李茂華,李天才,曾如奎,趙宇航,宋昭彬,楊 坤

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065； 2.雅礱江流域水電開(kāi)發(fā)有限公司，成都 610051； 3.西華師范大學(xué)生態(tài)研究院,西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川南充 637002)

魚(yú)類人工增殖放流是保護(hù)或恢復(fù)天然漁業(yè)資源的重要措施之一。國(guó)際上對(duì)魚(yú)類增殖放流多持謹(jǐn)慎態(tài)度，提出了“負(fù)責(zé)任的增殖放流”概念，提倡先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性放流，持續(xù)監(jiān)測(cè)放流群體，避免發(fā)生無(wú)意義甚至有害的增殖放流[1-3]。我國(guó)魚(yú)類資源非常豐富，特有種類多，但受過(guò)度捕撈、水體污染和水利水電工程修建等影響，漁業(yè)資源嚴(yán)重衰退，魚(yú)類瀕危物種數(shù)逐年升高[4-5]。為依法保護(hù)和合理利用水生生物資源，實(shí)施可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，我國(guó)已將人工增殖放流作為一項(xiàng)長(zhǎng)期的基本政策，每年放流苗種數(shù)百億尾(粒)。不過(guò)，我國(guó)大部分增殖放流活動(dòng)沒(méi)有對(duì)放流魚(yú)類進(jìn)行標(biāo)記，也缺少對(duì)魚(yú)類放流后的長(zhǎng)期跟蹤監(jiān)測(cè)[6-7]。

耳石熒光標(biāo)記是一類在魚(yú)類增殖放流中已經(jīng)大量應(yīng)用的批量標(biāo)記方法，適用于魚(yú)類仔、稚、幼魚(yú)等早期生長(zhǎng)階段或小型魚(yú)類[8]。通常，將一些易與鈣離子結(jié)合的熒光物質(zhì)，通過(guò)溶液浸泡或加入餌料投喂的方式進(jìn)入魚(yú)體，沉積在耳石上形成熒光標(biāo)記。常用的熒光物質(zhì)有四環(huán)素類(tetracycline)、茜素絡(luò)合物(alizarin complexone，AC)、茜素紅(alizarin Red S，ARS)和鈣黃綠素(calcein，CAL)等，其中AC和ARS的標(biāo)記效果較好[8]。但耳石熒光標(biāo)記也存著一些缺點(diǎn)，如安全濃度不高(通常為50～200 mg/L)、容易對(duì)魚(yú)體造成損傷，因而需在實(shí)施前開(kāi)展大量實(shí)驗(yàn)弄清合適條件[9-11]。此外，該方法提供標(biāo)記信息的模式很少，通常只能重復(fù)標(biāo)記，而重復(fù)次數(shù)是極其有限的[10]。如果能尋找到更多熒光物質(zhì)標(biāo)記并組合使用，則可在一定程度上增加標(biāo)記信息。

短須裂腹魚(yú)(Schizothoraxwangchiachii)為鯉科(Cyprinidae)裂腹魚(yú)亞科(Schizothoracinae)裂腹魚(yú)屬的魚(yú)類，主要分布于金沙江及其支流雅礱江、烏江等水系[12]。過(guò)去的二十年間，由于受水利水電工程修建、過(guò)度捕撈等影響，短須裂腹魚(yú)野外資源量衰退明顯[13-15]。為彌補(bǔ)人類活動(dòng)造成的不利影響，近年來(lái)金沙江、雅礱江流域修建了許多魚(yú)類增殖放流站，采用當(dāng)年人工繁殖當(dāng)年放流的方式，陸續(xù)開(kāi)展了大規(guī)模的魚(yú)類人工增殖放流[15-17]。短須裂腹魚(yú)放流苗種一般為全長(zhǎng)4～12 cm的幼魚(yú)，規(guī)格較小。目前，迫切需要使用合適的方法標(biāo)記短須裂腹魚(yú)放流群體，進(jìn)行“標(biāo)記-重捕”研究，科學(xué)評(píng)估增殖放流效果，以及時(shí)調(diào)整、優(yōu)化放流策略，使人工增殖放流達(dá)到資源增殖和物種保護(hù)的目的。鑒于此，本研究使用鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride，TC)、AC、ARS和CAL浸泡標(biāo)記短須裂腹魚(yú)早期魚(yú)苗(仔、稚魚(yú))，并探討與茜素絡(luò)合物同屬蒽醌類化合物的酸性茜素藍(lán)B(acid alizarin blue B，AAB)、茜素黃GG(alizarin yellow GG，AYG)浸泡標(biāo)記短須裂腹魚(yú)的可行性，以期為短須裂腹魚(yú)大規(guī)模標(biāo)記和放流效果評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 魚(yú)苗來(lái)源與管理

