文/ 長(zhǎng)征縱橫

氣相分析方法開(kāi)發(fā)的十二個(gè)步驟// 方法開(kāi)發(fā)是個(gè)復(fù)雜而又神秘的工程，往往需要扎實(shí)的理論知識(shí)儲(chǔ)備，但同時(shí)也少不了經(jīng)驗(yàn)的積累；對(duì)于方法開(kāi)發(fā)，需要我們從多學(xué)科出發(fā)，分析儀器學(xué)、色譜學(xué)、藥學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)等學(xué)科綜合，也需要我們熟練掌握文獻(xiàn)信息檢索，從中吸取精華，同時(shí)不斷去試錯(cuò)，下面就把我個(gè)人職業(yè)生涯的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)提煉，供同行一起學(xué)習(xí)探討。

步驟一、確認(rèn)主要工作內(nèi)容

1.殘留溶劑檢測(cè)分析方法：GC-HS方法、GC直接進(jìn)樣方法。

2.基因毒雜質(zhì)檢測(cè)分析方法。

3.高沸點(diǎn)樣品雜質(zhì)分離與含量檢測(cè)方法。

步驟二、信息收集

1.要確定待測(cè)物質(zhì)的溶解性、極性、沸點(diǎn)，主要針對(duì)“溶劑殘留”。

2.需要確定樣品的溶解性、熱穩(wěn)定性、極性、沸點(diǎn)、化學(xué)性質(zhì)（酸堿）、物理屬性（固體/液體/半固態(tài)）。

3.收集并計(jì)算化合物（待測(cè)物質(zhì)）的CH含量%比值，CH含量%比值越高檢測(cè)靈敏度就越好，反之，CH含量%比值越低檢測(cè)靈敏度就越差。

步驟三、色譜柱使用選擇指南（分離關(guān)鍵）

1.非極性色譜柱：分離主要根據(jù)沸點(diǎn)高低，沸點(diǎn)低先出，沸點(diǎn)高后出；同沸點(diǎn)的含有O含有N的極性先出，烴類(lèi)后出，如：DB-1、HP-1、BP-1、SE-30；

2.極性色譜柱：分離主要根據(jù)分子極性大小，極性小先出，極性大后出,如DB-Wax；

3.首選中極性毛細(xì)管色譜柱，既能兼顧沸點(diǎn)差異又能兼顧極性差異，如：DB-624、HP-5，表1列舉了幾種常見(jiàn)色譜柱的極性及使用范圍；

表1 常見(jiàn)色譜柱的極性與使用范圍

4.色譜柱直徑（內(nèi)徑/粒徑）越窄/越小，柱效越高，峰展寬越小，峰越尖銳，峰靈敏度越高，增加分離度；

5.色譜柱膜厚影響傳質(zhì)阻力，液膜越薄的傳質(zhì)阻力越小，在同樣的線速度下能夠獲得更高的柱效，柱效越高，峰展寬越小，峰越尖銳，峰靈敏度越高，增加分離度；液膜厚，保留時(shí)間延長(zhǎng)。

步驟四、進(jìn)樣方法的選擇

1.方法有溶液直接進(jìn)樣法、頂空進(jìn)樣法。

①殘留溶劑-HS：大多數(shù)是低沸點(diǎn)物質(zhì)（醇/酯/烷烴/醚），90%以上采用頂空進(jìn)樣（GC-HS），清潔進(jìn)樣，基本不出雜峰（溶劑），原料不被破壞但經(jīng)濟(jì)費(fèi)用高。

②殘留溶劑-DS：5%及少數(shù)采用溶液直接進(jìn)樣（GC-DS），雖然經(jīng)濟(jì)，但出雜峰多（主要原料破壞帶入），易損壞色譜柱，需清潔老化保護(hù)，表2總結(jié)了一些方法開(kāi)發(fā)選擇需要考慮的方面。

表2 開(kāi)發(fā)選擇考慮總結(jié)

