周翔宇，樊桂靈，鄧揚龍，李玉鋒

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

類胡蘿卜素是一類由類異戊二烯單位組成的碳氫化合物及其氧化衍生物的總稱[1]，絕大多數(shù)的類胡蘿卜素都是脂溶性色素[2]。按照類胡蘿卜素是否含有氧元素可將其分為兩大類：一類是只含有碳氫元素的類胡蘿卜素：如β-胡蘿卜素、番茄紅素等；另一類是含有氧元素的胡蘿卜素：葉黃素、玉米黃質(zhì)等。類胡蘿卜素具有很多功能特性，有研究[3]發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗癌、抗氧化、預(yù)防AMD(老年黃斑變性)疾病等功效，除此之外，其還具有良好的著色效果，因而廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)當(dāng)中[4?5]。但是，由于類胡蘿卜素的脂溶特性導(dǎo)致其存在不利于人體消化吸收、生物利用度不高等問題。針對這一問題目前已有許多學(xué)者做出了相關(guān)方面的努力，王思元等[6]就類胡蘿卜素的穩(wěn)態(tài)性技術(shù)進行了綜述。

蛹蟲草即北冬蟲夏草，是一種藥食兩用的真菌且其是目前報道的所有大型食藥用真菌中類胡蘿卜素含量最多的真菌[7]。2013 年高燕燕等[8]對蛹蟲草菌絲體色素進行鑒定，鑒定結(jié)果顯示其為類胡蘿卜素，之后又對其穩(wěn)定性進行了探究。緊接著Dong 等[9]對蛹蟲草類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)進行近一步的分離鑒定，其乙醇提取液的質(zhì)譜結(jié)果顯示該色素含有4 種水溶性極強的結(jié)構(gòu)，分別為Cordyxanthin-Ⅰ、Cordyxathin-Ⅱ、Cordyxathin-Ⅲ、Cordyxanthin-Ⅳ。相比之下，有關(guān)其生物活性的研究較少，張明亮等[10]通過體外試驗對蛹蟲草類胡蘿卜素提取物進行活性初步探究。之后朱振元等[11]對其色素提取物進行了抗氧化活性檢測。目前，已有一些學(xué)者對于蛹蟲草類胡蘿卜素的提取工藝進行了研究。張志軍等[12]采用酸熱提取法對蛹蟲草子實體當(dāng)中的類胡蘿卜素進行提取并通過正交試驗進行提取優(yōu)化，提取率可達到2 158 μg/g。婁海偉等[13]利用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化超聲輔助乙醇提取類胡蘿卜素的工藝條件，優(yōu)化之后類胡蘿卜素的提取率可達637 μg/g。這兩種提取方法均存在耗能大、提取效率不夠高等問題。與傳統(tǒng)溶劑法以及超聲微波法相比酶輔助提取法具有自己的優(yōu)勢，酶輔助提取法的原理主要是利用生物酶破壞細胞壁結(jié)構(gòu)從而將色素較溫和且?guī)в羞x擇性地釋放出來[14]，生物酶的專一性保證其不會對底物外物質(zhì)造成破壞，這一特性使酶輔助提取法更適合于提取穩(wěn)定性較差且含量較低的化學(xué)成分[15?16]。2019 年國內(nèi)學(xué)者汪建紅[17]利用木瓜蛋白酶輔助提取荸薺當(dāng)中的色素，高效的獲得荸薺色素且其穩(wěn)定性較高。除此之外，采用酶輔助提取法相對于其他常規(guī)溶劑提取法擁有更多的優(yōu)點，提取過程對環(huán)境十分友好，提取效率更高，對提取設(shè)備及環(huán)境的要求更低且能耗低，開展性較強適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)[18]。采用酶輔助提取法提取色素有許多優(yōu)勢，但單一的酶可能不能滿足要求，所以有的研究者嘗試用兩種以上的酶采用復(fù)合酶提取法提取色素。2019 年國外學(xué)者Gizem 等[19]采用纖維素酶和果膠酶共同作用提取土豆廢棄基質(zhì)中的番茄紅素并對其提取工藝進行了優(yōu)化。