研究所用短須裂腹魚(yú)早期魚(yú)苗均由雅礱江錦屏·官地水電站魚(yú)類增殖放流站人工繁殖和培育。用于繁殖的親魚(yú)為2011-2012年捕撈自雅礱江大河灣江段的野生個(gè)體。實(shí)驗(yàn)所需魚(yú)苗根據(jù)標(biāo)記方案從該站隨機(jī)選取，但確保同一次實(shí)驗(yàn)的魚(yú)苗日齡、規(guī)格基本一致。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，魚(yú)苗飼養(yǎng)在21.5 cm(長(zhǎng))×13.5 cm(寬)×6.5 cm(高)的白色塑料水槽中，貯潔凈的養(yǎng)殖水1 L。每天8:00、12:00、16:00、20:00分別飽食投喂浮性顆粒飼料(鳳凰牌)；每天吸取污物一次并換水1/3，每?jī)商鞆氐讚Q水一次并清洗水槽；每天8:00、14:00、20:00測(cè)量水溫并記錄。每次浸泡標(biāo)記開(kāi)始前，饑餓24 h。浸泡標(biāo)記結(jié)束后徹底清洗水槽并換上潔凈的養(yǎng)殖水，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2 試劑與配制

本研究所用的熒光物質(zhì)為AC、ARS、AAB、AYG、TC和CAL，均為分析純的粉劑(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)。用潔凈的養(yǎng)殖水，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案配制成不同濃度的溶液，每個(gè)空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組溶液均為1 L。魚(yú)苗取樣或測(cè)量時(shí)使用MS-222溶液(約100 mg/L)麻醉處理。

1.3 標(biāo)記方案

1.3.1 AC標(biāo)記

隨機(jī)選取8日齡短須裂腹魚(yú)570尾，全長(zhǎng)(15.23±0.88)mm(n=20)，平均分成19組，每組30尾。其中一組作為空白對(duì)照，其余18組使用AC溶液浸泡標(biāo)記，每組實(shí)驗(yàn)條件由浸泡濃度50、100、150、200、250、300 mg/L和浸泡時(shí)間6、12、24 h兩兩組合，水溫為(14.7±0.9)℃。20、55日齡短須裂腹魚(yú)浸泡標(biāo)記實(shí)驗(yàn)與此相同，魚(yú)苗全長(zhǎng)分別為(16.51±0.71)、(25.58±1.43)mm，水溫分別為(15.3±1.5)、(15.2±0.8)℃。不過(guò)，55日齡魚(yú)苗規(guī)格較大，僅使用190尾，每組10尾。為評(píng)估AC標(biāo)記對(duì)魚(yú)體生長(zhǎng)的影響，在20日齡短須裂腹魚(yú)浸泡標(biāo)記結(jié)束16 d之后，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組魚(yú)體全長(zhǎng)(精確至0.01 mm)，然后將魚(yú)體保存在99.7%的酒精中。8日齡和55日齡實(shí)驗(yàn)組則在浸泡結(jié)束10 d后，直接將魚(yú)體全部保存在99.7%的酒精中，以待摘取耳石。

1.3.2 AC或ARS重復(fù)標(biāo)記

隨機(jī)選取50日齡短須裂腹魚(yú)稚魚(yú)340尾，全長(zhǎng)(25.58 ± 1.24) mm(n=20)，均分為17組，每組20尾，其中1組作空白對(duì)照組， 8組作AC重復(fù)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組，剩余8組作ARS重復(fù)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組。(1)AC重復(fù)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)：按照表1的方案，使用100、200、300、400 mg/L的AC溶液浸泡標(biāo)記其中8組，每個(gè)濃度按浸泡時(shí)間分2組，水溫(14.7±1.0)℃，第一次浸泡結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)至83日齡，全長(zhǎng)(35.02 ± 1.62) mm(n=10)，使用同樣的條件重復(fù)標(biāo)記各組尚存活的魚(yú)體一次，水溫(16.0 ± 0.8)℃，但將原浸泡時(shí)間為12 h的組延長(zhǎng)至48 h。(2)ARS重復(fù)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)：使用ARS溶液浸泡標(biāo)記其余8組，標(biāo)記過(guò)程與AC重復(fù)標(biāo)記相同，方案見(jiàn)表1。第二次浸泡標(biāo)記結(jié)束10 d后，將魚(yú)體全部保存在99.7%的酒精中，以待摘取耳石。