2.溶劑沸點(diǎn)過(guò)高（沸點(diǎn)大于180℃），且樣品對(duì)熱比較穩(wěn)定，首選溶液直接進(jìn)樣法。

3.溶劑沸點(diǎn)低（沸點(diǎn)小于150℃），且樣品對(duì)熱不穩(wěn)定，首選頂空進(jìn)樣法。

4.頂空進(jìn)樣法可消除因溶液直接進(jìn)樣會(huì)產(chǎn)生降解雜質(zhì)峰而干擾目標(biāo)峰（進(jìn)樣口溫度大于200℃），采用頂空進(jìn)樣方法還可以減少對(duì)樣品的預(yù)處理。

5.基因毒雜質(zhì)方法開(kāi)發(fā)，優(yōu)先選擇溶液直接進(jìn)樣法（限度低，主要考慮提高靈敏度）；樣品雜質(zhì)分離選擇使用溶液直接進(jìn)樣法。

6.對(duì)于基因毒雜質(zhì)限度小于2 ppm以下方法開(kāi)發(fā)，優(yōu)先選擇GC-MS溶液直接進(jìn)樣法。

7.查看CH含量%比值選擇進(jìn)樣方法：

①CH含量%比值高：對(duì)于殘留溶劑檢測(cè)選擇頂空進(jìn)樣法，對(duì)于雜質(zhì)分離/控制或基因毒雜質(zhì)控制選擇溶液直接進(jìn)樣法時(shí)，可開(kāi)發(fā)低濃度供試品溶液。

②CH含量%比值低：對(duì)于殘留溶劑檢測(cè)選擇溶液直接進(jìn)樣法，對(duì)于雜質(zhì)分離/控制或基因毒雜質(zhì)控制選擇溶液直接進(jìn)樣法時(shí)，可開(kāi)發(fā)高濃度供試品溶液。

步驟五、確定定量方法

1.外標(biāo)法：殘留溶劑、含量（準(zhǔn)確）。

2.內(nèi)標(biāo)法：殘留溶劑（主要針對(duì)易揮發(fā)烷烴類(lèi)）。

3.面積歸一化法：樣品雜質(zhì)分離及純度。

步驟六、樣品預(yù)處理方法

1.氣相色譜儀能直接分析的樣品通常是氣體或液體，固體樣品在分析前應(yīng)先溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無(wú)機(jī)鹽：進(jìn)樣口溫度不能保證鹽汽化），往往會(huì)聚集在進(jìn)樣口襯管或分流平板導(dǎo)致污染/堵塞，還有可能通過(guò)載氣進(jìn)入色譜柱中，損壞色譜柱的填料。

2.樣品預(yù)處理/溶解原則：根據(jù)相似相溶原理。

3.樣品分類(lèi)：氣體樣品、液體樣品、固體樣品。

4.氣體/液體樣品預(yù)處理方法：

①直接進(jìn)樣分析（純度分析與檢測(cè)），如：甲烷、乙醇；

②脂溶性液體樣品（雜質(zhì)），通常需要用脂溶性有機(jī)溶劑溶解樣品，如：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、

DMSO、DMF；

③進(jìn)樣方式：溶液直接進(jìn)樣、頂空進(jìn)樣。

5.固體樣品（含鹽）樣品預(yù)處理方法：

①樣品性質(zhì)：易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，樣品熔點(diǎn)高，難汽化，如：鈉鹽/鉀鹽/鹽酸鹽/硫酸鹽/磷酸鹽/富馬酸鹽；

②如果選擇水作溶劑-盡量使用頂空進(jìn)樣方法；

③靈敏度不理想且限度低（1~10 ppm）-可使用水溶解二氯甲烷/正己烷萃取法來(lái)進(jìn)行預(yù)處理樣品，這樣既可以使用溶液直接進(jìn)樣又可以使用頂空進(jìn)樣，檢測(cè)雜質(zhì)/殘留/基因毒通用。

