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薄層色譜知識(shí)干貨分享

2021-07-14 07:07:26狐佳駿
實(shí)驗(yàn)與分析 2021年2期
關(guān)鍵詞:點(diǎn)樣展開(kāi)劑極性

文/ 狐佳駿

掌握薄層色譜法必備的基礎(chǔ)知識(shí)// 色譜法起源于20世紀(jì)初,經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)科學(xué)家一百多年的創(chuàng)新與完善,現(xiàn)已成為應(yīng)用廣泛的分離分析技術(shù),尤其是薄層色譜法,在化藥合成、醫(yī)藥中間體合成領(lǐng)域意義重大。本文集中介紹了一些薄層色譜法的基礎(chǔ)知識(shí)及使用過(guò)程中的注意事項(xiàng)。

薄層色譜英文名稱為Thin- Layer Chromatography , 簡(jiǎn)寫 為TLC。將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì)均勻涂鋪在平面板(如玻璃板、金屬片等)上,形成薄層(常用厚度為0.25 毫米左右)后,在此薄層板上進(jìn)行層析分離的分析方法。它具有分析速度快、靈敏度高、選擇性高、試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單、所用儀器簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。

基本原理

薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法,它利用各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力的不同,使流動(dòng)相(溶劑)流過(guò)固定相(吸附劑)的過(guò)程中,連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附,從而達(dá)到各成分互相分離的目的。

相關(guān)參數(shù)

1.比移值 Rf

從基線至展開(kāi)斑點(diǎn)中心的距離與從基線至展開(kāi)劑前沿的距離的比值。除另有規(guī)定外,雜質(zhì)檢查時(shí),各雜質(zhì)斑點(diǎn)的比移值在0.2~0.8之間為宜;最佳范圍為0.3~0.5。

2.相對(duì)比移值 Rs

各組分Rf值之差。各組分比移值之差最好控制在0.05,可以消除一些實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的系統(tǒng)誤差,以防斑點(diǎn)重疊(注:系統(tǒng)誤差可控,偶然誤差不可控,具體可參考《分析化學(xué)》)。

3.影響因素

固定相、流動(dòng)相種類及性質(zhì)、展開(kāi)劑飽和度、溫度、薄層板的性質(zhì)等,在完全相同的條件下某一成分的比移值為固定值。

用具及操作

薄層板

1.按固定相種分類:硅膠、三氧化二鋁、聚酰胺、活性炭、大孔吸附樹(shù)等,注意所選固定相必須不與流動(dòng)相及被分離化合物反應(yīng)。

2.按效率分類:普通板,粒徑為10~40 um(200~500目); 高效板,粒徑為5 um(500~1000目);

3.常用硅膠板分類:硅膠H—不含粘合劑;硅膠G—含煅石膏粘合劑;硅膠HF254—含熒光物質(zhì),可用于波長(zhǎng)為254 nm紫外光下觀察;熒光硅膠GF254—既含煅石膏又含熒光劑。

薄層板的制備及注意事項(xiàng)

1.手工鋪板:將1份固定相和3份水或加有黏合劑的水溶液(如0.2%~0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液)或?yàn)橐?guī)定濃度的改性劑溶液,在研缽中按同一方向研磨混合,去除表面的氣泡后,倒入涂布器中,在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布(厚度為0.2~0.3 mm),取下涂好薄層的玻板,置水平臺(tái)上于室溫下晾干后,在110℃烘箱中烘30分鐘,隨即置于有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度,可在反射光及透視光下檢視,表面應(yīng)均勻、平整、光滑, 并且無(wú)麻點(diǎn)、無(wú)氣泡、無(wú)破損及污染。

2.活化目的:去除固定相表面多余的水分,保證及加強(qiáng)粘合劑的粘度。相當(dāng)于人體內(nèi)水:自由水在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞之間、生物體內(nèi)可以輸送新陳代謝所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝的廢物;結(jié)合水在生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)相結(jié)合,失去流動(dòng)性。結(jié)合水是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成成分,不能溶解其他物質(zhì),不參與代謝作用。與人體中的水一樣,活化的目的相當(dāng)于去除多余的自由水,如果溫度過(guò)高就會(huì)破壞結(jié)合水,使其結(jié)構(gòu)受到破壞,降低粘合劑的粘度。所以,一定要注意活化的溫度。

3.活化效果評(píng)判依據(jù):此法僅做參考。以正己烷:乙酸乙酯(9:1)為展開(kāi)劑,以偶染料即蘇丹紅和對(duì)氨基偶氮苯混合樣,計(jì)算兩者比移值,見(jiàn)表1。

表1 蘇丹紅和對(duì)氨基偶氮苯混合樣的比移值

4.貯存:保存于相對(duì)干燥的環(huán)境中(干燥器) 備用,市售硅膠板用前需干燥半小時(shí),聚酰胺薄膜不需干燥。

5.注意事項(xiàng):檢查所選板種類、完整度、清潔度、尺寸,以及鋪板時(shí)所選固定相,在滿足實(shí)驗(yàn)結(jié)果前提下,也可根據(jù)固定相價(jià)格、吸附劑選擇。

展開(kāi)缸

展開(kāi)缸類型有雙底展開(kāi)槽、普通展開(kāi)槽、水平展開(kāi)槽。由于展開(kāi)槽價(jià)格昂貴,在使用時(shí)注意愛(ài)護(hù)保養(yǎng),用完后及時(shí)清洗。