表1 使用AC或ARS重復(fù)標(biāo)記短須裂腹魚(yú)實(shí)驗(yàn)方案

1.3.3 TC標(biāo)記

隨機(jī)選取8日齡短須裂腹魚(yú)仔魚(yú)210尾，全長(zhǎng)(15.23±0.88)mm(n=20)，平均分成7組，每組30尾。然后分別使用0(空白對(duì)照組)、50、100、150、200、250、300 mg/L的TC溶液浸泡24 h，水溫(14.7±0.9)℃。浸泡結(jié)束30 d后，將魚(yú)體全部保存在99.7%的酒精中。

1.3.4 其他熒光染料的標(biāo)記

隨機(jī)選取22日齡短須裂腹魚(yú)仔魚(yú)390尾，全長(zhǎng)(16.27±0.34)mm(n=20)，平均分成13組，每組30尾，其中一組作為空白對(duì)照組。熒光物質(zhì)CAL溶液濃度依次為100、200、400、800 mg/L，AYG及AAB溶液濃度依次為50、100、150、200 mg/L，分別使用相應(yīng)濃度的染料浸泡魚(yú)體24 h，水溫(16.3±0.3)℃。浸泡結(jié)束40 d后，將魚(yú)體全部保存在99.7%的酒精中。

1.4 耳石摘取與標(biāo)記檢測(cè)

在解剖鏡下，用解剖針剖開(kāi)短須裂腹魚(yú)頭骨，取出3對(duì)耳石(微耳石、矢耳石和星耳石)， 依次用清水、99.7%酒精清洗、晾干，再用中性樹(shù)膠封固于載玻片上，最后貼上標(biāo)簽，放置在無(wú)塵干燥處晾干。在Olympus BX40熒光顯微鏡下，使用10×物鏡，分別在普通白光、綠光(濾光片WG，主波長(zhǎng)546 nm)、藍(lán)光(濾光片WB，主波長(zhǎng)495 nm)、紫外光(濾光片WU，主波長(zhǎng)365 nm)四種光下觀察熒光標(biāo)記的耳石。根據(jù)初步觀察結(jié)果，選擇其中一種熒光效果最好的激發(fā)光，用于評(píng)價(jià)耳石熒光標(biāo)記質(zhì)量。為量化分析，依據(jù)Yang等[10]的方法，將標(biāo)記質(zhì)量分為六個(gè)等級(jí)。當(dāng)標(biāo)記質(zhì)量 ≥ 3時(shí)定為優(yōu)質(zhì)標(biāo)記。檢測(cè)分兩次獨(dú)立進(jìn)行，當(dāng)兩次結(jié)果出現(xiàn)不一致時(shí)，再進(jìn)行第三次檢測(cè)，以確定一個(gè)唯一的檢測(cè)結(jié)果。使用顯微鏡連接的Q-Imaging MicroPublisher 5.0 RTV CCD為耳石拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2013初步整理后，使用SPSS 19.0對(duì)AC標(biāo)記的死亡率、標(biāo)記質(zhì)量進(jìn)行方差分析和線性回歸分析，20日齡AC標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的短須裂腹魚(yú)全長(zhǎng)比較也采用方差分析。以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 熒光標(biāo)記的檢測(cè)光

在四種光下的觀察結(jié)果顯示：AC、ARS標(biāo)記的短須裂腹魚(yú)耳石在普通白光下可觀察到深淺不一的紫紅色，在其他三種光源下則均可觀察到明顯的橘紅色標(biāo)記環(huán)，綠光下最明顯，藍(lán)光次之，紫外光最弱；TC、AYG、AAB和CAL標(biāo)記的耳石沒(méi)有觀察到標(biāo)記；所有空白對(duì)照組的耳石也沒(méi)有觀察到標(biāo)記(圖1)。因而，選用綠光檢測(cè)AC和ARS的標(biāo)記質(zhì)量。

