王英宇，范樹平，李禧才，覃文濤，黃 維，晏益核△

（1.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院普通外科，南寧 530007；2.廣西醫(yī)科大學，南寧 530021；3.南方醫(yī)科大學順德醫(yī)院腫瘤科，佛山 528308）

肝細胞癌（HCC）是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第五[1]。盡管HCC的診斷和治療取得了巨大進展，但預后仍然很差，整體5年生存率僅為12%[2]。在治療上，早期患者僅通過手術切除、原位肝移植和消融的方法可以達到根治，而進展期患者只能選擇動脈化療栓塞、分子靶向藥物及免疫調節(jié)點抑制劑為代表的系統(tǒng)治療緩解病情[3]，其中肝切除目前仍為HCC 根治性治療的最重要手段。近年來，肥胖、2型糖尿病和脂肪肝逐漸開始成為主要致病因素。在脂肪肝誘導HCC形成的機制中，非酒精性脂肪肝（NAFLD)逐漸引發(fā)關注。NAFLD導致HCC 的發(fā)病率為0.5%～2.6%[4]。因此，尋找HCC與脂肪代謝相關的分子標志物就顯得尤為重要。

膜結合的O-酰基轉移酶結構域7(MBOAT7)的表達與NAFLD具有十分密切的聯(lián)系。MBOAT7位于富含磷質的內膜中，是一種通過LANDs循環(huán)參與磷脂?；溨貥嫷拿竅5]。其參與的LANDs 循環(huán)由水解、酰基輔酶A 合成和再?；行蚍磻M成，LANDs 循環(huán)可選擇性的將花生四烯酸合并磷酸基團，從而調控花生四烯酸的水平。已知在MBOAT7的突變與NAFLD 發(fā)生和嚴重性存在關聯(lián)[6]。但MBOAT7 與HCC 的直接相關性較少有文獻報道，F(xiàn)reund 等[7]采用了肝癌細胞系HepG2，驗證了在HepG2 中MBOAT7 存在上調現(xiàn)象。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC相關的普通轉錄組數(shù)據(jù)，同時采集臨床標本進行基因和蛋白表達水平的分析，研究肝癌組織中MBOAT7的基因和蛋白質表達，并探究MBOAT7 與HCC 臨床特征及預后的關系，為HCC的預防和控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 HPA（Human Protein Atlas）數(shù)據(jù)庫中檢索MBOAT7，在“cell”項目中探索MBOAT7在細胞內的分布情況；在GEPIA 數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）中在線分析MBOAT7 在各種腫瘤中的分布情況；從UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫（https://xena.ucsc.edu/）中下載TCGA中HCC的每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片（fregments per kilobase per million，F(xiàn)PKM）格式的轉錄組數(shù)據(jù)及臨床信息文件，轉錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過log2（FPKM+1）處理，均采用Illumina 技術平臺，最終下載到424 例樣本數(shù)據(jù)，癌旁組織組50例，HCC組374例。

1.2 數(shù)據(jù)處理 從下載的轉錄組數(shù)據(jù)中提取MBOAT7 的表達量，比較癌旁組織組和HCC 組MBOAT7的表達差異；以MBOAT7表達量的中位數(shù)作為劃分高低表達組的臨界值，臨床信息文件中，篩選出生存時間、生存狀態(tài)、性別、年齡、身高、體重質量、癌癥家族遺傳史、肝癌分級、肝癌分期和腫瘤殘留完整的病例，并根據(jù)身高和體重計算出體重指數(shù)（Ibm）值，按照世界衛(wèi)生組織標準，將Ibm 分為3個亞組（＜18.5 kg/m2，18.5～25 kg/m2，＞25 kg/m2），經(jīng)過篩選得到具有完整臨床數(shù)據(jù)信息264例。

