劉美娜，馬小芳，李程豪，童金輝，周桂江，關(guān)曉琳

(1. 西北師范大學(xué) 生態(tài)環(huán)境相關(guān)高分子材料教育部重點實驗室甘肅省高分子材料重點實驗室 化學(xué)化工學(xué)院，蘭州 730070;2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000; 3. 西安交通大學(xué) 理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，西安 710049)

0 引 言

作為在“2016新材料資本技術(shù)春季峰會”上發(fā)布的20大未來最具潛力新材料之一的量子點(quantum dots, QDs)，是一種極小的半導(dǎo)體納米晶體，呈現(xiàn)出特殊的光、電、磁學(xué)性質(zhì)，在醫(yī)學(xué)、太陽能電池、顯示照明等領(lǐng)域前景巨大[1-4]。特別是自2014年底，TCL在北京推出新品H9700 QDs電視，并在中國市場取得不俗的銷售業(yè)績，更使QDs的開發(fā)研究進入空前白熱化。

QDs是一類球形或準(zhǔn)球形納米粒子，它具有1～10 nm的穩(wěn)定直徑，且由半導(dǎo)體材料制成(通常由Ⅱ-Ⅵ，Ⅲ-Ⅳ或Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ元素組成)[5-6]。QDs由于其獨特的光學(xué)性質(zhì)，如高亮度、發(fā)射光波長可調(diào)、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命長和抗光漂白性高等優(yōu)勢，在近幾十年內(nèi)一直引起廣泛關(guān)注。

80年代初期，貝爾實驗室的Louis Brus博士，前蘇聯(lián)Yoff 研究所的Alexander Efros和Victor.I. Klimov 博士[7]在研究 QDs尺寸時均發(fā)現(xiàn)：不同粒徑尺寸的硫化鎘(CdS)QDs發(fā)射的熒光顏色是不一樣的，如圖1所示。這種有趣的實驗現(xiàn)象可用“量子限域效應(yīng)”解釋，且QDs尺寸與發(fā)光顏色之間存在特定的變化規(guī)律。該研究結(jié)果加速了QDs的發(fā)展，各種結(jié)構(gòu)性能的QDs材料被相繼開發(fā)和應(yīng)用。

圖1 QDs的熒光隨尺寸增大發(fā)生紅移現(xiàn)象Fig 1 Red shift in the fluorescence emission peak with respect to the increase in quantum dot size

研究早期，QDs主要是在有機相中合成，制備過程中需要復(fù)雜的前驅(qū)體及較高的溫度[8-9]，導(dǎo)致合成條件苛刻，步驟繁瑣，操作難度高，且制備所得QDs材料水溶性較差，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[10-11]。研究者為了提高QDs的水溶性和生物相容性，最初采用通過在QDs表面進行配體交換和接枝修飾的方法將有機相轉(zhuǎn)化為水相[12-16]。其中最常用的方式是將一些具有生物相容性的功能分子接枝修飾于QDs表面，達到增強原有QDs的水溶性和生物相容性的目標(biāo)。例如，1988年P(guān)aul Alivisatos和Warren Chan兩位教授課題組[17-18]分別通過改良CdSe/ZnS QDs的合成方法，將水溶性的二氧化硅殼接枝在表面，并與生物大分子生物素(C10H16N2O3S)結(jié)合，將其應(yīng)用于3T3 cells(小鼠成纖維細(xì)胞)中獲得良好的熒光顯影效果，成功實現(xiàn)QDs在活細(xì)胞體系中的熒光成像，如圖2所示。這一成果發(fā)表在了Science上，引起廣泛關(guān)注。

圖2 CdSe/ZnS QDs在小鼠成纖維細(xì)胞中的成像圖Fig 2 CdSe/ZnS QDs imageing in 3T3 cells

但是，QDs在上述由油相向水相的轉(zhuǎn)化過程中，熒光量子產(chǎn)率(PLQY)和穩(wěn)定性均會發(fā)生明顯的降低，影響QDs的實際應(yīng)用效果[19-22]。而與有機相合成方法相比，QDs的水相合成方法具有操作簡單、過程環(huán)保、成本低廉以及生物相容性良好等優(yōu)勢，是合成QDs的最佳方法。例如，佛羅里達州立大學(xué)Hedi Mattoussi教授課題組[23-24]利用親水性聚合物在水相中通過一步法制備出高量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定好，并具有多個反應(yīng)位點的QDs復(fù)合材料。南京郵電大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院的汪聯(lián)輝教授發(fā)展了基于聚合物/QDs納米復(fù)合物光電材料的新型生物傳感器及其檢測技術(shù)，并成功用于生物分子的高靈敏、高特異性檢測[25- 26]。本課題組在環(huán)境友好水溶性聚合物/QDs納米復(fù)合材料及多類型聚合物高效修飾QDs方面也開展了一些研究，并已研制出檢測環(huán)境水樣中痕量重金屬離子及溶解性有機質(zhì)的QDs熒光探針[27-28]。