本文參照文獻[19]的方法擬以蛹蟲草子實體為原料采用纖維素酶和果膠酶2 種復(fù)合酶共同作用提取蛹蟲草類胡蘿卜素并通過單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化其提取條件，同時采用紫外光譜法初步分析鑒定其組成結(jié)構(gòu)并測定其總抗氧化能力。旨在為蛹蟲草類胡蘿卜素這一新型色素[20]的工業(yè)化大批量生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)，同時也增加了蛹蟲草這一真菌的附加值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所使用的原材料蛹蟲草新鮮子實體均由四川省巴中市南江宏信生物有限公司提供，其中該蛹蟲草子實體的培養(yǎng)基為小麥培養(yǎng)基。

1.2 實驗試劑與設(shè)備

實驗試劑：食品級纖維素酶（山東省臨沂市圣斯德樣品廠）；食品級果膠酶（寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司）；分析純無水乙醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；分析純丙酮（成都市科龍化工試劑廠）；分析純二氯甲烷（成都市科龍化工試劑廠）；分析純鹽酸（成都市科龍化工試劑廠）；乙腈（HPLC≧99.9%，美 國Sigma 公 司）；甲 醇（HPLC≧99.9%，美 國Sigma 公司）；分析純二甲亞砜（成都市科龍化工試劑廠）；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≧96%，化夏試劑）。

實驗設(shè)備：BT-423S 型分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司）；ZN-200A 高速中藥粉碎機（長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠）；SHA-B 振蕩水浴鍋（常州市金壇華偉儀器廠）；精密鼓風(fēng)干燥箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司）；移液槍（艾本德中國有限公司）；藥典篩（浙江上虞市道墟化驗儀器設(shè)備廠）；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Molecular Devices SpectraMaxi3X 多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器(上海)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗原料粉末的制備

樣品制備的方法參照邵穎等[21]的方法并進行改進。新鮮蛹蟲草子實體于60 ℃下烘干至恒重，粉碎過60 目篩，低溫干燥避光條件下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 提取溶劑的確定

為使得樣品定量測定時溶劑體系與標(biāo)準(zhǔn)品保持一致，以便用酶標(biāo)儀直接測定樣品提取液吸光度時直接定量。本實驗以溶解度為表征，參照Dong 等[9]的方法用乙醇溶液對色素粗提物進行溶解度試驗，結(jié)果顯示其在體積分數(shù)為60%以下的乙醇溶液中具有良好的溶解性。再選擇丙酮、乙醇、甲醇、二甲亞砜（DMSO）、乙腈、60%乙醇溶液和丙酮與60%體積分數(shù)的乙醇混合溶液（2∶1）作為研究對象，將蛹蟲草子實體色素粗提物分別溶解于上述7 種溶劑中，最終通過顏色辨別判斷其溶解性從而確定最佳提取溶劑。結(jié)果顯示丙酮和60%體積分數(shù)的乙醇混合溶液（2∶1）能夠溶解標(biāo)準(zhǔn)品β-類胡蘿卜素，同時蛹蟲草子實體當(dāng)中的類胡蘿卜素在其中能夠很好地提取出來，因而最終確定本試驗開展的提取溶劑為丙酮和60%體積分數(shù)的乙醇混合溶液，兩者的比例為2∶1，在此條件下提取得率最高，為2 256 μg/g。

1.3.3 復(fù)合酶的選擇以及添加比例的確定

蛹蟲草類胡蘿卜素為胞內(nèi)色素，所以需要先破壞細胞壁然后才能使色素很好地釋放出來。由于細胞壁是由纖維素和果膠構(gòu)成的，所以本試驗擬采用纖維素酶和果膠酶兩種酶共同作用以裂解細胞壁從而提取色素。為探究纖維素酶和果膠酶的最佳復(fù)合比例，本實驗選取了纖維素酶∶果膠酶（1∶2）；纖維素酶∶果膠酶（2∶1）；纖維素酶∶果膠酶（1∶1）三種方案進行預(yù)實驗，預(yù)實驗結(jié)果以提取溶液的吸光值來表征，結(jié)果顯示復(fù)合酶比例為纖維素酶∶果膠酶（2∶1）條件下，吸光值可達到3.322，而其余兩種條件下吸光值分別為2.355（纖維素酶∶果膠酶=1∶2），2.985（纖維素酶∶果膠酶=1∶1），因此本實驗選擇纖維素酶和果膠酶按照2∶1 的比例進行復(fù)合。