1.3 MBOAT7在HCC中的預后情況及預測性能評估 使用開源的R 軟件（v3.6.2，https://www.r-project.org/）中的“survival”包對MBOAT7 的高、低表達組中的患者總體生存情況進行分析，方法采用Kaplan-Meier 法，P值顯著性通過log-rank 檢驗分析。在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中檢索MBOAT7，選擇HCC 的數(shù)據(jù)，對HCC患者中的無病生存率進行分析。用R的“survivalROC”包進行時間相關性的受試者特征曲線（ROC）繪制[8]，觀察MBOAT7 在患者1 年、3 年、5年的預測性能。

1.4 MBOAT7 與HCC 臨床性狀的相關性分析 R的“Survival”包對MBOAT7和HCC相關的臨床特征值進行單因素Cox和多因素的Cox回歸分析[9]，篩選出HCC中具有獨立預后價值的因素，并繪制獨立預后因素之間的表達差異柱狀圖。

1.5 MBOAT7高、低組差異分析 為了解MBOAT7高、低表達組的差異情況，利用R的“l(fā)imma”包對所有轉錄數(shù)據(jù)進行分析[10]，按照P＜0.05 和|logFC|＞1進行差異基因的篩選，并用R的“heatmap”包繪制出差異基因表達的聚類熱圖，可以看出高、低組表達上的差異情況，用“corrplot”包對差異基因之間的相關性進行展示，紅色表示正相關，綠色表示負相關。

1.6 差異基因的功能富集分析 利用R的“cluster-Profiler”包進一步對差異基因進行GO(gene ontology) 和KEGG(kyoto encyclopedia of genesand genome)功能富集分析[11]，可以得到高、低組之間的差異基因的功能作用，挑選出P值小于0.05 的富集結果。

1.7 分子基因集富集分析（GSEA）在MSigDB數(shù)據(jù)庫中[12]，選擇c2.all.v7.1.symbols.gmt 基因集進行GSEA 分析[13]，富集采用GSEA 4.0.3 軟件，以MBOAT7 高、低表達分組作為表型文件，全部轉錄組數(shù)據(jù)作為表達數(shù)據(jù)文件，置換檢驗次數(shù)1 000次；富集結果以P＜0.05、FDR q-val＜0.25和|NES|(標準化分數(shù))≥1作為富集顯著的篩選條件[14]。

1.8 mRNA 和蛋白質表達驗證實驗 選取符合納入和排除標準9例肝癌與癌旁標本作為本實驗的驗證對象。HCC患者的納入標準：在廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院明確診斷為HCC 的患者；Ibm 為18.5～25 kg/m2；年齡20～65 周歲。HCC 患者排除標準：存在嚴重的心、肺、腎等嚴重的內科合并癥；形成血管侵襲和肝外轉移；臨床資料不完整。采用Vazyme FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2 的試劑盒提取標本總RNA,后采用TaKaRa的PrimeScript?RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒進行RNA 逆轉錄實驗，TaKaRa 公司的TB Green Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（SYBR Green）完成qRT-PCR實驗，以β-actin作為內參。引物序列為β-actin 上游：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’,下游：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’；MBOAT7 上游：5’-GCCCAGAGGAAGGAAATGG-3’，下游：5’-TGCGGTAGCGGAAGAA CG-3’。分析采用2-ΔΔCt法，將癌旁組織mRNA表達量進行歸一化處理。同時，選取的9 例患者標本所制作的9組HCC組織和癌旁組織的石蠟切片，將該9組患者肝癌與癌旁標本通過三步法進行MBOAT7作為一抗的免疫染色，觀察免疫染色后的陽性結果的表達，本實驗采用DAB 染色，陽性結果顯色為黃褐色。其中一抗采用北京博奧森生物技術有限公司的MBOAT7 兔源多克隆抗體。實驗均經(jīng)過廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，采用單因素和多因素Cox 回歸分析挑選預后相關因子，相關性分析采用皮爾森相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MBOAT7 在各類腫瘤的表達 MBOAT7 在各類腫瘤中呈現(xiàn)出表達差異（圖1），在大多數(shù)腫瘤中，腫瘤組織的MBOAT7的表達高于癌旁組織。

