徐 培，王憲偉，蔣舒明，何小艷，吳 寧

（四川省德陽市人民醫(yī)院病理科，德陽 618000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌導致的經(jīng)呼吸道傳播的一種慢性傳染病，是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，其可侵襲全身多個部位，如腎、腸、骨等，但肺結(jié)核最為常見[1-3]。我國肺結(jié)核的發(fā)病率一直位于甲、乙類傳染病的前2 位，每年新增發(fā)病數(shù)約90 萬例[4-6]。由此，對我國來說，為達到防治目的，肺結(jié)核的早診早治至關重要，快速治療的前提是快速檢測，目前快速檢測主要是指結(jié)核分枝桿菌的檢測?，F(xiàn)階段，實驗室的常用方法有痰培養(yǎng)法、抗酸染色法、實時熒光聚合酶鏈式反應法(real-time fluorescence polymerase chain reaction，RT-PCR)等，但都無法區(qū)別結(jié)核分枝桿菌存活狀態(tài)。RNA 恒溫擴增實時熒光檢測技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT）以RNA 作為靶標，不僅快速、高效，同時可以區(qū)分“死菌”和“活菌”，是近年來興起的一種分子檢測技術(shù)[7]，本研究通過收集臨床確診活動性肺結(jié)核患者痰液標本，采用SAT技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果與常用的抗酸染色法、RT-PCR法進行比較，評估其在肺結(jié)核輔助診斷中的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016 年1 月至2019 年3 月在德陽市人民醫(yī)院臨床確診的肺結(jié)核住院患者的晨痰標本762例，作為試驗組，年齡15～86歲，平均（47±18.83）歲；肺部非結(jié)核性疾病患者的晨痰標本318 例，作為對照組，年齡14～87歲，平均（55±16.89）歲。試驗組病例納入標準[8]：（1）痰涂片陽性、結(jié)核菌培養(yǎng)陽性或病理證實符合結(jié)核改變；（2）痰涂片陰性、γ-干擾素陽性，且滿足以下條件：①影像學診斷符合活動性肺結(jié)核伴相應臨床癥狀；②影像學診斷符合活動性肺結(jié)核伴抗結(jié)核抗體檢查陽性；③有相關病理學診斷支持；④抗結(jié)核治療有效可排除其他肺部疾病者。對照組病例納入標準：（1）慢性阻塞性肺炎患者；（2）支氣管擴張伴感染患者；（3）普通細菌性肺炎患者。排除標準：（1）妊娠期婦女；（2）其它嚴重器官功能障礙者或精神障礙不能表達自己意愿的患者；（3）診斷不明確患者。

1.2 主要儀器與試劑

CobasZ480 熒光定量PCR 儀購自羅氏公司，BX41顯微鏡購自奧林巴斯公司），結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（RNA 恒溫擴增）購自上海仁度生物科技公司，抗酸染色試劑購自珠海貝索生物有限公司，結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）購自蘇州天隆生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 液化標本預處理取患者清晨深咳痰液，加入1倍體積NaOH，室溫放置30 min。

1.3.2 SAT 法 取1 mL 液化好的痰液樣本于1.5 mL EP 管中，13 000 r/min 離心5 min，棄上清，再加入1 mL 生理鹽水重懸洗滌，13 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入50 μL裂解液重懸，300 W超聲處理15 min。將2 μL處理物加入含30 μL擴增檢測液的0.1 mL PCR反應管中，羅氏CobasZ480熒光定量PCR儀上機檢測。

1.3.3 RT-PCR 法 取1 mL 液化好的痰液樣本于1.5 mL EP管中，13 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入1 mL 生理鹽水重懸洗滌，13 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入50 μL 裂解液重懸，100 ℃10 min，13 000 r/min離心5 min，取上清。將4 μL處理物加入含36 μL擴增檢測液的0.1 mL PCR反應管中，羅氏CobasZ480熒光定量PCR儀上機檢測。

1.3.4 痰涂片抗酸染色 按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》中的要求，對收集的患者痰標本進行痰涂片、染色和顯微鏡檢觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗，組間一致性分析采用Kappa 檢驗，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線下面積（AUC）評估診斷效能，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抗酸染色結(jié)果

共1 080例患者行抗酸檢測，其中肺結(jié)核組762例，抗酸染色陽性164 例；非肺結(jié)核組318 例，抗酸染色均為陰性，見圖1、表1。

圖1 抗酸染色（100×）

2.2 3種檢測方法檢測結(jié)果比較

試驗組SAT 法的陽性檢出率明顯高于RT-PCR法和抗酸染色法(P＜0.01)；對照組SAT法的陽性檢出率與RT-PCR 法及抗酸染色法的陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1、表2。采用Kappa一致性分析發(fā)現(xiàn)，SAT與RT-PCR結(jié)果有較好的一致性(Kappa=0.861，P＞0.05)，與抗酸染色法結(jié)果一致性較差(Kappa=0.522，P＜0.05)。SAT 法的陰性預測值高于RT-PCR 和抗酸染色，SAT 法的陰性預測值與RT-PCR 法比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但與抗酸染色法比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表3。