1.3.4 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

由于目前暫無蛹蟲草類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，所以本實驗中蛹蟲草類胡蘿卜素的定量測定是參照Dong 等[9]的方法，并在其方法的基礎(chǔ)上進行改進。首先將預(yù)實驗得到的蛹蟲草類胡蘿卜素粗提物用丙酮和60%體積分數(shù)乙醇水溶液（按2∶1）比例配制而成并溶解，經(jīng)酶標(biāo)儀在380～600 nm 波長范圍內(nèi)進行光譜掃描分析，之后確定本實驗的樣品溶液的最大吸收峰在445 nm 處，以便提取之后對類胡蘿卜素進行定量。配制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，精確稱取0.05 mg β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，加入50 μL 二氯甲烷試劑使之溶解，之后也用丙酮和60%體積分數(shù)乙醇混合溶液（比例=2∶1）定容到10 mL。從配置好的母液（c=5 μg/mL）中分別吸取4、5、6、7、8 mL，用丙酮和60%乙醇的混合溶液定容至10 mL，再用酶標(biāo)儀在445 nm 下測定不同濃度β-胡蘿卜素溶液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)β-胡蘿卜素溶液濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見下圖2。

線性回歸方程：

式中：x，β-類胡蘿卜素的濃度，μg/mL；y，吸光值。

類胡蘿卜素含量計算公式：

式中：c，β-類胡蘿卜素的含量，μg/g；V，丙酮和60%乙醇混合液體積，mL；m，粉末樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 復(fù)合酶法提取蛹蟲草類胡蘿卜素

新鮮蛹蟲草子實體在60 ℃烘干至恒重，粉碎過60 目篩備用。稱取蛹蟲草粉末2 g，加入20 mL 丙酮和60%體積分數(shù)乙醇混合溶液（體積比=2∶1）以及復(fù)合酶并調(diào)溶液的pH 至所需，將混合液置于恒溫水浴中酶解一定時間，4 500 r/min 離心10 min，將上清液稀釋100 倍，并準(zhǔn)確吸取200 μL 置于96 孔板中，用酶標(biāo)儀在445 nm 波長條件下掃描測定提取液的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程從而得到蛹蟲草類胡蘿卜素的提取得率。其中蛹蟲草類胡蘿卜素含量的計算方法見公式（2）。

1.3.6 復(fù)合酶法的單因素實驗

酶解溫度對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響：新鮮蛹蟲草子實體在60 ℃烘干至恒重，粉碎過60 目篩備用。分別稱取5 份2 g 的原料粉末置于5 個已編好號的錐形瓶中，然后分別加入丙酮和60%體積分數(shù)乙醇混合溶液（體積比=2∶1）20 mL 和復(fù)合酶，其中纖維素酶與果膠酶的混合酶添加量為0.5%，纖維素酶和果膠酶的添加比例按照預(yù)實驗結(jié)果最佳比例2∶1 添加，調(diào)至pH 為4，之后將5 個錐形瓶分別置于溫度為20、30、40、50、60 ℃的5 個恒溫水浴鍋中進行酶解提取，酶解時間為50 min，4 500 r/min 離心10 min，將上清液稀釋100 倍，并準(zhǔn)確吸取200 μL 置于96 孔板中，用酶標(biāo)儀在445 nm 波長條件下掃描測定提取液的吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到蛹蟲草類胡蘿卜素的提取得率。

pH 對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響：保持其他實驗條件不變的基礎(chǔ)上，探究pH=3、4、5、6、7 對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響，實驗操作同上面式（1）中所述。

酶解時間對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響：保持其他實驗條件不變的基礎(chǔ)上，探究酶解時間=20、30、40、50、60 min 對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響，實驗操作同（1）。

酶濃度對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響：保持其他實驗條件不變的基礎(chǔ)上，探究酶濃度（質(zhì)量分數(shù)）=0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響，實驗操作同式（1）。

1.3.7 復(fù)合酶法的響應(yīng)面工藝優(yōu)化試驗

根據(jù)上面單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，選取酶解pH、酶解溫度、酶解時間3 個因素為響應(yīng)因素，以蛹蟲草類胡蘿卜素的提取率為響應(yīng)值，共設(shè)計17 個實驗點開展響應(yīng)面實驗分析，實驗設(shè)計與結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表