圖1 MBOAT7在多種腫瘤中的表達情況

2.2 MBOAT7 在HCC 中的表達 TCGA 數(shù)據(jù)庫中，MBOAT7在HCC組中表達顯著高于癌旁組織組（圖2）。經(jīng)過對臨床信息的篩選，得到具有完整臨床性狀信息263 例，按照MBOAT7 的表達量分為高表達組（n=132）和低表達組（n=131），結果顯示，MBOAT7的表達與年齡、Ibm、腫瘤分級和家族遺傳史均具有明顯的相關性（表1）。

表1 MBOAT7高、低組的表達與HCC臨床特征的關系n（%）

圖2 MBOAT7在癌旁組織和HCC組織的表達情況

2.3 MBOAT7的預后情況 通過使用R的“Survival”包繪制單因素的Kaplan-Meier生存曲線，曲線顯示，高表達組的總體預后明顯低于低表達組（P＜0.001）（圖3A），采用GEPIA數(shù)據(jù)庫線上分析無病生存率，結果發(fā)現(xiàn)，高表達組的無病生存率也顯著低于低表達組（P＜0.05）（圖3B），說明MBOAT7 在HCC 中的預后研究中有很重要的意義。單因素和多因素Cox回歸分析分析提示，MBOAT7和病理分級是兩個獨立預后因子（表2），與時間相關的受試者工作特征曲線（ROC 曲線）說明MBOAT7 在預測HCC 患者1 年、3 年、5 年生存率的準確性上具有良好的準確性，曲線下面積（AUC）分別為0.706、0.697和0.643（圖3C）。

圖3 MBOAT7在HCC中的預后情況及預測能力

表2 MBOAT7和HCC臨床特征值的Cox回歸分析

2.4 差異基因的GO和KEGG富集分析 使用R的“l(fā)imma”包差異分析，得到397個差異基因，包括162個上調基因和235 個下調基因，并用火山圖和熱圖展示其表達的差異性（圖4A、圖4B）；皮爾森相關分析發(fā)現(xiàn)大部分差異基因之間具有正相關性（圖4C），差異基因的GO 富集結果顯示，生物學功能（BP）主要富集在類固醇代謝、環(huán)氧酶P450 途徑、類異戊二烯代謝過程等，細胞成分（CC）主要富集在高密度脂蛋白顆粒、脂蛋白顆粒和蛋白質—脂質復合物等，在分子功能（MF）上也有富集，如類固醇羥化酶活性、單加氧酶活性和氧化還原酶活性等（圖5A）；而KEGG 主要富集在化學致癌作用、藥物代謝―細胞色素P450和糖酵解/糖異生等通路（圖5B）。

圖4 差異基因的表達情況及相關性

圖5 差異基因的GO和KEGG功能富集分析

2.5 MBOAT7高表達組的GSEA GSEA富集結果顯示，MBOAT7 高表達組參與多種癌癥通路，主要富集在肝癌細胞增殖、MYC 信號通路、RAC1 信號通路（圖6），提示MBOAT7在HCC中可能通過這些癌癥通路參與HCC的發(fā)生和發(fā)展。

圖6 MBOAT7高表達組的GSEA富集結果

2.6 MBOAT7 mRNA 在HCC 組織中的表達 qPCR實驗顯示，MBOAT 7 mRNA的表達在HCC組織中明顯上調（圖7），與上述圖2 的結果一致，MBOAT 7 mRNA在HCC組織中的表達量和同一病人的癌旁組織比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。IHC 實驗結果顯示，MBOAT7 在HCC 組織呈中等程度的胞膜和胞漿陽性，且MBOAT 7 mRNA 在HCC 組織的表達水平顯著高于癌旁組織（圖8）。