6.固體樣品（不含鹽）樣品預(yù)處理方法：根據(jù)相似相溶原理。

步驟七、溶劑系統(tǒng)選擇

1.如果是溶液直接進(jìn)樣法，優(yōu)先考慮溶劑選擇，溶解樣品的溶劑和最大溶解限度；如果是頂空進(jìn)樣法，可根據(jù)樣品和溶劑都能溶解；

2.原則上水溶性樣品優(yōu)先選擇水，非水溶性樣品可選擇酯/醇、DMF、DMSO、NMP、DMAC；

3.溶液直接進(jìn)樣-樣品溶劑選擇考慮：

①化學(xué)穩(wěn)定（水解/醇解），優(yōu)先選擇水（水溶性）/醇/酯（脂溶性）作為溶劑；反之選擇烷烴、質(zhì)子溶劑（萬(wàn)能溶劑：DMF、DMSO、NMP、DMAC）作為溶劑；

②樣品具有酸/堿性，但是檢測(cè)殘留溶劑或雜質(zhì)也具備酸/堿性，可根據(jù)待測(cè)物質(zhì)酸/堿性質(zhì)選擇酸堿中和樣品；如鹽酸/硫酸/富馬酸鹽等產(chǎn)品檢測(cè)胺類(lèi)，需要單獨(dú)使用堿性溶劑進(jìn)行中和解離，同樣反之，如吡啶/鈉/鉀鹽等產(chǎn)品檢測(cè)酸類(lèi)，需要單獨(dú)使用酸性溶劑進(jìn)行中和解離，具體溶劑選擇需要進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

③供試品溶液要澄清，不與樣品及待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)或結(jié)合。

4.頂空進(jìn)樣-樣品溶劑選擇考慮：

①化學(xué)穩(wěn)定（水解/醇解），優(yōu)先選擇水（水溶性）作為溶劑；反之選擇質(zhì)子溶劑（萬(wàn)能溶劑：

DMF、DMSO、NMP、DMAC）；

②樣品具有酸/堿性，同上“3.②”。

③樣品溶解完全沒(méi)要求,頂空進(jìn)樣氣體（溶劑殘留）。

5.對(duì)于低限度燃燒值大的物質(zhì)，可選用鹽析溶劑系統(tǒng)，如：苯殘留、三氯甲烷。

6.樣品溶解溶劑選擇，也要考慮殘留溶劑的溶解度（如：烷、醚類(lèi)不溶解水）。

7.大部分溶劑系統(tǒng)優(yōu)先選擇DMSO、NMP、DMF，因?yàn)榧饶苋芙鈽悠酚帜苋芙馊軇?/p>

步驟八、柱溫開(kāi)發(fā)研究

1.等溫：對(duì)于溶劑個(gè)數(shù)少（1~3個(gè)），且各溶劑沸點(diǎn)差異不算很大，此時(shí)可選擇等溫法，比如50℃保持10~15分鐘，適合殘留溶劑檢測(cè)、基因毒雜質(zhì)檢測(cè)、含量測(cè)定。

2.程序升溫：對(duì)于溶劑個(gè)數(shù)多（大于5個(gè)），且各溶劑沸點(diǎn)差異較大，此時(shí)可選擇程序升溫法，比如40℃保持10分鐘，以10℃/min速率升至180℃，保持5分鐘，適用于產(chǎn)品雜質(zhì)分離、殘留溶劑檢測(cè)，表3、表4展示了經(jīng)典的程序升溫。

表3 經(jīng)典程序升溫（殘留溶劑、雜質(zhì)分離）

表4 雜質(zhì)分離的程序升溫

3.極端分離：對(duì)于大部分沸點(diǎn)低溶劑（當(dāng)使用DB-624）且考慮分析時(shí)長(zhǎng)時(shí)，可選用低溫程序升溫法，比如初始溫度為35~40℃，分析環(huán)境一定要保證溫度＜25℃。

步驟九、頂空條件方法選擇和研究

1.爐溫（加熱-頂空瓶平衡溫度）：

①以水為溶劑，溫度范圍選擇75~90℃，最高選擇90℃；

②以DMSO、DMF等為溶劑，溫度范圍選擇80~145℃，最高選擇140℃；溫度過(guò)高要考慮高溫時(shí)長(zhǎng)導(dǎo)致溶劑反應(yīng)降解產(chǎn)生新的未知雜峰；