1.3.8 蛹蟲草類胡蘿卜素粗提物的純化

根據(jù)單因素和響應(yīng)面實驗共同確定提取最佳工藝條件，之后對最佳工藝條件下提取得到的色素進行純化處理。方法如下：稱取蛹蟲草子實體粉末2 g，溶劑添加量為20 mL，調(diào)節(jié)提取體系的pH 為4，復(fù)合酶的添加比例為0.5%，酶解時間45 min，酶解溫度50 ℃，在以上條件下提取獲得色素提取上清液。將色素上清液上樣于HP-20 大孔樹脂吸附柱充分吸附，大孔樹脂吸附柱事先用去離子水洗滌去雜質(zhì)并調(diào)節(jié)其為中性，之后，用60%乙醇解吸附，洗脫液即為蛹蟲草類胡蘿卜色素純化液。之后將洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至浸膏狀，之后在超低溫冰箱中冷藏過夜再放置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥得蛹蟲草類胡蘿卜提純物干品，之后避光低溫保藏備用。

1.3.9 蛹蟲草類胡蘿卜素總抗氧化能力測定

機體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。本實驗采用比色法測定提取色素的總抗氧化活力，對比測定兩種提取方法下獲得的蛹蟲草類胡蘿卜素純化物的總抗氧化活性。其中試劑盒購買于南京建成生物工程研究所，測定步驟按照試劑盒說明書具體開展。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析方法

采用Design-Expert 10.0 軟件進行響應(yīng)面實驗設(shè)計與分析，每組實驗重復(fù)3 次，采用IBM SPSS Statistics 軟件處理數(shù)據(jù)，采用Origin8 軟件進行繪圖分析。

1.3.11 驗證性實驗

按照上面1.3.1 中實驗原料的處理方法制備原料粉末，根據(jù)響應(yīng)面實驗設(shè)計的最佳工藝條件進行實驗，測定該工藝條件下的蛹蟲草類胡蘿卜素的提取率。

1.3.12 方法對照實驗

為證明復(fù)合酶解法提取色素的高效性，本文擬選取張志軍等[12]的酸熱提取法的最佳工藝條件作為對照，酸熱提取法的工藝條件如下：取1 g蛹蟲草子實體樣品粉末加入1 mol/L 鹽酸15 mL，室溫下浸泡20 min，在沸水浴當(dāng)中處理4 min 之后迅速冷卻，3 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清液，將沉淀用蒸餾水洗滌2 次后加20 mL 丙酮，室溫下振蕩30 min 浸提類胡蘿卜素，然后在4 000 r/min 條件下離心15 min 得上清液即為類胡蘿卜素浸提液之后按照式（2）的定量方法進行測定。最后將酸熱提取法的實驗結(jié)果同上面1.3.11 當(dāng)中驗證性實驗結(jié)果作對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測定掃描波長確定

將預(yù)先準(zhǔn)備的樣品采用酶標(biāo)儀在380～600 nm 波長范圍內(nèi)進行紫外-可見光光譜掃描，類胡蘿卜素由于其中的共軛雙鍵體系形成的光吸收載色體，除了使其有特殊的顏色外還有特征的吸收光譜，它可作為類胡蘿卜素進行初步鑒定的依據(jù)[22]。掃描結(jié)果見圖1，光譜掃描圖呈明顯的三指特征峰，表示本實驗提取出的蛹蟲草色素提取物屬于類胡蘿卜素物質(zhì)，這為實驗的進一步開展提供了理論支撐。除此之外，出現(xiàn)三指特征吸收峰的位置分別在420、445、475 nm 處。其中，本實驗中采用的原料蛹蟲草的類胡蘿卜素提取物在445 nm 處有最大的吸收峰，因此蛹蟲草類胡蘿卜素提取物的定量測定，掃描波長設(shè)定在445 nm。

圖1 蛹蟲草類胡蘿卜素粗提物的光譜掃描圖

2.2 提取溶劑的確定

通過溶解性實驗判斷，比較乙醇體積分數(shù)在0～100%范圍內(nèi)，色素粗提物的溶解性。最終確定乙醇體積分數(shù)為60%條件下色素提取物的溶解性最佳，該結(jié)果與Dong 等[9]的實驗結(jié)果保持一致，其在不同體積分數(shù)的乙醇溶液中的溶解性對照圖結(jié)果圖2，其中色素溶液的質(zhì)量濃度為1 mg/mL；其中色素粗提取在不同溶劑體系中的溶解結(jié)果圖3，色素濃度為0.3 mg/mL。圖3 從左至右溶劑體系分別為：乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO（二甲亞砜）、丙酮與60%乙醇溶液（2∶1）、60%乙醇溶液，根據(jù)顏色深淺以及溶解程度的判斷，最終確定復(fù)合酶共同作用提取蛹蟲草子實體色素的最佳提取溶劑為丙酮與60%乙醇混合溶液，其中兩者的混合比例為丙酮體積∶60%乙醇體積=2∶1。

