張慶飛，郭青松，虞炯瑩，操文杰，王衛(wèi)民

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.武漢市江夏區(qū)農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊(duì)，武漢 430200)

彭澤鯽(Carassiusauratusvar.pengsenensis)產(chǎn)于江西省九江市彭澤縣，屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯽屬(Carassius)，具有生長快、個(gè)體大、抗病性及抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，是淡水養(yǎng)殖的優(yōu)良品種。彭澤鯽最初被認(rèn)為是正常的二倍體(2n=166)，營兩性生殖[1]，現(xiàn)已公認(rèn)彭澤鯽為三倍體(3n=150+)魚類，且生殖方式為兩性型雌核發(fā)育[2]。興國紅鯉(Cyprinuscarpiouvar.singuonensis)產(chǎn)于江西省興國縣，屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯉屬(Cyprinus)，其背寬肉厚、肉質(zhì)鮮美、生長快、食性廣且抗逆性強(qiáng)，同時(shí)興國紅鯉雜交親和力強(qiáng)，是重要的雜交親本。

天然雌核發(fā)育的魚類通常為三倍體或四倍體[3]，在發(fā)育過程中精子只刺激卵子發(fā)育，本身并不融合，后代的生物學(xué)特性幾乎與母本相同而不具有父本的遺傳性狀。目前已有研究表明，利用異精刺激天然雌核發(fā)育魚類可產(chǎn)生正常的子代，但是不同種類的雄性精子產(chǎn)生的誘導(dǎo)效果差異顯著。本實(shí)驗(yàn)室在興國紅鯉雄魚精子刺激彭澤鯽雌核發(fā)育的子代中發(fā)現(xiàn)了四倍體，并于2020年5月進(jìn)行擴(kuò)繁得到子二代，推測該四倍體發(fā)生了兩性融合，產(chǎn)生了遠(yuǎn)緣雜交四倍體。遠(yuǎn)緣雜交魚類通常結(jié)合雙親的優(yōu)勢性狀，具有較高的育種潛力，但能否穩(wěn)定遺傳仍存疑問。染色體作為遺傳信息的載體，可以直觀地了解其遺傳變化和遺傳特征，進(jìn)一步判斷子代的親緣關(guān)系，因而對其子代進(jìn)行倍性鑒定及染色體核型分析極為重要。

本研究通過對彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代進(jìn)行倍性鑒定和染色體核型分析，旨在為遠(yuǎn)緣雜交多倍體育種提供理論依據(jù)，探討新品種的應(yīng)用前景，同時(shí)也為原位雜交等研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

彭澤鯽親本來源于江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)南湖水產(chǎn)養(yǎng)殖基地進(jìn)行產(chǎn)前培育，并在2020年5月挑選性腺成熟且健康無病的親本進(jìn)行人工繁殖得到子代；實(shí)驗(yàn)室前期在興國紅鯉精子刺激彭澤鯽卵子雌核發(fā)育的子代中發(fā)現(xiàn)四倍體，并于2020年5月挑選性腺成熟且健康無病的親本進(jìn)行繁殖得到健康子代。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血液采集

用EDTA抗凝劑浸潤一次性注射器內(nèi)壁，采用尾靜脈抽血的方式，從魚體側(cè)線下方扎針，碰到脊柱時(shí)向后輕拉針頭，抽血1 mL置于2 mL離心管中，4 ℃保存，用于測定DNA相對含量，未加抗凝劑的血液直接用于血涂片的制備。

1.2.2 DNA相對含量測定

選用三倍體彭澤鯽血細(xì)胞作為內(nèi)參，通過流式細(xì)胞儀檢測倍性。取抗凝血劑10 μL置于2 mL離心管中，加入500 μL DAPI染液，再加入500 μL PBS緩沖液，用300目濾膜過濾，避光染色5 min后，上機(jī)檢測。