表1 3種檢測方法與臨床診斷結(jié)果比較n

表2 3種方法間陽性率的比較

表3 以臨床診斷為金標準對3種方法檢測結(jié)果的比較%

2.3 3種方法單獨檢測及聯(lián)合檢測的臨床效能評估

以臨床診斷為金標準：聯(lián)合檢測時任一檢查結(jié)果陽性，判陽性；均為陰性時，判陰性。SAT 法單獨檢測與3 種方法聯(lián)合檢測敏感度及特異性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。繪制ROC曲線評價SAT法、PCR法、抗酸染色法單獨檢測及抗酸+SAT、抗酸+PCR、SAT+PCR、抗酸+SAT+PCR聯(lián)合檢測對肺結(jié)核診斷的價值，各檢測方法的AUC 分別為0.741、0.704、0.607、0.741、0.706、0.742、0.742，SAT法單獨檢測的AUC 與3 種方法聯(lián)合檢測的AUC 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

表4 3種檢測技術(shù)不同聯(lián)合檢測方式對肺結(jié)核的診斷效能

圖2 3種方法單獨檢測及聯(lián)合檢測結(jié)核分枝桿菌的ROC曲線分析

3 討論

早診早治是結(jié)核病防治的關鍵，目前對結(jié)核病診斷主要依靠實驗室診斷與臨床體征相結(jié)合，實驗室檢測主要包括痰涂片抗酸染色法、痰培養(yǎng)法、免疫學檢測、核酸檢測等。抗酸染色法操作簡單、快捷，但對于含菌量較少的標本容易漏檢，且非結(jié)核抗酸桿菌也可能出現(xiàn)陽性，不能作為肺結(jié)核診斷的唯一標準。痰培養(yǎng)為檢測分枝桿菌的標準，陽性檢出率高于痰涂片法，但耗時較長，需2～8周才能報告結(jié)果[9]。SAT 法是基于TMA 恒溫擴增技術(shù)發(fā)展起來的一項新的核酸檢測技術(shù)。其原理是通過設計特異性的結(jié)核分枝桿菌（Mtb）核糖體RNA 擴增引物及優(yōu)化探針技術(shù)，使用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶及極高轉(zhuǎn)錄活性的T7RNA 多聚酶來同時實現(xiàn)核酸恒溫擴增和儀器實時熒光檢測，能夠快速、直觀地反映樣本中Mtb 的感染情況，由于RNA 在環(huán)境中極易降解，且Mtb 死亡后RNA 也會降解，因此認為此技術(shù)不僅能有效避免污染，同時也是監(jiān)測活動性肺結(jié)核的有效手段[10-13]。近年來，也有多項研究對該項技術(shù)的臨床應用進行了評估[14-18]。

本研究結(jié)果顯示以臨床診斷為金標準，SAT 法的敏感度為48.43%，有文獻報道SAT法檢測痰液中的Mtb敏感度在37.6%～56.5%之間[19-21]，本研究與文獻報道一致，但各研究間稍有差異，可能與患者選擇、送檢痰液標本質(zhì)量、運輸、存放等有關。采用Kappa一致性分析發(fā)現(xiàn)，SAT法與RT-PCR法檢測結(jié)果有較好的一致性（P＞0.05），與抗酸染色法結(jié)果一致性較差（P＜0.05）。雖然如此，但SAT法的陽性檢出率（48.43%）高于RT-PCR法的41.47%及抗酸染色法的21.25%（P＜0.05）。SAT陽性預測值為99.68%（317/318），1例假陽性結(jié)果，經(jīng)回顧后發(fā)現(xiàn)該個例為臨界陽性結(jié)果，提示SAT 法檢測結(jié)果為陽性時，可以較好的診斷肺結(jié)核。SAT 法的陰性預測值是44.64%，雖然高于PCR 法及抗酸染色法，但仍然低于50%，一方面可能與痰樣本采集相關，有文獻報道提出，SAT法擴增過程敏感度較高，當標本中結(jié)核分枝桿菌活力較差或存在擴增抑制因子，或者核酸抽提效率不高時可能出現(xiàn)假陰性[20]，除在標本中加入質(zhì)控體系外進行監(jiān)測外，筆者認為在SAT檢測結(jié)果為陰性時，也應結(jié)合其它手段進一步明確患者是否感染Mtb。基于此，本研究也對3 種方法及其聯(lián)合診斷做了ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)3種方法聯(lián)合檢測診斷價值與SAT法單獨檢測比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明在肺結(jié)核的診療中，要提高SAT法的陰性預測值，需與除本文外的其它方法聯(lián)合，如血清TB-Ab、T-SPOT、培養(yǎng)法等，本文中3 種方法，無需重復檢測，采用SAT進行單項檢測即可，不僅簡便、快捷，對于減輕患者負擔也有一定作用。

綜上，SAT 法靈敏度高、特異性好，不僅優(yōu)于傳統(tǒng)的抗酸染色法，與成熟的分子檢測手段熒光實時PCR相比，也具有明顯優(yōu)勢，且能夠有效避免污染，作為新興的Mtb檢測手段，值得在臨床推廣應用。