圖2 不同質(zhì)量分數(shù)乙醇溶液中色素的溶解性

圖3 不同溶劑體系中色素的溶解性

2.3 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（μg/mL），其吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖4 所示。線性回歸方程為y=0.1093x+0.0801，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 2，說明β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度在2～5 μg/mL 范圍內(nèi)與其吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖4 β-類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 單因素實驗結(jié)果

2.4.1 酶解溫度對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

保持其他提取條件一致，提取pH=4，提取時間為50 min，復(fù)合酶添加濃度為0.5%，料液比為1∶10，通過單因素實驗來考查溫度對于提取率的影響，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，試驗初期隨著提取溫度的上升，蛹蟲草類胡蘿卜素的提取率呈現(xiàn)上升的趨勢。其中，當(dāng)提取溫度提高到50 ℃時，提取率最高，達到3 082.34 μg/g；但是，當(dāng)提取溫度繼續(xù)增加到60 ℃時，提取率驟降，但仍舊高于其他幾個溫度下的提取率。分析其原因為當(dāng)提取溫度上升到60 ℃時，高溫使復(fù)合酶失去活性，因而提取率會有所降低；另外，60 ℃高溫可能會造成蛹蟲草類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)損傷分解，致使其提取效果降低[23]。

圖5 酶解溫度對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

2.4.2 pH 對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

控制復(fù)合酶協(xié)助提取蛹蟲草類胡蘿卜素的其他提取條件一致，分別為:提取時間50 min，提取溫度50 ℃，復(fù)合酶的添加濃度0.5%，料液比為1∶10。探究pH 為3、4、5、6、7 等5 種條件下，類胡蘿卜素的提取率的變化。圖6 結(jié)果顯示，提取體系的pH 對于提取率具有顯著的影響。從圖6 可以看出，當(dāng)pH 增加到4 時，提取率達到最大值，為2 249.77 μg/g，繼續(xù)增加提取體系pH，提取率反而呈現(xiàn)下降的趨勢。這主要是因為酸性條件下有利于蛹蟲草子實體細胞壁的降解從而更有利于色素的溶出，但是當(dāng)提取環(huán)境過酸時會對色素分子本身結(jié)構(gòu)造成一定的破壞[24]，從而導(dǎo)致提取率呈現(xiàn)降低的趨勢。

圖6 pH 對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

2.4.3 酶解時間對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

保持其他提取條件一致的基礎(chǔ)上，即提取溫度為50 ℃，pH 為4、酶的添加濃度0.5%（質(zhì)量分數(shù)），探究不同的酶解時間：20、30、40、50、60 min 下提取率的變化情況。從圖7 可以看出，在時間范圍為20～50 min 時，提取率與提取時間呈正相關(guān)性，但是，當(dāng)提取時間延長到60 min 時，酶解的效果反而會降低。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因是因為反應(yīng)時間過長溶液中的色素堆積過多，這會對酶促反應(yīng)帶來抑制作用且類胡蘿卜素暴露在細胞外時間過長易被破壞和氧化。

圖7 酶解時間對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

2.4.4 酶濃度對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

在其他酶解條件一致的基礎(chǔ)上，探究酶濃度對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響作用。本實驗設(shè)置5 個酶濃度（質(zhì)量分數(shù)），分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，保持其他提取條件一致的基礎(chǔ)上，即提取溫度為50 ℃，pH 為4、酶解的時間為50 min，探究不同的酶濃度對提取效果的影響，實驗結(jié)果見圖8。由圖8 結(jié)果可以看出，酶的添加濃度對于酶解效果的影響不是特別顯著，其中提取率最低值為2 667.12 μg/g，最高值達2 909.79 μg/g。由圖8可知酶濃度在0.2%～0.5%時，提取率與酶濃度呈正相關(guān)的趨勢，當(dāng)繼續(xù)增加酶的濃度到0.6%時，提取率反而有所降低，降到2 898.64 μg/g。這是因為0.5%的酶添加量已經(jīng)足夠整個反應(yīng)體系中蛹蟲草子實體粉末的細胞壁破裂，酶的濃度過大不能夠增加反應(yīng)底物的數(shù)量，因而提取率不會有明顯變化。