圖7 MBOAT 7mRNA在HCC組織和癌旁組織的表達量

圖8 MBOAT 7蛋白在HCC組織和癌旁組織的表達結果

3 討論

本研究結果顯示，MBOAT7在HCC中的表達顯著高于癌旁組織組，Kaplan-Meier 生存曲線提示，MBOAT7 高表達組的總體生存率明顯低于低表達組（P＜0.05），提示MBOAT7 的高表達在HCC 患者的預后中是一個危險因素，最后利用qPCR 技術和IHC 實驗驗證了肝癌組織中MBOAT7 存在明顯上調，與分析結果一致（P＜0.05）。有報道顯示，MBOAT7 在腎透明細胞癌中隨腫瘤分級增加而增加，且也與不良生存率有關，是鑒定晚期腎透明細胞癌的靶標[15]。在本研究中，單因素和多因素Cox的結果顯示，MBOAT7和病理分級在HCC中是兩個獨立預后因子；在與HCC臨床特征關系的研究中發(fā)現(xiàn)，MBOAT7在年齡、Ibm、病理分級、家族遺傳史以及腫瘤分期多個性狀的亞組中均有差異表達（P＜0.05）。進一步對MBOAT7 高低表達組進行差異分析，并對所得的差異基因進行功能富集，結果顯示，差異基因在GO和KEGG的富集結果中主要和類固醇代謝有關，這也提示脂肪代謝可能參與HCC的發(fā)生。且有研究顯示，MBOAT7的變異與嚴重的脂肪肝疾病相關[16]，也提示了與HCC 存在的相關性。GSEA分析顯示，MBOAT7高表達組在肝癌、肺癌等多種腫瘤相關通路中有顯著富集，尤其是在肝癌細胞的增殖中富集明顯，表明了MBOAT7 與HCC 具有一定的相關性，可能是通過促進肝癌細胞增殖從而加快HCC的發(fā)展進程。

肝癌形成是多步驟的復雜過程，通常從微環(huán)境改變開始，隨著炎癥和纖維化產生，各種信號通路發(fā)生改變，轉換為癌前病變，繼而發(fā)展為HCC[17]。其中，活化的肝星狀細胞（HSC）為纖維發(fā)生的主要執(zhí)行者，慢性的肝損傷使肝竇內皮細胞喪失對HSC活化的抑制性呈正反饋加重纖維化。HSC 為促進腫瘤生長因素已被證實[18]，研究表明，MBOAT7 在HSC的細胞系中顯著高表達，并在肝內表達高于其他組織支持了本文的觀點，也肯定了MBOAT7基因突變型對于NAFLD的影響[7]。多數(shù)NAFLD相關的HCC 發(fā)生在肝硬化的背景下，但同時，越來越多的病理學和流行病學數(shù)據(jù)表明，NAFLD 中的HCC 可能在沒有肝硬化的情況下發(fā)生[19]，可降低MBOAT7在HCC的表達顯著性?，F(xiàn)對MBOAT7的基礎研究仍比較有限，并不能說明肝纖維化一定通過NAFLD 和MBOAT7 的差異來展現(xiàn)，比如肝細胞中PI 側鏈重塑途徑的紊亂就足以引發(fā)穩(wěn)態(tài)下的自發(fā)性脂肪變性和誘導飲食后的纖維化，證明肝細胞本體可能就是纖維化的致病驅動力[20]。但MBOAT7對HCC 的臨床意義不可忽視，通過本次研究的HCC 增殖和類固醇富集分析結果證明了脂質代謝參與影響HCC的進展，MBOAT7的主要機制是通過脂質代謝來影響HCC 進展還是尚有其他通路直接作用于肝癌細胞增殖尚有待于進一步的研究。

綜上所述，通過對公開數(shù)據(jù)庫的挖掘和初步的實驗驗證，本研究發(fā)現(xiàn)MBOAT7 的表達在HCC 的發(fā)生和發(fā)展中有十分重要的意義，研究MBOAT7在HCC 中的發(fā)生機制，有助于為HCC 的治療提供一個新型的治療靶點。