③考慮溫度過(guò)高有爆瓶危險(xiǎn)，特別在使用鹽析方法時(shí)（因?yàn)槿軇┫到y(tǒng)里有水分存在）爆瓶概率增加；

④加熱溫度研究最高溫度一般低于溶劑10℃（在考慮靈敏度情況下）。

2.定量環(huán)溫度：溫度要大于爐溫10℃。

3.傳輸線溫度：溫度要大于定量環(huán)溫度10℃。

4.頂空瓶（加熱）平衡時(shí)間：根據(jù)大部分溶劑沸點(diǎn)，沸點(diǎn)都相對(duì)高平衡時(shí)間就長(zhǎng)，沸點(diǎn)都相對(duì)低平衡時(shí)間就短；常規(guī)平衡時(shí)間為30~60分鐘，經(jīng)典平衡時(shí)間為30分鐘。

十、檢測(cè)器選用

1.90%分析方法工作優(yōu)先選用FID檢測(cè)器：含碳?xì)浠衔铩?/p>

2.基因毒雜質(zhì)選用FID-MS檢測(cè)器。

3.如含電負(fù)性基團(tuán)（F/Cl/Br）且含CH量少，選用ECD電子捕獲檢測(cè)器，如三氯甲烷無(wú)H物質(zhì)。

4.含有非碳?xì)浠衔锝M分時(shí)，且對(duì)檢測(cè)靈敏度要求不高，通常選擇TCD檢測(cè)器，主要是氣體檢測(cè)，如輔材：氮?dú)狻?/p>

5.其他：N/P（氮/磷）檢測(cè)器。

步驟十一、方法建立

1.進(jìn)樣口溫度：一般選擇200~230 ℃，進(jìn)樣口溫度要大于傳輸線溫度，可根據(jù)樣品性質(zhì)研究選用中高溫，如150~180 ℃（考慮樣品不被熱解）。

2.檢測(cè)器溫度：一般選擇230~260℃。檢測(cè)器溫度要大于進(jìn)樣口和色譜柱溫度。

3.流速：3.0~5.0 mL/min，經(jīng)典流速為：4 mL/min和5 mL/min。

4.分流比：①5:1-50:1；②選擇規(guī)則：響應(yīng)值高，使用大分流比，反之，則使用小分流比；③經(jīng)典分流比為5:1（頂空進(jìn)樣）和50：1（溶液直接進(jìn)樣）。

5.進(jìn)樣量：頂空進(jìn)樣為1 mL，溶液直接進(jìn)樣為0.2-1 uL，也可根據(jù)進(jìn)樣峰型進(jìn)行改進(jìn)。

6.樣品濃度/配制開(kāi)發(fā)研究：

①頂空進(jìn)樣：0.2~1 g（根據(jù)限度/靈敏度要求進(jìn)行研究），對(duì)于大濃度要考察樣品提取平衡；濃度一般控制在0.1~0.4 g/mL（頂空裝量控制在1~5 mL）；

②溶液直接進(jìn)樣：一定要考慮溶解完全，濃度可根據(jù)限度/靈敏度要求進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究；一般控制在0.5~200 mg/mL；

③開(kāi)發(fā)研究合適的樣品濃度，一定要根據(jù)雜質(zhì)限度/靈敏度做相應(yīng)研究調(diào)整。

7.對(duì)于雜質(zhì)分離（溶液直接進(jìn)樣法），在方法開(kāi)發(fā)同時(shí)也要考察殘留問(wèn)題，可增加清洗老化色譜柱方法程序，也可增加清洗進(jìn)樣針?lè)椒?；還有對(duì)于對(duì)氣相管路有吸附殘留性質(zhì)也可增加清洗程序（如胺類(lèi)、＞150 ℃高沸點(diǎn)物質(zhì)），增加程序一定要作為分析方法的一部分，且一定要經(jīng)過(guò)驗(yàn)證驗(yàn)收。