圖1 不同激發(fā)光下熒光標(biāo)記的短須裂腹魚(yú)微耳石

2.2 AC標(biāo)記

AC標(biāo)記的耳石在綠光下均能夠觀察到橘紅色標(biāo)記，標(biāo)記率100%；標(biāo)記條件不同，標(biāo)記質(zhì)量存在差異(圖2)。因8日齡時(shí)短須裂腹魚(yú)仔魚(yú)僅有部分個(gè)體的星耳石原基形成，故這里沒(méi)有對(duì)星耳石分析。方差分析(Four-way-ANOVA：只考慮主效應(yīng)，事后檢驗(yàn)Turkey HSD)結(jié)果表明：標(biāo)記質(zhì)量受魚(yú)體全長(zhǎng)、AC溶液濃度和浸泡時(shí)間的顯著影響；微耳石和矢耳石之間的標(biāo)記質(zhì)量無(wú)明顯差異(表2)。線性回歸分析的結(jié)果顯示：Q=-0.605x+0.013y+0.053z+10.872(R2=0.667，Q為標(biāo)記質(zhì)量，x為全長(zhǎng)，y為溶液濃度，z為浸泡時(shí)間)。表明標(biāo)記質(zhì)量隨著AC溶液濃度和浸泡時(shí)間的升高而提高，隨著魚(yú)體全長(zhǎng)的增加而降低。

圖2 AC標(biāo)記短須裂腹魚(yú)的標(biāo)記質(zhì)量

不同實(shí)驗(yàn)條件下短須裂腹魚(yú)死亡率存在差異(表2)。方差分析(Three-way-ANOVA：只考慮主效應(yīng)，事后檢驗(yàn)Turkey HSD)結(jié)果表明：死亡率受到魚(yú)體全長(zhǎng)和AC溶液濃度顯著影響，受浸泡時(shí)間的影響不顯著(表3)。線性回歸分析的結(jié)果顯示：M=-0.088x+0.001y+0.007z+1.304(R2=0.434，M為死亡率，x為全長(zhǎng)，y為溶液濃度，z為浸泡時(shí)間)。表明死亡率隨著AC溶液濃度和浸泡時(shí)間的增加而升高，隨著全長(zhǎng)的增長(zhǎng)而降低。

表2 AC標(biāo)記短須裂腹魚(yú)的死亡率

20日齡短須裂腹魚(yú)AC浸泡標(biāo)記結(jié)束16 d后，與空白對(duì)照組相比(One-Way-ANOVA：事后檢驗(yàn)Dunnett)，除AC溶液濃度300 mg/L、浸泡時(shí)間24 h的這組魚(yú)體全長(zhǎng)顯著較低外(P<0.05)，其他各組魚(yú)體全長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異(P>0.05，表3)。

表3 AC標(biāo)記短須裂腹魚(yú)的標(biāo)記質(zhì)量和死亡率方差分析結(jié)果

2.3 AC重復(fù)標(biāo)記

AC重復(fù)標(biāo)記的耳石在綠光下均能觀察到兩個(gè)區(qū)分明顯的橘紅色標(biāo)記環(huán)(圖3，A)，標(biāo)記率100%。相同的標(biāo)記條件，微耳石標(biāo)記質(zhì)量最高，矢耳石次之，星耳石最低(圖4)；首次標(biāo)記和再次標(biāo)記的標(biāo)記質(zhì)量差異很小。浸泡時(shí)間12 h的組，100～300 mg/L的AC溶液首次標(biāo)記沒(méi)有造成50日齡魚(yú)體死亡；83日齡重復(fù)標(biāo)記時(shí)將浸泡時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，100 mg/L組仍沒(méi)發(fā)生死亡，但200、300 mg/L組的死亡率均為100%(表4)。浸泡時(shí)間24 h的組，100～300 mg/L的AC溶液在首次標(biāo)記時(shí)除300 mg/L組和空白對(duì)照組各死亡1尾外，其他組均沒(méi)有出現(xiàn)魚(yú)體死亡；在83日齡重復(fù)標(biāo)記時(shí)，100 mg/L組仍沒(méi)有死亡，但200、300 mg/L組死亡率均為100%(表4)。400 mg/L的AC溶液造成的死亡率極高，第一次標(biāo)記時(shí)已接近100%。