展開(kāi)劑

展開(kāi)劑可以為一種溶劑,也可為多種溶劑,當(dāng)一種溶劑不能很好的展開(kāi)各組份時(shí),常選擇混合溶劑作為展開(kāi)劑,先用極性小的為基礎(chǔ),再用極性大的混合,逐次實(shí)驗(yàn)。比移值太大,降低展開(kāi)劑極性;比移值太小,增大展開(kāi)劑極性。對(duì)于極性小的樣,選擇活性強(qiáng)的吸附劑,極性小的展開(kāi)劑,反之則性狀正好相反,例如,環(huán)己烷:丙酮:二乙胺:水(10:5:2:5),其中丙酮降低粘度,二乙胺調(diào)節(jié)pH,環(huán)己烷降低水的極性,使比移值降低。常用的展開(kāi)劑有水、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、苯、 甲苯、環(huán)己烷、石油醚(極性從大到小大小排列),展開(kāi)劑選擇的影響因素有被分離試樣組分的極性、吸附劑活性、展開(kāi)劑極性。

各溶劑在展開(kāi)劑中的作用:極性強(qiáng)的溶劑可以使化合物在薄層板上移動(dòng);

極性弱的溶劑能降低極性強(qiáng)的溶劑的洗脫能力和比移值;

一般中等極性的溶劑能夠使極性強(qiáng)的和極性弱的溶劑混合均勻;

在展開(kāi)劑中加入少量酸、堿可以使某些極性物質(zhì)斑點(diǎn)集中,提高分離度。用黏度太大的溶劑時(shí),往往需要加入一種溶劑,以降低展開(kāi)劑的粘度,加快展開(kāi)速度。

在配制展開(kāi)劑的時(shí)候,要選擇正確的溶劑,精密量取,根據(jù)配比混合均勻,注意分層的展開(kāi)劑中上下層溶劑的選擇,現(xiàn)用現(xiàn)配(混合溶劑中溶劑揮發(fā)性不同),配量不宜太多。

點(diǎn)樣工具及點(diǎn)樣

一般為圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀,色樣基線距底邊10~15 mm ,高效板一般基線距底邊8~10 mm,圓點(diǎn)狀直徑一般不大于4 mm,高效板一般不大于2 mm。接觸點(diǎn)樣時(shí)注意勿損傷薄層表面。條帶狀寬度一般為5~10 mm,高效板條帶寬度一般為4~8 mm, 可用專用半自動(dòng)或全自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以相鄰斑點(diǎn)互不干擾為宜,一般不少于8 mm,高效板供試品間隔不少于5 mm。常見(jiàn)的點(diǎn)樣工具有毛細(xì)管、自動(dòng)點(diǎn)樣器、微量注射器。

點(diǎn)樣操作時(shí)要注意,點(diǎn)樣量要小、劃線要輕薄、點(diǎn)樣時(shí)輕、記錄清楚、重復(fù)點(diǎn)樣時(shí)要等前一次的點(diǎn)樣溶劑揮發(fā)后再進(jìn)行下一次的點(diǎn)樣,總之原則為盡量小的點(diǎn)樣面積、盡量高的樣品濃度、點(diǎn)樣速度要快。

展開(kāi)操作及注意事項(xiàng)

展開(kāi)方式包括上行、下行、近水平展開(kāi)三種。

1.上行展開(kāi):將點(diǎn)好供試品的薄層板放入展開(kāi)缸中,浸入展開(kāi)劑的深度為距原點(diǎn)5 mm為宜,密閉。除另有規(guī)定外,一般上行展開(kāi)8~15 cm,效薄層板上行展開(kāi)5~8 cm。溶劑前沿達(dá)到規(guī)定的展距,取出薄層板,晾干,待檢測(cè);

2.下行展開(kāi):多用于紙色譜中。將點(diǎn)樣后的濾紙懸放于展開(kāi)劑槽中,用玻璃棒加以固定,下方可放入飽和濾紙所用的溶劑,展開(kāi)劑從上向下展開(kāi)。此法除了毛細(xì)管作用外還有重力作用,因此展開(kāi)速度比上行展開(kāi)速度快;

3.近水平展開(kāi):將適量溶劑置于長(zhǎng)方形的玻璃展開(kāi)槽中,將點(diǎn)樣后的薄層板下端浸于展開(kāi)劑 0.5 cm處,并與水平成5~10角,適用于不含粘合劑的軟板展開(kāi)。

4.注意事項(xiàng):等樣品中試劑揮發(fā)完后再進(jìn)行展開(kāi),展開(kāi)時(shí)臺(tái)面要平整,不能傾斜。必要時(shí),可進(jìn)行二次展開(kāi),進(jìn)行第二次展開(kāi)前,應(yīng)使薄層板殘留的展開(kāi)劑完全揮發(fā)。展開(kāi)缸上做好標(biāo)記,以防混淆。注意展開(kāi)過(guò)程中展開(kāi)缸的密封性。墊高展開(kāi)缸一端,一方面節(jié)省展開(kāi)劑,另一方面使展開(kāi)劑更集中,提高展開(kāi)效果。

薄層色譜的應(yīng)用

薄層色譜的主要應(yīng)用有定性分析、定量分析、紫外分光光度法、波層掃描色譜法、鑒別,以及反應(yīng)進(jìn)程跟蹤(原點(diǎn)是否消失,多用于化藥合成、醫(yī)藥中間體合成等)

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