCs

2.6 茜素紅染色法檢測不同組中BMSCs的骨化鈣結(jié)節(jié)生成情況

成骨誘導(dǎo)21 d后，LPS組鏡下未見明顯的鈣結(jié)節(jié)形成，LPS+空載體組可見極少量的鈣結(jié)節(jié)區(qū)域，而LPS+過表達(dá)Sirt6組鏡下可見大量斑塊狀的紅色鈣結(jié)節(jié)形成，說明過表達(dá)Sirt6可以抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)骨生成。詳見圖5。

圖5 鏡下觀察不同組中鈣結(jié)節(jié)的生成量（×200）Figure 5 Microscopic observation of production of calcium nodules in different groups(×200)

3 結(jié)論

BMSCs具有較強(qiáng)的免疫抑制特性，能夠通過分泌抗炎蛋白，抑制炎性因子的釋放和遷移，發(fā)揮直接或者間接的抗菌和保護(hù)周圍組織的作用[7]。此外，研究證實(shí)，炎性狀態(tài)下，BMSCs較牙周膜干細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨分化能力[8]。利用LPS誘導(dǎo)BMSCs發(fā)生炎癥反應(yīng)，探討Sirt6在炎性條件下對BMSCs骨向分化的作用，能加深我們對BMSCs成骨的理解。我們通過原代貼壁培養(yǎng)技術(shù)從SD大鼠骨髓中成功提取了BMSCs，為后續(xù)研究提供了良好的研究載體。

LPS是脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，為革蘭氏陰性菌外膜層中特有的一種化學(xué)成分，也是內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分。LPS具有強(qiáng)大的免疫刺激能力，極低水平的LPS足以能誘導(dǎo)TNF-α和白細(xì)胞介素家族（如IL-18）等炎癥介質(zhì)的合成與釋放。研究表明，炎性衰老過程中存在大量炎性因子的表達(dá)，如IL-1、IL-6和TNF-α等典型炎癥標(biāo)志物水平的升高。衰老與炎癥是相互作用的，衰老過程常伴隨炎癥穩(wěn)態(tài)失衡，而炎癥又可導(dǎo)致衰老。牙周炎導(dǎo)致頜骨和牙齒的喪失，即可看作炎性衰老的進(jìn)程之一。TNF-α促進(jìn)炎癥細(xì)胞侵入牙周組織，破壞骨改建的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，使骨代謝發(fā)生紊亂，加速骨組織的喪失[9]。本研究利用LPS刺激BMSCs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)量升高，同時BMSCs也具有反向抑制炎癥因子分泌的功能。然而，也有學(xué)者認(rèn)為,炎性條件下TNF-α?xí)碳す堑男纬桑⑼茢郥NF-α具有不同的功能，可能與TNF-α的干預(yù)時間或骨形成的不同階段有關(guān)[10-11]。

已有報(bào)道表明，Sirt6可抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管外膜成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[12]。在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）軟骨和滑液中觀察到IL-1β和TNF-α等促炎細(xì)胞因子水平升高，進(jìn)而增加基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，降低軟骨膠原和蛋白多糖的含量。Lee等[13]證明，過表達(dá)Sirt6可以抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)。此外，Xiao等[14-15]的研究表明，干擾Sirt6可以抑制骨向分化，影響成骨細(xì)胞的生成；靶向miR-186下調(diào)，可以抑制小鼠BMSCs的成骨分化，而過表達(dá)Sirt6則可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢。本研究中，Sirt6的過表達(dá)干擾了炎癥BMSCs中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，減弱了炎癥反應(yīng)的程度。這些結(jié)果表明，Sirt6在BMSCs中是一種抗炎因子。Sirt6通過抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，減輕LPS誘導(dǎo)的BMSCs炎癥反應(yīng)。然而，在LPS長時間的作用下，BMSCs也會受到一定的損傷，自身功能會減弱。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)Sirt6在炎癥條件下能刺激BMSCs向成骨細(xì)胞分化。過表達(dá)Sirt6后，成骨標(biāo)志物OCN、ALP、BSP的蛋白水平明顯升高，并且在LPS的刺激下，骨性分化生成鈣結(jié)節(jié)的表達(dá)量明顯增多。這一發(fā)現(xiàn)與之前的報(bào)告[16]一致，Sirt6通過抑制核因子-核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化，也可以通過正向調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）通路促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化。本課題組通過過表達(dá)Sirt6調(diào)控p38/ERK信號通路，也能促進(jìn)大鼠BMSCs的成骨分化，但該結(jié)果尚未發(fā)表。所有這些結(jié)果進(jìn)一步證明，Sirt6在BMSCs的成骨過程中是一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，具有抑制炎癥和促進(jìn)骨向分化的雙重作用。隨著年齡的增長，Sirt6蛋白逐漸衰減，炎性衰老趨勢明顯。因此，如何控制抗衰老蛋白Sirt6的衰減周期，增強(qiáng)Sirt6的表達(dá)，進(jìn)而延長機(jī)體的壽命，仍然是擺在我們面前的一個挑戰(zhàn)。