1.2.3 血涂片制備

取一滴未加抗凝劑血液滴在光滑平整的載玻片上，將載玻片緩慢靠近血液，待血液散開后，以30°～40°的角度勻速向前推片形成血膜，待血膜完全晾干后進(jìn)行染色。將Giemsa母液用PBS緩沖液稀釋10倍后配置成工作液，滴加Giemsa染液染色1 min，再滴加等量的PBS緩沖液，染色30 min。30 min后流水沖洗，室溫干燥。每種魚制作10張血涂片，在Olympus正置顯微鏡下觀察拍照，每張血涂片測量20個(gè)紅細(xì)胞的長軸a和短軸b，根據(jù)公式表面積S=πab/4、體積V=a2b/1.91計(jì)算紅細(xì)胞和細(xì)胞核的表面積與體積。

1.2.4 組織塊原代細(xì)胞培養(yǎng)

取兩種子代幼魚并用75%酒精消毒體表，剪取鰭條及肌肉置于盛有AIM的培養(yǎng)皿中浸泡2 h，每半小時(shí)更換AIM，期間切除刮去多余組織。將組織塊切碎成1 mm2小塊均勻鋪散在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用移液管從細(xì)胞培養(yǎng)瓶側(cè)面緩慢加入4～5 mL原代培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置6～8 h，翻轉(zhuǎn)后靜置培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿時(shí)，可消化傳代，原瓶可保留繼續(xù)生長細(xì)胞。

1.2.5 染色體標(biāo)本制備

參考祝冬梅[4]染色體標(biāo)本制備方法，取鋪滿細(xì)胞的細(xì)胞瓶，加入秋水仙素至終濃度為1.5 μg/mL，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱處理3 h。吸出秋水仙素，用0.25%胰酶消化，再加入等量原代培養(yǎng)基，中止消化。將細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)入離心管，1 000 r/min離心7 min，棄上清液。冰水低滲10 min，1 000 r/min離心7 min。用卡諾固定液(甲醇 ∶冰乙酸=3 1，現(xiàn)配現(xiàn)用)固定2～3次，每次15 min，1 000 r/min離心7 min。吹打混勻細(xì)胞，滴片后自然風(fēng)干，用Giemsa染液染色15 min，沖洗后自然晾干。

1.2.6 核型分析

用Olympus正置顯微鏡低倍鏡查找分裂相，再用油鏡拍照。選取126個(gè)分散良好、圖像清晰、數(shù)目完整的中期分裂相統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。并從中選取5個(gè)分散良好、形態(tài)清晰的中期分裂相，利用Photoshop、Image J軟件放大圖像并參考Levan等[5]提出的染色體類型劃分標(biāo)準(zhǔn)對5個(gè)分裂相進(jìn)行參數(shù)測量分析，染色體相對長度=(染色體長度/染色體組總長)×100；臂比=長臂/短臂，制作染色體核型圖。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞DNA相對含量

以彭澤鯽紅細(xì)胞為內(nèi)參，利用流式細(xì)胞儀對雜交四倍體子代紅細(xì)胞DNA相對含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。如圖，橫坐標(biāo)表示紅細(xì)胞熒光值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。彭澤鯽平均熒光值約為301.24±2.42，雜交四倍體子代熒光值約為405.79±3.18，二者DNA相對含量比為0.74，即雜交四倍體子代為四倍體。

圖1 兩種子代紅細(xì)胞DNA相對含量測量峰圖

2.2 紅細(xì)胞形態(tài)比較

彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代、彭澤鯽雌核發(fā)育子代血涂片經(jīng)Giemsa染液染色晾干后，在Olympus BX53正置顯微鏡油鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果見圖版1。如圖所示，兩種魚紅細(xì)胞經(jīng)染色后細(xì)胞核顏色較深，核質(zhì)分明。彭澤鯽雌核發(fā)育子代紅細(xì)胞長軸略短于雜交四倍體子代，從形態(tài)上看雜交四倍體子代更長。由于倍性增加紅細(xì)胞發(fā)生異形的概率增高，因而雜交四倍體子代血涂片中發(fā)現(xiàn)較高比例的異形紅細(xì)胞，如啞鈴型紅細(xì)胞(黑色箭頭)、無核紅細(xì)胞(綠色箭頭)、多核紅細(xì)胞(藍(lán)色箭頭)，而在彭澤鯽中異形紅細(xì)胞較少。