圖8 酶濃度對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

2.5 響應(yīng)面實驗結(jié)果

為優(yōu)化復(fù)合酶共同作用提取蛹蟲草當(dāng)中的類胡蘿卜素的工藝條件，根據(jù)上面單因素實驗開展的結(jié)果，選取pH、酶解時間、酶解溫度3 個因素為響應(yīng)面實驗的3 因素，設(shè)定為3 水平，分別為pH=3、4、5；酶解溫度為40、50、60 ℃；酶解時間為40、50、60 min，根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理共設(shè)計17 個實驗點，以提取率為響應(yīng)值開展試驗。其中，響應(yīng)面的實驗設(shè)計與結(jié)果見表2，回歸方程方差分析結(jié)果見表3；各因素間相關(guān)性試驗結(jié)果見圖9、圖10、圖11。

圖9 pH 與酶解時間對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

圖10 pH 與酶解溫度對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

圖11 酶解時間與酶解溫度對蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸方程方差分析結(jié)果

由表2 的實驗組合和結(jié)果進行分析得到表3的顯著性和方差分析表，采用Design-expert 10.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，經(jīng)擬合分析得到綜合得率Y對自變量A、B、C的回歸方程：Y=3.74?0.36A?0.37B+0.18C+0.27AB?0.014AC?0.13BC?0.69A2?0.52B2?0.30C2。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.985 2，P＜0.000 1，表示該試驗?zāi)Ｐ蜆O度顯著。通過軟件求解回歸方程，得到蛹蟲草類胡蘿卜素的最佳提取條件為：提取pH=3.8、酶解時間為43.62 min、酶解溫度為52.41 ℃，在該提取條件下提取到的蛹蟲草類胡蘿卜素理論上可達到3 888.34 μg/g。由表2 響應(yīng)面分析實驗方差分析結(jié)果可知該模型P＜0.01，說明該實驗回歸模型達到極度顯著水平。除此之外，失擬項P=0.592 7＞0.05，表明該擬合方程能夠很好的說明實驗結(jié)果。通過表中各因素來源的方差分析可以得到顯著性檢驗結(jié)果，模型一次項中pH、酶解時間、酶解溫度都是極顯著的，在二次項中A2、B2、C2也是極顯著的，在交互作用影響當(dāng)中只有pH 和酶解時間的交互是顯著的。另外，根據(jù)一次項系數(shù)的絕對值可以看出各因素對蛹蟲草類胡蘿卜素提取得率的影響主次順序為：酶解時間＞酶解pH＞酶解溫度。由圖9 可知，當(dāng)固定酶解溫度探究pH 與酶解時間的交互作用時，等高線圖呈現(xiàn)明顯橢圓狀，表明pH 與酶解時間的交互作用十分明顯。另外，響應(yīng)曲面結(jié)果表明蛹蟲草類胡蘿卜素的提取率隨著pH 和酶解時間的增加呈先上升后迅速下降的趨勢，其中當(dāng)pH=4、酶解時間為50 min 時，提取率達到最大。由圖10 可知，當(dāng)固定酶解時間探究pH 與酶解溫度之間的交互作用時，等高線中心部分呈現(xiàn)圓形，表明兩種單因素之間的交互作用不顯著。另外，響應(yīng)曲面的走向也呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢，可能是因為pH 和酶解溫度過高影響酶的活力，從而導(dǎo)致提取率的降低。由圖11 可知，pH 不變的情況下，酶解時間和酶解溫度之間的交互作用，由等高線圖可以看出是不太顯著的但是仍然有很強的相關(guān)性，響應(yīng)曲面結(jié)果分析可以得出隨著酶解時間和酶解溫度的增加，提取率的變化呈先上升后下降的趨勢，可能是因為酶解溫度和時間在一定范圍內(nèi)達到最高值時，酶的活性會降低從而影響到提取率，另外提取時間過長色素堆積過多也會對酶促反應(yīng)造成抑制。

2.6 色素粗提液純化結(jié)果

將按照單因素和響應(yīng)面實驗得到的最佳提取工藝提取的蛹蟲草子類胡蘿卜素粗提液經(jīng)過大孔樹脂吸附純化，之后經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮干燥和真空冷凍干燥得到蛹蟲草類胡蘿卜素純化物。將純化物精確稱重，其產(chǎn)量為0.021 g（2 g 原料粉末），得率為1.05%（即1.05 g/100 g 干品）。