圖3 AC和ARS重復(fù)標(biāo)記的短須裂腹魚(yú)微耳石

圖4 AC重復(fù)標(biāo)記短須裂腹魚(yú)的標(biāo)記質(zhì)量

表4 AC重復(fù)標(biāo)記短須裂腹魚(yú)稚魚(yú)的死亡率

2.4 ARS重復(fù)標(biāo)記

ARS重復(fù)標(biāo)記的耳石在綠光下均能觀察到兩個(gè)橘紅色標(biāo)記環(huán)(圖3，B)，標(biāo)記率100%；同樣的標(biāo)記條件，微耳石和星耳石的標(biāo)記質(zhì)量較高，矢耳石次之(圖5)；首次標(biāo)記和再次標(biāo)記的標(biāo)記質(zhì)量差異很小。浸泡時(shí)間12 h的組，100～300 mg/L的ARS溶液造成的死亡率與空白對(duì)照組相同(均為1尾)，400 mg/L 的ARS造成的死亡率則為100%；83日齡重復(fù)標(biāo)記時(shí)將浸泡時(shí)間延長(zhǎng)為48 h，100 mg/L組死亡率僅為5.88%(死亡1尾)，但200、300 mg/L組的死亡率明顯升高，分別為41.18%、100%。浸泡時(shí)間24 h的組，100和200 mg/L的ARS溶液在首次標(biāo)記和重復(fù)標(biāo)記均沒(méi)有造成魚(yú)體死亡，300、400 mg/L組則在首次標(biāo)記時(shí)就表出現(xiàn)極高死亡率(表5)。

圖5 ARS重復(fù)標(biāo)記短須裂腹魚(yú)的標(biāo)記質(zhì)量

表5 ARS重復(fù)標(biāo)記短須裂腹魚(yú)稚魚(yú)的死亡率

2.5 TC、CAL、AYG和AAB標(biāo)記

使用TC、CAL、AYG和AAB浸泡的短須裂腹魚(yú)均沒(méi)有在耳石觀察到熒光標(biāo)記(圖1)。50～300 mg/L的TC溶液浸泡標(biāo)記8日齡短須裂腹魚(yú)仔魚(yú)造成的死亡率極低，僅300 mg/L這組為3.33%(1尾)，低于空白對(duì)照組的6.67%(2尾)(表6)。CAL造成的死亡率較低，直至800 mg/L才造成死亡率激增。相比之下，AYG、AAB則分別在50、100 mg/L時(shí)即已出現(xiàn)較高死亡率(表6)。

表6 其他熒光染料浸泡標(biāo)記短須裂腹魚(yú)的死亡率

3 討論

3.1 6種熒光染料標(biāo)記效果分析

本研究結(jié)果表明，使用TC、CAL、AYG和AAB溶液浸泡短須裂腹魚(yú)，均未在其耳石上形成有效的熒光標(biāo)記，僅AC和ARS形成了非常明顯的熒光標(biāo)記。四環(huán)素及其多種鹽類實(shí)際上是一類抗生素，能與堿土金屬離子形成有熒光的配合物，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常被用作熒光標(biāo)記物，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖常見(jiàn)用藥，其中較早應(yīng)用于魚(yú)類熒光標(biāo)記放流研究的是土霉素(oxytetracycline，OTC)、TC[18]。通過(guò)浸泡或者投喂的方式，OTC、TC被魚(yú)體吸收代謝后沉積在鰭條、脊椎骨、耳石等部位，在紫外光下可觀察到黃色熒光[19-20]。但一些研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類的熒光標(biāo)記容易受組織自體熒光的影響，會(huì)造成標(biāo)記識(shí)別率降低[19,21-22]。為了獲得優(yōu)質(zhì)標(biāo)記，有時(shí)溶液濃度需要很高(500～600 mg/L以上)，而高濃度又會(huì)造成高死亡率[19-21]。TC標(biāo)記胭脂魚(yú)(Myxocyprinusasiaticus)[23]的效果很差、標(biāo)記率很低，標(biāo)記重口裂腹魚(yú)(Schizothoraxdavidi)[24]時(shí)則和本研究結(jié)果類似，檢測(cè)不到標(biāo)記。出現(xiàn)這種情況，可能是由于四環(huán)素類標(biāo)記易受水中鈣、鎂等離子螯合和酸堿度的影響，以及所用四環(huán)素種類和物種差異。對(duì)比已發(fā)表的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與AC、ARS的橘紅色熒光相比，四環(huán)素類的黃色熒光不明顯，在識(shí)別時(shí)容易造成誤判，再加之人們對(duì)于抗生素的擔(dān)憂，OTC、TC很難在魚(yú)類標(biāo)記放流中大規(guī)模應(yīng)用。