2.3 紅細(xì)胞大小比較

彭澤鯽雌核發(fā)育子代、彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代紅細(xì)胞測量結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：雜交四倍體子代紅細(xì)胞長軸為彭澤鯽的1.13倍，差異極顯著(P<0.01)，但紅細(xì)胞短軸與彭澤鯽差異不顯著，四倍體子代紅細(xì)胞表面積、體積均極顯著地大于彭澤鯽(P<0.01)，分別為彭澤鯽的1.08、1.22倍。因而在顯微鏡下可以觀察到雜交四倍體子代紅細(xì)胞更大、更長，彭澤鯽紅細(xì)胞呈小且圓的橢圓形。在紅細(xì)胞核方面，四倍體子代的長軸、核表面積、核體積極顯著地大于彭澤鯽(P<0.01)，分別為彭澤鯽的1.17、1.20、1.40倍，相同的是紅細(xì)胞核短軸二者差異不顯著。

表1 彭澤鯽雌核發(fā)育子代、彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代紅細(xì)胞及核大小比較

2.4 肌肉、鰭條組織細(xì)胞培養(yǎng)

兩種子代肌肉、鰭條組織塊接種到T25培養(yǎng)瓶后生長情況見圖版Ⅱ、Ⅲ。如圖所示，兩種子代肌肉、鰭條組織塊貼壁情況較好，細(xì)胞圍繞組織塊呈發(fā)散狀生長。彭澤鯽組織塊3 d開始遷出細(xì)胞；7 d時(shí)在組織塊周圍有梭狀細(xì)胞迅速生長；9 d時(shí)組織塊之間細(xì)胞接觸，生長迅速；15 d時(shí)，一些組織塊周圍細(xì)胞堆積變形，生長緩慢；18 d時(shí)基本鋪滿T25細(xì)胞瓶的80%，達(dá)到傳代要求。雜交四倍體子代同樣是3 d遷出細(xì)胞；5 d時(shí)已有組織塊之間細(xì)胞接觸生長；10 d時(shí)生長迅速；18 d時(shí)已經(jīng)達(dá)到傳代要求。傳代結(jié)果見圖版Ⅳ、Ⅴ，由于組織塊周圍細(xì)胞密集較難被胰酶消化下來，在傳代過程中一些細(xì)胞被胰酶過度消化導(dǎo)致細(xì)胞死亡(黑色箭頭)，懸浮在培養(yǎng)基中。相比于原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞增殖速度快，僅4～5 d就可以長滿T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶。截至目前，兩種子代細(xì)胞已經(jīng)傳代到第10代。

圖版Ⅳ 彭澤鯽子代肌肉、鰭條組織塊傳代培養(yǎng)(4×10)

圖版Ⅱ 彭澤鯽雌核發(fā)育子代肌肉、鰭條組織塊原代培養(yǎng)(4×10)

2.5 染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)

染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。經(jīng)過觀察統(tǒng)計(jì)，染色體數(shù)目在160以下有5個(gè)細(xì)胞；161～170有3個(gè)細(xì)胞；171～180的有9個(gè)細(xì)胞；181～190的有23個(gè)細(xì)胞；191～200的有15個(gè)細(xì)胞；大部分完整的中期分裂相染色體數(shù)目在201～210條，占55.56%。染色體數(shù)目分布范圍廣泛，但是在這個(gè)范圍內(nèi)并沒有明顯的眾數(shù)。

表2 彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代染色體數(shù)目

2.6 染色體核型分析

按照Levan[6]的染色體劃分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)測量結(jié)果對染色體進(jìn)行分型，結(jié)果見圖版Ⅵ，其中包括42條中部著絲粒染色體(m)、64條亞中部著絲粒染色(sm)、62條亞端部著絲粒染色體(st)、32條端部著絲粒染色體(t)，染色體臂數(shù)(NF)為368，其核型公式為4n=42m+64sm+62st+32t，NF=368，未發(fā)現(xiàn)異型性染色體。