目前，研究較多的主要是Ⅱ-Ⅵ二元族QDs，例如CdS、CdTe、CdSe、CdS /ZnS、CdSe/ZnS QDs等。但是由于其中重金屬離子Cd2+的釋放會產(chǎn)生很高毒性，對環(huán)境和人類的身體健康造成不同程度的影響，如Cd2+或Pb2+等重金屬元素在細(xì)胞中聚集最終將導(dǎo)致細(xì)胞死亡[29]。因此，開發(fā)不含有毒重金屬元素的QDs來替代基于Cd2+或者Pb2+的二元QDs具有重要的研究和應(yīng)用價值。

Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ型QDs，是近些年出現(xiàn)的一種新型QDs，克服了傳統(tǒng)QDs包含對環(huán)境和生物體系毒性較大的重金屬元素(鎘或鉛)的問題，可以有效地降低QDs的生物毒性和對環(huán)境污染，擴大了QDs的應(yīng)用范圍[30-31]。其中，CuInS2由于無毒，太陽光吸收系數(shù)高，光化學(xué)性能穩(wěn)定且熒光波長涵蓋從可見光區(qū)到近紅外區(qū)，是一種非常理想的太陽能電池和生物光學(xué)成像材料[32]。

CuInS2QDs具有QDs特有的帶隙結(jié)構(gòu)，其結(jié)晶結(jié)構(gòu)有兩種，分別是斜方晶型結(jié)構(gòu)和四方黃銅礦結(jié)構(gòu)，對應(yīng)的帶寬分別1.98和1.87 eV[33]。基于CuInS2QDs特殊的發(fā)光機理，其熒光光譜可以覆蓋整個可見光和部分近紅外區(qū)域，發(fā)射出的光子可以通過滲透生物體組織并減小生物體的自熒光所帶來的干擾[34-35]。同時，CuInS2QDs具有大的斯托克斯位移，長的熒光壽命，較長的發(fā)射波能減少外界激發(fā)波帶來的干擾，有利于生物成像應(yīng)用。此外，與傳統(tǒng)的二元QDs相比，CuInS2QDs沒有明顯的第一激子峰，在可見光和近紅外區(qū)域吸光系數(shù)很大，且平均熒光壽命普遍比二元QDs高[36]。并且，CuInS2QDs可以在較為溫和的條件下合成[37]。因而，近年來越來越多的研究者選用CuInS2量子點作為研究及應(yīng)用對象，以達到降低毒性、環(huán)保的效果，從而滿足當(dāng)前對環(huán)境友好型材料的戰(zhàn)略要求[38-41]。尤其在生物應(yīng)用領(lǐng)域被視為最具潛力的新型QDs材料。

1 CuInS2 QDs的合成

目前，CuInS2三元QDs的合成方法主要包括有機相和水相兩種方式。有機相合成是目前研究的主導(dǎo)，而水相合成也越來越得到研究者的青睞，兩種方法具有各自的優(yōu)點，并被不斷發(fā)展和完善。

1.1 油溶性CuInS2 QDs的合成

1993年時，Hirpo等[42]首先制備出含有Cu, In, S三種元素的前驅(qū)體(PPh3)2CuIn(SEt)4，隨后通過熱解重量分析法得到了一種新型CuInS2三元QDs。然而該方法中前驅(qū)體的轉(zhuǎn)變過程較為復(fù)雜。 2003年，Castr課題組[43]首次通過在200～300 ℃下熱分解前驅(qū)體(PPh3)2CuIn(SEt)4的方法，制備出尺寸較小、具有黃銅礦結(jié)構(gòu)的CuInS2QDs。2008年時，Gardner課題組[44]改用微波照射前驅(qū)體(PPh3)2CuIn(SEt)4成功合成了CuInS2QDs。上述方法都是在一定條件下以金屬有機分子(PPh3)2CuIn(SEt)4為前驅(qū)體，采用一定的方式將三種元素分解出來從而制備CuInS2QDs。但是，由于前驅(qū)體(PPh3)2CuIn(SEt)4制備過程繁瑣，反應(yīng)成本過高，并具有一定的毒性，不利于大規(guī)模合成CuInS2QDs類材料。

