楊曉倩 秦莉 張藝文 汪漢

(西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院 成都市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，四川 成都 610031)

2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)是一種比嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒傳播性更強(qiáng)的新型β冠狀病毒，其基因序列與SARS具有很高的同源性，且都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病[1-2]。2019-nCoV感染的具有獨(dú)特的流行病學(xué)特征的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)人數(shù)遠(yuǎn)超SARS，但病死率比SARS低得多，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力和干咳，少數(shù)患者有咽痛、腹瀉和惡心等癥狀[1-2]。通過(guò)對(duì)臨床病例報(bào)告的分析發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV除感染肺部外，還會(huì)對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生影響，有臨床病例顯示，無(wú)心血管系統(tǒng)疾病的COVID-19患者在疾病發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)心肌受損[3-4]。有學(xué)者認(rèn)為2019-nCoV可能與SARS-CoV一樣，能與在心血管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ受體結(jié)合直接感染心肌細(xì)胞，造成心肌損傷[4]。研究發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV感染患者體內(nèi)的Th1和Th2細(xì)胞的反應(yīng)均增強(qiáng)，使體內(nèi)炎性細(xì)胞因子釋放增多，免疫系統(tǒng)激活[4]。不論是病毒直接感染心肌細(xì)胞造成的心肌受損，還是由病毒引起的全身性炎癥風(fēng)暴和免疫系統(tǒng)紊亂造成的心肌受損，都可能引起心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，繼而誘發(fā)病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)，其主要臨床癥狀為發(fā)熱、惡心、嘔吐、心慌和胸痛等，嚴(yán)重者可能發(fā)生休克、心律失常、心力衰竭，甚至猝死，要及早治療[5]。

中國(guó)作為中醫(yī)藥大國(guó)，對(duì)病毒所致疾病的治療有相當(dāng)豐富的經(jīng)驗(yàn)。在中醫(yī)看來(lái)，此次2019-nCoV所致疫情的重要特征為“濕”邪，故可稱為“濕毒疫”，其病位在肺，但可累及營(yíng)血，逆?zhèn)餍陌?，氣陰兩虛，?duì)于累及心包的重癥患者，應(yīng)以清熱、化痰、活血、祛瘀和利水等為主要治療方法；并且中醫(yī)對(duì)VMC的看法是“以外感肺衛(wèi)之邪，肺溫?zé)嶂?，乘之入心而致病”，瘀和痰既是其病理產(chǎn)物又是致病因素，應(yīng)祛痰化瘀[6-8]?？鄥⑹嵌箍浦参锟鄥⒌母谂R床上具有清熱燥濕、抗炎消炎、平喘祛痰和利尿利水等作用，對(duì)2019-nCoV感染合并VMC(2019-nCoV心肌炎)可能是有益的。并且已有研究證明，苦參成分中的苦參堿和槐定堿對(duì)VMC具有抗炎、抗病毒和抗心肌細(xì)胞凋亡等作用[9]。為了闡明苦參對(duì)2019-nCoV心肌炎的有益作用，現(xiàn)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，在分子水平上對(duì)其可能的有效成分和作用機(jī)制進(jìn)行全面的研究[10]。

1 材料和方法

1.1 苦參成分和靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)中對(duì)苦參進(jìn)行檢索，得到苦參的活性成分，再以生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18對(duì)活性成分進(jìn)行篩選，得到候選化合物，并查找候選化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)[11]。在UnitProt數(shù)據(jù)庫(kù)中以“人源”為限定標(biāo)準(zhǔn)，將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的蛋白名轉(zhuǎn)換成官方基因名，以便于后面的分析。

1.2 2019-nCoV心肌炎的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索“novel coronavirus”(新型冠狀病毒)和“myocarditis”(心肌炎)，得到2019-nCoV和心肌炎各自的靶點(diǎn)，然后將它們進(jìn)行取交集，得到共同靶點(diǎn)，即2019-nCoV心肌炎的潛在靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用R軟件中的“VennDiagram”程序包對(duì)苦參治療2019-nCoV心肌炎的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，再通過(guò)預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)對(duì)上述得到的候選化合物進(jìn)行篩選，得到與靶點(diǎn)相關(guān)的化合物。將作用靶點(diǎn)及其相關(guān)化合物導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，以藥物、活性成分、疾病和靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的連線為邊，構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)藥物作用于疾病的靶蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析。限定蛋白種類為“Homo sapiens”(人源)，設(shè)置最低蛋白互作得分為0.4，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，以靶蛋白為節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間以邊相連接。將得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，各靶蛋白所連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行排序，以連接節(jié)點(diǎn)數(shù)目排名前10的靶蛋白作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。連接節(jié)點(diǎn)越多可認(rèn)為在該網(wǎng)絡(luò)中越關(guān)鍵，越有可能是藥物作用于疾病的關(guān)鍵藥效靶點(diǎn)。