圖版Ⅵ 彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代染色體

3 討論

3.1 DNA相對含量與倍性

魚類遠(yuǎn)緣雜交可以獲得不同倍性的雜交后代[6]，但是僅通過魚類體表特征很難鑒定魚類的倍性。常用的倍性鑒定方法有相對DNA含量測定法、紅細(xì)胞體積測量法、染色體數(shù)目及核型分析法[7]。DNA作為主要的遺傳信息，其含量與倍性呈正比關(guān)系[8-9]，利用流式細(xì)胞儀測定其相對含量可以迅速、直接地反映魚類染色體倍性，這種方法的優(yōu)勢在于對魚體的傷害小、自動化、快速高通量且準(zhǔn)確度高。目前，通過流式細(xì)胞儀技術(shù)鑒定倍性已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于動、植物中，如陳落落等[10]通過此方法鑒定出二倍體、三倍體虹鱒；方禮豹等[8]采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法鑒定出二倍體、四倍體泥鰍及大鱗副泥鰍雜交四倍體子代的倍性；劉少軍[6]通過此方法鑒定鯽魴、鯽鲌等多種四倍體魚類的倍性。另外，在馬鈴薯[11]、毛竹[12]等多種植物倍性鑒定上也廣泛運(yùn)用此技術(shù)。本研究中，將三倍體彭澤鯽作為內(nèi)參，測定雜交四倍體子代紅細(xì)胞相對DNA含量約為內(nèi)參的1.33倍，即該雜交四倍體子代為四倍體，這一結(jié)果與桂建芳等[13]利用異源精子誘導(dǎo)異育銀鯽雌核發(fā)育其子代可能存在四倍體的研究結(jié)果一致。本研究也表明，通過選取合適的內(nèi)參，流式細(xì)胞術(shù)是一種快速、可靠鑒定倍性的方法。

3.2 紅細(xì)胞形態(tài)、大小的比較

紅細(xì)胞體積測量法也是輔助鑒定魚類倍性的常用方法，其原理是細(xì)胞中染色體數(shù)目或DNA的含量與細(xì)胞核的大小呈正比[14]，且細(xì)胞總是維持穩(wěn)定的核質(zhì)比[15]。這種方法的優(yōu)勢在于材料易得、易行直觀。本研究中雜交四倍體子代紅細(xì)胞長徑略大于彭澤鯽，其形態(tài)相較于彭澤鯽雌核發(fā)育子代更長。同時(shí)我們在雜交四倍體子代中發(fā)現(xiàn)了許多啞鈴狀核、無核、多核等變異紅細(xì)胞。這些異形現(xiàn)象在多倍體紅細(xì)胞中是客觀存在的[16]。同時(shí)在現(xiàn)有的鯽、草魚、鯉、鳙等硬骨魚類血涂片研究中都發(fā)現(xiàn)有紅細(xì)胞分裂的現(xiàn)象[16]，因而推測這種異形紅細(xì)胞可能是由于紅細(xì)胞分裂導(dǎo)致；也可能由于倍性的增加，部分紅細(xì)胞難以維持穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞變形；此外有研究表明，饑餓脅迫也會影響紅細(xì)胞形態(tài)，導(dǎo)致產(chǎn)生不規(guī)則形狀或異形核紅細(xì)胞[17]。但是這種現(xiàn)象在彭澤鯽中極少，因而這一異形現(xiàn)象也可以成為判斷倍性的依據(jù)。本研究中雜交四倍體子代紅細(xì)胞體積是彭澤鯽的1.22倍，核體積是彭澤鯽的1.40倍，但與預(yù)測理論值1.33不符。這一結(jié)果與陳落落等[10]、俞小牧等[18]研究結(jié)果相似。導(dǎo)致測量結(jié)果與理論值偏差與紅細(xì)胞的生長受到許多因素的影響有關(guān)，如魚類年齡大小、性別、生活環(huán)境、生長代謝情況等。同時(shí)本研究在同一張血涂片中也觀察到了大小不同的紅細(xì)胞，這是因?yàn)檫@些細(xì)胞處在不同的生長時(shí)期。與本研究不同的是，鄒曙明等[19]在同源四倍體和三倍體團(tuán)頭魴紅細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)其體積并未隨倍性增加而增大。這表明不同魚類紅細(xì)胞大小是有差異的，單純依靠紅細(xì)胞測量法鑒定倍性可能不準(zhǔn)確，因而結(jié)合上述流式細(xì)胞術(shù)對魚體進(jìn)行倍性鑒定更為可靠。