在使用CAL浸泡標(biāo)記孔雀魚(yú)(Poeciliareticulata)[25]、許氏平鲉(Sebastesschlegelii)[26]等魚(yú)類的研究中，標(biāo)記部位在藍(lán)光下發(fā)出綠色熒光。本研究卻沒(méi)有在耳石上觀察到標(biāo)記，分析可能有兩種原因：一是用于標(biāo)記和養(yǎng)殖的水槽透光性較好，陽(yáng)光照射使CAL降解“褪色”；二是實(shí)驗(yàn)結(jié)束后魚(yú)體保存在酒精中較長(zhǎng)時(shí)間才摘取耳石檢測(cè)，而CAL溶于酒精，詳細(xì)原因有待更多實(shí)驗(yàn)分析確證。不過(guò)，一些研究表明，CAL標(biāo)記不是很穩(wěn)定，易衰減，而且與TC標(biāo)記有著類似缺點(diǎn)，即熒光較弱且易受背景熒光影響，讀取較為困難，因而在一定程度上限制了它的應(yīng)用[25,27]。

AYG、AAB是茜素的衍生物，常被用作生化分析中的染色劑[28-29]。這兩種染料不僅沒(méi)有形成有效的熒光標(biāo)記，而且對(duì)短須裂腹魚(yú)表現(xiàn)出很大的毒性。在本研究中，使用100mg/L的AAB浸泡短須裂腹魚(yú)在最初的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就全部死亡。推測(cè)可能是因?yàn)锳AB、AYG溶液呈酸性，導(dǎo)致魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈造成死亡。

ARS、AC主要通過(guò)與鈣離子形成絡(luò)合物經(jīng)魚(yú)體代謝吸收沉積在骨骼、鰭條等組織上，標(biāo)記部位在綠光下(波長(zhǎng))呈鮮艷的橘紅色，與背景熒光區(qū)分非常明顯[8]。ARS、AC沉積在骨性材料中后較為穩(wěn)定，再加上耳石受頭骨保護(hù)和不被重吸收的特性[30]，因而ARS、AC耳石標(biāo)記可以保持很長(zhǎng)時(shí)間(通?？蛇_(dá)數(shù)年)，或可伴隨魚(yú)類終生[9,31-33]。使用較低濃度的AC或ARS就可以獲得優(yōu)質(zhì)標(biāo)記，甚至在可見(jiàn)光下也能觀察到標(biāo)記。不過(guò)，在同樣的條件下，ARS不僅比AC標(biāo)記質(zhì)量更高，而且其價(jià)格僅為AC的十分之一左右，因此更適宜推廣使用。

3.2 AC和ARS對(duì)短須裂腹魚(yú)早期魚(yú)苗存活、生長(zhǎng)的影響及適宜標(biāo)記條件

AC和ARS已經(jīng)在布氏棘鯛(Acanthopagrusbutcheri)[9]、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[34]等魚(yú)類的大規(guī)模標(biāo)記放流中應(yīng)用。但這兩種熒光物質(zhì)均對(duì)魚(yú)體有一定毒性，浸泡過(guò)程中魚(yú)體可能會(huì)因熒光物質(zhì)的脅迫作用而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成機(jī)體損傷，甚至出現(xiàn)死亡[11,35]。許多研究表明，熒光物質(zhì)的種類、溶液濃度、浸泡時(shí)間、魚(yú)類種類和魚(yú)體規(guī)格等多種因素，均不同程度地影響著死亡率及標(biāo)記質(zhì)量[9-10,19,35-38]。一般情況下，對(duì)于同種熒光物質(zhì)，標(biāo)記造成的死亡率和標(biāo)記質(zhì)量與溶液濃度、浸泡時(shí)間成正相關(guān)，與魚(yú)體規(guī)格大小成負(fù)相關(guān)[10,36,38-39]。王臣等[40]曾對(duì)ARS標(biāo)記大麻哈魚(yú)胚胎的數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，并結(jié)合安全評(píng)估，得出適宜的標(biāo)記條件是濃度25.9～40 mg/L、浸泡時(shí)間15.6～24 h。AC或ARS溶液濃度和浸泡時(shí)間合適，不會(huì)對(duì)魚(yú)類生存、生長(zhǎng)造成明顯負(fù)面影響[26,34,39]。在本研究中，使用50～300 mg/L的AC標(biāo)記20日齡短須裂腹魚(yú)16 d后，除300 mg/L、24 h組的全長(zhǎng)明顯低于空白對(duì)照組外，其他各組與空白對(duì)照組均無(wú)顯著差異，但200 mg/L及以下的濃度更不易造成魚(yú)苗死亡。