2.7 驗證性實驗結(jié)果

對響應(yīng)擬合的方程通過軟件求解回歸方程，得到蛹蟲草類胡蘿卜素的最佳提取條件為：提取pH=3.8、酶解時間為43.62 min 酶解溫度為52.41 ℃?？紤]到實際操作的可行性，將提取條件設(shè)定為pH=4，酶解時間為45 min，酶解溫度為50 ℃，在此條件下開展提取實驗，提取到的蛹蟲草類胡蘿卜素含量為3 796.23 μg/g，與理論預(yù)測值相近，偏差較低，說明該回歸方程曲線能夠很真實地反應(yīng)各單因素對于蛹蟲草類胡蘿卜素提取率的影響同時也驗證了用該模型來篩選提取蛹蟲草類胡蘿卜素的最佳工藝條件是可行的。

2.8 方法對照實驗結(jié)果

目前對于蛹蟲草類胡蘿卜素提取方法較為認可的是酸熱提取法，本試驗按照張志軍等[11]的提取最佳工藝開展方法對比試驗。酸熱提取法的實驗結(jié)果顯示蛹蟲草類胡蘿卜素的提取率可達3 163.54 μg/g，與復(fù)合酶提取法提取得率3 796.23 μg/g 相比明顯較低且可操作性低于復(fù)合酶解法，驗證了復(fù)合酶解法的高效性也肯定了本文研究的意義。

2.9 總抗氧化活力測定結(jié)果

總抗氧化能力用活力單位來表征，活力單位定義如下：在 37 ℃時，每分鐘每毫克組織蛋白，使反應(yīng)體系的吸光度（OD 值），每增加 0.01 時，為一個總抗氧化能力單位。通過試劑盒實驗然后測定反應(yīng)液在520 nm 下測定的吸光值，通過計算公式計算出其總抗氧化活力，計算公式如下：

式中：A表示總抗氧化能力，U/mg；B1 表示測定OD 值；B2 表示對照OD 值；C1 表示反應(yīng)液總量，mL；C2 表示取樣量，mL；D表示提取液蛋白濃度，mg prot/mL。

通過上面公式計算得出兩種提取條件下得到的色素純化液的總抗氧化能力結(jié)果見表4。由表4可知，復(fù)合酶解處理提取得到的類胡蘿卜素和酸熱提取條件下得到的類胡蘿卜素，在使用相等色素純化物含量條件下分別測定兩者的總抗氧化能力，其中經(jīng)復(fù)合酶法提取得到的類胡蘿卜素總抗氧化能力可達4.151 U/mg，酸熱處理提取得到的類胡蘿卜素總抗氧化能力為4.096 U/mg。兩種提取方法下獲得的類胡蘿卜素總抗氧化能力相當(dāng)，因而證明采用復(fù)合酶共同作用提取蛹蟲草類胡蘿卜素，不影響其色素的總抗氧化能力。

表4 復(fù)合酶解處理對蛹蟲草類胡蘿卜素總抗氧化能力的影響

3 結(jié)論

本研究采用纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶共同作用，通過開展單因素試驗和響應(yīng)面試驗來優(yōu)化復(fù)合酶解法輔助提取蛹蟲草子實體當(dāng)中類胡蘿卜素的最佳提取工藝條件，即:pH=4，酶解時間45 min，酶解溫度50 ℃，酶濃度為0.5%，在此提取條件下，蛹蟲草類胡蘿卜素的提取率可達到3 796.23 μg/g，顯著高于酸熱提取法下的提取率（3 163.54 μg/g）。另外，兩種提取方法下得到的蛹蟲草類胡蘿卜素的總抗氧化能力相差不大。通過紫外光譜分析對色素提取液進行初步鑒定，結(jié)果其分別在420、445、475 nm 波長下有明顯吸收峰，符合類胡蘿卜素的特征。本實驗的開展為蛹蟲草類胡蘿卜素的提取提供一種更加高效環(huán)保的方法，該方法更適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。但是，目前尚未開展該提取方法下所得到的色素的純化以及其功能活性方面的相關(guān)研究，這也將是本試驗后續(xù)研究的一大方向。