3.3 組織細(xì)胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本的制備

魚類的肌肉和鰭條組織具有極強(qiáng)的再生能力，遷出細(xì)胞的效果較好，又易于貼壁生長，是培養(yǎng)原代細(xì)胞的理想材料，同時(shí)染色體數(shù)目以及核型分析也是細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)閮煞N子代規(guī)格較小，取頭腎等方法均不適用，因而選取了肌肉、鰭條組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種組織遷出的細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，通常3 d就可以達(dá)到再次傳代的要求，目前可以傳代到10代以上，但能否建立細(xì)胞系仍需進(jìn)一步研究。此外，有研究表明，不同濃度的秋水仙素、低滲、固定液比例、滴片高度、冷熱滴片法等因素會影響染色體的形態(tài)。在制備染色體標(biāo)本時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)提前12 h更換培養(yǎng)基會使細(xì)胞狀態(tài)較好，染色體中期分裂相更多，形態(tài)更清晰；冰水低滲效果在15 min為宜，否則離心后細(xì)胞較少，但是隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞越來越難漲開，可能是由于細(xì)胞在多次傳代后衰老，已經(jīng)過了對數(shù)生長期，細(xì)胞狀態(tài)不好；由于染色體數(shù)目較多，固定液最佳比例為甲醇 ∶冰醋酸=2 ∶1；離心速度不能超過1 000 r/min，否則細(xì)胞容易脹破；滴片高度要大于1 m。

3.4 染色體數(shù)目及核型分析

染色體是遺傳信息的載體，是生命體進(jìn)化的基礎(chǔ)，同時(shí)染色體分析也是鑒定雜交四倍體子代倍性、遺傳組成最直接、最準(zhǔn)確的方法[20]。近年來，許多研究者對不同地區(qū)鯽以及雜交鯽進(jìn)行了倍性鑒定和染色體核型分析的研究，結(jié)果見表3。