AC和ARS化學(xué)性質(zhì)相近，但本研究結(jié)果表明ARS浸泡標(biāo)記造成的魚(yú)體死亡率略高于AC，在Beckman等[41]、Yang等[10]研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。50日齡短須裂腹魚(yú)在首次標(biāo)記時(shí)，AC組在400 mg/L才出現(xiàn)大量死亡，ARS則是在300 mg/L。這可能是由于AC溶于水對(duì)pH影響較小，ARS溶液卻呈弱酸性，再加之魚(yú)苗弱小，容易出現(xiàn)急性應(yīng)激性死亡[9,11]。然而，一個(gè)月后(83日齡)以同樣的條件再次標(biāo)記時(shí)，濃度200 mg/L、浸泡24h的AC組魚(yú)苗全部死亡，而ARS組卻沒(méi)有出現(xiàn)死亡?；魜?lái)江[11]用100～400mg/L的ARS標(biāo)記中華倒刺鲃?dòng)佐~(yú)時(shí)發(fā)現(xiàn)，ARS造成的組織損傷10 d后基本恢復(fù)，500 mg/L時(shí)造成的損傷則很難恢復(fù)。由此可以推測(cè)，濃度200 mg/L時(shí)，AC造成短須裂腹魚(yú)早期魚(yú)苗出現(xiàn)急性應(yīng)激性死亡的可能性低于ARS，但對(duì)魚(yú)苗機(jī)體損傷程度可能略高于ARS，需要較長(zhǎng)時(shí)間恢復(fù)。

魚(yú)類在早期生長(zhǎng)階段代謝快，規(guī)格小，便于集中，是實(shí)施標(biāo)記的理想時(shí)期，但此時(shí)魚(yú)體抵抗力也很弱。尤其是大規(guī)模應(yīng)用時(shí)，魚(yú)苗生長(zhǎng)水平和健康水平不可能完全一致，選擇標(biāo)記條件需要格外謹(jǐn)慎。綜合本研究和其他研究的結(jié)果，本研究推薦的浸泡標(biāo)記短須裂腹魚(yú)早期魚(yú)苗(仔魚(yú)、稚魚(yú)及規(guī)格較小的幼魚(yú))的安全的條件為AC或ARS溶液50～100 mg/L，浸泡12～24 h。并且，在魚(yú)苗規(guī)格較小、體質(zhì)較弱時(shí)盡量采用該條件的低限，在魚(yú)苗規(guī)格較大、抵抗力較強(qiáng)時(shí)可采用高限。為進(jìn)一步確認(rèn)條件是否合適，在大規(guī)模應(yīng)用之前，還必須隨機(jī)抽樣對(duì)待標(biāo)記群體進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。按照這種方式，Yang等[42]曾在2014年使用ARS濃度70 mg/L、浸泡24 h的條件標(biāo)記了7 000尾短須裂腹魚(yú)(全長(zhǎng)23.52 mm±1.50 mm)，2015年使用ARS濃度30～50 mg/L、浸泡24 h的條件標(biāo)記60萬(wàn)尾(全長(zhǎng)20.85 mm±1.41 mm),標(biāo)記質(zhì)量均在3以上，魚(yú)苗死亡率低且沒(méi)有明顯升高，也沒(méi)有對(duì)其后續(xù)生長(zhǎng)造成明顯負(fù)面影響。

4 結(jié)論

本研究表明ARS和AC是目前標(biāo)記短須裂腹魚(yú)耳石效果很好的熒光物質(zhì)，標(biāo)記早期魚(yú)苗的合適條件為50～100 mg/L濃度浸泡12～24 h，不會(huì)對(duì)魚(yú)體存活、生長(zhǎng)造成明顯影響。而TC、CAL、AYG、AAB等熒光物質(zhì)則沒(méi)有在耳石上產(chǎn)生有效的熒光標(biāo)記，不適于標(biāo)記短須裂腹魚(yú)。