8.方法開(kāi)發(fā)時(shí)遇到難點(diǎn)：分離度、靈敏度、峰型。

分離度優(yōu)化研究：

①極性色譜柱與非極性色譜柱的轉(zhuǎn)換使用（DB-Wax與DB-624轉(zhuǎn)換）；

②使用程序升溫（速率可低至3~5 ℃/min，但是分析時(shí)長(zhǎng)增加，靈敏度減小）；

③使用長(zhǎng)色譜柱（如30 m→45 m→75 m）；

④使用小粒徑色譜柱（3 um→1.8 um→1 um）；

⑤降低流速（變流速如：3→1 mL/min）；

⑥使用程序降溫（120→40℃，速率10-20 ℃/min）。

靈敏度優(yōu)化研究：

①增加進(jìn)樣量（1→2uL）；

②增大流速；

③增加頂空瓶裝樣量（最大5 mL，可研究6~8 mL）；

④使用小粒徑色譜柱（3 um→1.8 um→1 um）；

⑤使用鹽析方法（成功典型：苯、三氯甲烷）；

⑥頂空方法：適當(dāng)增加頂空瓶加熱溫度和時(shí)長(zhǎng)（進(jìn)行對(duì)比研究）。

峰型優(yōu)化研究：

①使用小粒徑色譜柱；

②增大柱流量；

③使用專(zhuān)屬柱（如胺類(lèi)分析柱、醇類(lèi)分析柱）；

④升高柱溫。

9.系統(tǒng)干擾考察研究：先走空白2針：樣品1針、對(duì)照1針，查看空白、樣品溶液的干擾情況，空白與樣品應(yīng)無(wú)干擾峰出現(xiàn)（方法驗(yàn)證-專(zhuān)屬性），且對(duì)LOQ和LOD測(cè)試無(wú)干擾，基本能通過(guò)LOQ和LOD驗(yàn)證（方法好壞體現(xiàn)在系統(tǒng)與溶劑對(duì)測(cè)試的干擾）。

10.系統(tǒng)有干擾可通過(guò)換溶劑或調(diào)整程序升溫來(lái)消除對(duì)目標(biāo)峰的干擾。

11.進(jìn)行LOQ考察：只確認(rèn)靈敏度（響應(yīng)值）最小的2個(gè)，將LOQ試驗(yàn)出來(lái)，LOQ對(duì)應(yīng)濃度是否合格（LOQ含量不得高于限度的50%）。

12.最后進(jìn)行100%加標(biāo)回收測(cè)試，回收結(jié)果如果滿足90%~105%，方法基本確定。

步驟十二、分析方法評(píng)價(jià)與挑戰(zhàn)

1.分析方法開(kāi)發(fā)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：

①空白考察：空白溶液無(wú)干擾峰出現(xiàn)，應(yīng)該對(duì)測(cè)試無(wú)影響（最小干擾＜LOD）；

②分離度：最低分離度標(biāo)準(zhǔn)為，各相鄰峰間分離度＞2.0（最小1.5）；

③LOQ：確認(rèn)靈敏度（響應(yīng)值）最小的2個(gè)，將LOQ試驗(yàn)出來(lái)，LOQ對(duì)應(yīng)濃度是否合格（LOQ含量不得高于限度的50%），且LOQ的S/N要大于10；

④加標(biāo)回收標(biāo)準(zhǔn)（90%~110%）；

⑤溶液穩(wěn)定性：100%加標(biāo)溶液考察0、2、4、8、24小時(shí)的穩(wěn)定性，主要考察峰面積RSD%（n=5）以及各溶劑的回收率%。

2.分析方法簡(jiǎn)單預(yù)實(shí)驗(yàn)（預(yù)驗(yàn)證）：

①線性：50%、100%、150%、200%（每點(diǎn)進(jìn)2針），R大于0.999；

②準(zhǔn) 確 度：50%、100%、200%（每點(diǎn)進(jìn)2針），回收率%應(yīng)在90%~110%；

③SST實(shí)驗(yàn)：6針對(duì)照結(jié)果，各溶劑峰峰面積RSD%（n=6）均小于6.0%，且考察各溶劑峰的拖尾因子或?qū)ΨQ(chēng)因子（0.9~1.1，最大不可超過(guò)2.0）。