1.5 基因本體及通路富集分析

利用R軟件中的“clusterProfiler”安裝包，對(duì)苦參作用于2019-nCoV心肌炎的作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)代謝通路分析，得到苦參治療2019-nCoV心肌炎可能涉及的生物學(xué)功能和通路。GO分析中通過(guò)分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組分三個(gè)模塊對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行注釋，設(shè)定閾值為P<0.05，P值大小表示富集顯著性，P值越小，富集越顯著，可認(rèn)為P<0.05的所有條目是重要生物學(xué)功能，并根據(jù)P值大小進(jìn)行排序，列出顯著富集的前20個(gè)生物學(xué)功能的基本信息。與GO分析一樣，選取KEGG分析得到的所有P<0.05的通路，用顯著富集的前20條通路，繪制氣泡圖，圖中節(jié)點(diǎn)的大小表示富集在該通路的基因數(shù)目，節(jié)點(diǎn)的顏色表示P值大小，節(jié)點(diǎn)越紅越大說(shuō)明該通路越重要。

2 結(jié)果

2.1 藥物和疾病的相關(guān)靶點(diǎn)

將TCMSP中檢索到的活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)，經(jīng)篩選、整合和去重后，最終得到活性成分23個(gè)，相關(guān)靶點(diǎn)177個(gè)。將GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的疾病靶點(diǎn)整合和去重后，得到2019-nCoV相關(guān)靶點(diǎn)348個(gè)，其中OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)未單獨(dú)收集心肌炎的相關(guān)靶點(diǎn)，改成“myocardial”(心肌)后重新檢索，最終得到心肌炎相關(guān)靶點(diǎn)987個(gè)，二者取交集后，得到共同靶點(diǎn)139個(gè)，即2019-nCoV心肌炎的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.2 “藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

在R軟件中導(dǎo)入上述得到的苦參相關(guān)靶點(diǎn)和2019-nCoV心肌炎相關(guān)靶點(diǎn)，運(yùn)行“VennDiagram”程序包，得到交集靶點(diǎn)34個(gè)，即苦參治療2019-nCoV心肌炎的潛在靶點(diǎn)，進(jìn)一步的篩選確定了苦參發(fā)揮抗2019-nCoV心肌炎的14個(gè)主要活性成分(見表 1)。再將這34個(gè)靶點(diǎn)及其相關(guān)的14個(gè)活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，得到“藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(見圖1)。其中，黃色節(jié)點(diǎn)代表藥物，紅色節(jié)點(diǎn)代表疾病，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表成分，綠色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)基因，各節(jié)點(diǎn)之間以邊相連。通過(guò)這個(gè)網(wǎng)絡(luò)，可知苦參主要是通過(guò)哪些成分以及這些成分是通過(guò)調(diào)控哪些靶點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生對(duì)2019-nCoV心肌炎的治療作用。

表1 苦參抗2019-nCoV心肌炎的活性成分

圖1 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖注：黃色節(jié)點(diǎn)：苦參；紅色節(jié)點(diǎn)：2019-nCoV心肌炎；藍(lán)色節(jié)點(diǎn)：苦參的有效活性成分；綠色節(jié)點(diǎn)：苦參和2019-nCoV心肌炎的共同靶點(diǎn)。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)

在String數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)上述得到的34個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果(見圖2)，圖中顯示出34個(gè)節(jié)點(diǎn)和367條邊。節(jié)點(diǎn)代表靶基因，不同顏色的邊代表不同的相互作用證據(jù)，兩靶點(diǎn)之間的邊越多，越能證明其具有相關(guān)性。利用R軟件對(duì)各靶點(diǎn)連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行排序，得到排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)(見圖3)，其中白介素(IL)-6連接了31個(gè)節(jié)點(diǎn)，是連接節(jié)點(diǎn)最多的靶點(diǎn)。各靶點(diǎn)連接節(jié)點(diǎn)越多，可認(rèn)為其在該網(wǎng)絡(luò)中越重要，越有可能是苦參治療2019-nCoV心肌炎的主要藥效靶點(diǎn)。

圖2 作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖注：節(jié)點(diǎn)：靶點(diǎn)蛋白；不同顏色的連線代表不同的互作關(guān)系的證據(jù)。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4 靶點(diǎn)的GO分析和KEGG分析

GO分析結(jié)果顯示共富集到63個(gè)與作用靶點(diǎn)相關(guān)的功能條目，以P值排序，前20個(gè)生物學(xué)功能見表2。該結(jié)果顯示，這些作用靶點(diǎn)主要涉及的生物學(xué)功能有細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性、磷酸酶結(jié)合、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合和蛋白磷酸酶結(jié)合等。由此得出，苦參對(duì)2019-nCoV心肌炎的治療作用參與了多種生物學(xué)進(jìn)程。KEGG分析得到P<0.05的通路135條，以P值排序，將前20條通路進(jìn)行可視化分析結(jié)果(見圖4)。該結(jié)果表明，苦參治療2019-nCoV心肌炎的相關(guān)靶點(diǎn)主要參與IL-17、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Toll樣受體和缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)等信號(hào)通路，涉及其他通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、甲型流感通路、恰加斯病(美洲錐蟲病)通路、百日咳通路和結(jié)核通路等，這表明苦參可通過(guò)不同的代謝通路，相互協(xié)調(diào)、相互合作來(lái)發(fā)揮治療2019-nCoV心肌炎的作用。