表3 不同地區(qū)鯽、雜交鯽核型分析結(jié)果

由表可知不同地區(qū)鯽以及雜交鯽的核型公式均有不同。例如貝爾鯽與銀鯽均為三倍體但核型公式卻不同；銀鯽的染色體核型與野生鯽呈倍性關(guān)系；雜交鯽后代染色體核型公式會因父母本的不同而不同等，這些現(xiàn)象說明在鯽的進(jìn)化過程中發(fā)生了染色體數(shù)目的加倍以及結(jié)構(gòu)變異，同時(shí)這種核型的差異性也可能是因?yàn)榈乩矸N群的差異或研究方法、測量誤差所致。本實(shí)驗(yàn)中，興國紅鯉是二倍體，核型公式為2n=28m+22sm+50st，NF=150；彭澤鯽是公認(rèn)的三倍體，染色體數(shù)目為3n=150+，其核型公式為3n=33m+51sm+33st+33t[2]。本實(shí)驗(yàn)通過對126個(gè)染色體中期分裂相計(jì)數(shù)、測量分析得知：雜交四倍體子代的染色體數(shù)目分布范圍較廣，在150～210均有分布，其中200～210條占55.56%，但沒有明顯的眾數(shù)。因而我們推測雜交四倍體子代的染色體繼承了彭澤鯽的150+染色體以及本興國紅鯉配子的染色體，其核型公式為4n=42m+64sm+62st+32t，NF=368。造成分布范圍廣的原因可能是在制備染色體標(biāo)本時(shí)細(xì)胞疊加導(dǎo)致染色體增加或者滴片時(shí)染色體丟失[28]。在鯽的染色體研究中并不缺乏染色體數(shù)目不確定的情況，如銀鯽。有研究表明二倍體銀鯽染色體數(shù)目為100；三倍體為150或由150條基本染色體和6條或8～12條超數(shù)染色體組成；四倍體則為206條[29-30]，這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但是我們發(fā)現(xiàn)雜交四倍體子代核型公式與彭澤鯽加興國紅鯉配子核型公式并不相同，這可能由以下原因?qū)е拢涸诩?xì)胞生長發(fā)育的過程中，染色體呈現(xiàn)周期性變化，盡管有絲分裂中期是最好的觀察時(shí)期，但仍受外界環(huán)境影響，例如制備染色體過程中秋水仙素的濃度、培養(yǎng)溫度等因素會導(dǎo)致染色體縮短，細(xì)胞狀態(tài)、低滲液種類及處理時(shí)間、固定液比例、滴片高度、冷熱滴片法等因素會影響染色體的形態(tài)；精卵結(jié)合后，染色體發(fā)生重組；實(shí)驗(yàn)方法的不同以及測量過程中的誤差等[23]。

小島吉雄[31]將真骨魚類劃分為低位類、中位類和高位類3個(gè)演化類群。從低位類群到高位類群，染色體越收斂，端部著絲粒染色體越多，染色體臂數(shù)越少。根據(jù)吳政安[32]研究結(jié)果：中部、亞中部著絲粒染色體較多屬于低位類；反之，為高位類型。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，中部、亞中部染色體共101條，占50.5%，即彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代屬于中位類群。

4 小結(jié)

綜上所述，采用三種方法對彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代倍性鑒定結(jié)果為四倍體，其染色體核型公式為4n=42m+64sm+62st+32t，NF=368。理論上該雜交四倍體子代遺傳了彭澤鯽和興國紅鯉的染色體，但仍需要對其染色體組成進(jìn)一步分析。由于遠(yuǎn)緣雜交四倍體子代可能會體現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，有關(guān)雜交四倍體子代在生長、形態(tài)、抗病等優(yōu)勢有待進(jìn)一步研究。

圖版Ⅲ 彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代肌肉、鰭條組織塊原代培養(yǎng)(4×10)

Plate Ⅲ Primary culture of muscle and fin tissue blocks ofC.auratusvar.pengsenensis×C.carpiovar.singuonensis(4×10)

1.2 d肌肉組織塊貼壁；2.2 d鰭條組織快貼壁；3.3 d開始遷出細(xì)胞；4.5 d細(xì)胞生長迅速；5.10 d時(shí)組織塊遷出細(xì)胞接觸，生長迅速；6.15 d組織塊周圍細(xì)胞密集，變形；7.18 d細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%

圖版Ⅴ 彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代肌肉、鰭條組織塊傳代培養(yǎng)(4×10)

Plate ⅤC.auratusvar.pengsenensis×C.carpiovar.singuonensissubculture of muscle and fin tissue of hybrid progeny (4×10)

1.代傳1 d；2.傳代2 d；3.傳代4 d；4.傳代5 d；黑色箭頭為死亡細(xì)胞

圖版Ⅰ 彭澤鯽雌核發(fā)育子代、彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代紅細(xì)胞(100×10)

Plate I red blood cells (100 × 10) of inbred progenies ofC.auratusvar.pengsenensisand hybrid progeny ofC.auratusvar.pengsenensis×C.carpiovar.singuonensis

圖1～2.彭澤鯽雌核發(fā)育子代紅細(xì)胞圖；3～4.彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代紅細(xì)胞圖；藍(lán)色箭頭為多核紅細(xì)胞；綠色箭頭為無核紅細(xì)胞；黑色箭頭為啞鈴型紅細(xì)胞