圖4 苦參治療2019-nCoV心肌炎的主要生物學(xué)通路(前20條)

表2 苦參治療2019-nCoV心肌炎的主要生物學(xué)功能(前20個(gè))

3 討論

COVID-19是感染2019-nCoV所致的主要疾病，屬于呼吸系統(tǒng)疾病。呼吸系統(tǒng)疾病與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，此次2019-nCoV所導(dǎo)致的體內(nèi)炎癥風(fēng)暴可能波及心血管系統(tǒng)，造成心肌損傷，繼而導(dǎo)致心肌炎[3]。這與中醫(yī)的整體觀相契合，即人體是一個(gè)有機(jī)的整體，體內(nèi)的五臟六腑是相互關(guān)聯(lián)和相互影響的，其中心和肺是氣和血相互依存關(guān)系的寫照?？鄥⑿院疀觯哂星鍩嵩餄竦淖饔?，對(duì)于2019-nCoV的重要特征“濕邪”和2019-nCoV感染所致的“熱證”可能有益；并且苦參的抗炎消炎作用能減輕炎癥反應(yīng)造成的心肌損傷。

對(duì)于中藥成分多、作用機(jī)制復(fù)雜的特點(diǎn)，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，通過(guò)活性成分篩選、作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析以及作用靶點(diǎn)功能和通路分析等過(guò)程，對(duì)苦參治療2019-nCoV心肌炎的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，苦參中有14個(gè)活性成分可能通過(guò)直接或間接的方式作用于靶點(diǎn)發(fā)揮抗2019-nCoV心肌炎的作用，主要有香芹堿、槐定堿、苦參堿、木犀草素和槲皮素等。其中，苦參堿和槐定堿已被證明對(duì)VMC有治療作用[9]。進(jìn)一步分析得到34個(gè)作用靶點(diǎn)，推測(cè)苦參可能通過(guò)作用于這些靶點(diǎn)發(fā)揮作用。最后對(duì)作用靶點(diǎn)的功能和信號(hào)通路進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示：作用靶點(diǎn)主要涉及的生物學(xué)功能有細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性、磷酸酶結(jié)合、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合和TNF受體結(jié)合以及TNF受體超家族結(jié)合等，分析發(fā)現(xiàn)這些生物學(xué)功能主要與炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡等密切相關(guān)。通路富集結(jié)果顯示，作用靶點(diǎn)主要參與調(diào)控IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路以及各種疾病通路等多種類型的通路，來(lái)發(fā)揮治療作用，其中IL-17、TNF、Toll樣受體和HIF-1等信號(hào)通路都與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，并且IL-17信號(hào)通路還參與了細(xì)胞纖維化進(jìn)程,TNF信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路能調(diào)控細(xì)胞凋亡，推測(cè)苦參通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等來(lái)發(fā)揮抗2019-nCoV所致VMC的作用[12-14]。總之，苦參是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)和多通路的共同作用發(fā)揮抗2019-nCoV心肌炎的作用。

在34個(gè)作用靶點(diǎn)中進(jìn)一步篩選出10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別是IL-6、IL-10、CASP3、CCL2、IL-1B、CXCL8、ICAM-1、IFNG、IL-4和MAPK1。其中除CASP3和MAPK1外，都與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，IL-6和IL-4能介導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞活化和增殖，在炎癥反應(yīng)中起重要作用；IL-10能抑制多種細(xì)胞因子的合成，從而抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答；CCL2和CXCL8是趨化因子，能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，CCL2還能誘導(dǎo)其他炎性因子合成，如IL-6；IL-1B是促炎細(xì)胞因子，能活化T細(xì)胞和B細(xì)胞使細(xì)胞因子和抗體產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，另外，IL-1B能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白產(chǎn)生，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化；ICAM-1是細(xì)胞間黏附分子，是炎癥發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)；IFNG是Ⅱ型干擾素(IFN-γ)，具有免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬抗原、激活自然殺傷細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，并且IFN-γ還具有抗病毒活性[13，15]。CASP3參與負(fù)責(zé)凋亡執(zhí)行的胱天蛋白酶的激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用[16]。MAPK1主要參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)劑[17]。這些基因的作用揭示了苦參可能通過(guò)調(diào)控免疫系統(tǒng)，抑制炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞纖維化和心肌細(xì)胞凋亡或直接產(chǎn)生抗病毒作用等來(lái)發(fā)揮治療2019-nCoV心肌炎的作用。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘了苦參治療2019-nCoV心肌炎可能的活性成分及其相關(guān)作用靶點(diǎn)，對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行了功能富集分析和通路富集分析，較全面地分析了其可能的作用機(jī)制，為臨床上可能發(fā)生的2019-nCoV心肌炎的治療提供了參考依據(jù)。