此后，研究者又陸續(xù)開發(fā)出一些新的方法制備CuInS2QDs，包括微波協(xié)助法[45]、熱注法[46]以及熱溶劑法等[47]。2008年時，北京理工大學(xué)的鐘海政教授課題組[48]以乙酸銦和乙酸亞銅為原料，烷基硫醇為硫源在高溫240 ℃下制備出CuInS2QDs，并通過改變反應(yīng)溫度和時間有效控制CuInS2QDs的尺寸和光學(xué)特性。這種方法避免了復(fù)雜結(jié)構(gòu)前驅(qū)體(PPh3)2CuIn(SEt)4的制備。2016年，Prashant教授課題組[49]通過改變金屬離子Cu/In的比例，實現(xiàn)了對CuInS2QDs發(fā)光顏色的有效調(diào)控。

此外，研究者常通過在QDs表面進行殼層包覆或制備合金的方式進一步提高CuInS2QDs的PLQY和發(fā)光穩(wěn)定性[50-51]。例如，2011年，Heesun Yang等[52]在230 ℃下，將陽離子前驅(qū)體碘化亞銅(CuI)和乙酸銦，以及配體正十二硫醇加入溶劑1-十八烯中反應(yīng)5 min，先形成CuInS2量子點核，然后注入Zn前驅(qū)體硬脂酸鋅溶液，在240 ℃下反應(yīng)1 h后在CuInS2量子點核表面形成ZnS殼層，即得到核殼結(jié)構(gòu)的CuInS2/ZnS量子點，其量子效率高達78 %。

目前，大多數(shù)CuInS2QDs的合成是在有機溶劑及高溫條件下進行的[53-54]。這種“有機相合成法”需要高溫儀器設(shè)備，實驗操作難度較高，且制備出的CuInS2QDs具有很強的親油性，水溶性很差，難于在含水的生物環(huán)境中應(yīng)用。而增強上述CuInS2QDs親水能力的常用方法是通過配體交換或者在QDs表面接枝親水性的聚合物來實現(xiàn)。但在此轉(zhuǎn)化過程中顯著延長了材料合成周期，提高了制備成本。因此，通過直接在水溶液中合成CuInS2QDs是獲得此類水溶性材料的最佳選擇。

1.2 水溶性CuInS2 QDs的合成

1.2.1 一步水相合成法

與前述有機相合成方法不同的是，水相合成法步驟少，操作簡單，有效避免后期的純化和修飾過程，所得QDs具有優(yōu)異的水溶性，可被直接應(yīng)用于生物領(lǐng)域[55-58]。迄今為止，水相合成CuInS2QDs的配體及穩(wěn)定劑大多為兩親性分子，如巰基丙酸(MPA)、巰基乙酸(TGA)等小分子。例如，2014年，吉林大學(xué)的蘇星光課題組[59]以氯化銅(CuCl2)、氯化銦(InCl3)和硫脲(CS(NH2)2) 為原料，MPA為配體，在150 ℃及pH=11的條件下，通過在反應(yīng)釜中反應(yīng)21 h，成功制備出發(fā)紅光的水溶性CuInS2QDs。同年，Zhou等[60]以CuCl2、InCl3和硫化鈉(Na2S)為原料，巰基乙酸(TGA)為配體在130 ℃下反應(yīng)7h，得到了結(jié)構(gòu)為纖維鋅礦晶型的水溶性的CuInS2QDs。

然而，由于含有巰基的小分子具有強烈的刺激性氣味，在實驗和后期處理過程中會釋放出毒性氣體，危害科研人員的身體健康。因此，開發(fā)低毒或無毒的高效配體是水相合成法制備CuInS2QDs急需解決的問題。目前，已有一些有效的低毒性配體被報道，例如，Gao課題組[61]以CuCl2、InCl3和CS(NH2)2為原料，L-谷氨酸(PGA)為配體在150 ℃、pH=11.3的條件下在反應(yīng)釜中反應(yīng)21 h，制備得到水溶性的CuInS2QDs，然后將其與抗癌藥物阿霉素(DOX)結(jié)合制備得到功能化的量子點CuInS2-PGA-DOX。由于DOX可通過電子轉(zhuǎn)移淬滅CuInS2QDs的熒光，從而導(dǎo)致CuInS2QDs處于熒光“關(guān)閉”狀態(tài)。而當(dāng)CuInS2-PGA-DOX納米顆粒被癌細(xì)胞吞噬后，由于水解釋作用釋放出DOX，激活CuInS2QDs進入熒光“開啟”狀態(tài)。因此，CuInS2-PGA-DOX納米顆粒不僅可以將抗癌藥物DOX有效傳遞至目標(biāo)癌細(xì)胞中，并且通過CuInS2QDs的熒光“開啟”信號強弱變化，實時監(jiān)控抗癌藥物DOX的釋放情況，有望實現(xiàn)診療一體化，在癌癥治療的臨床應(yīng)用方面發(fā)揮作用，如圖3所示。

雖然，通過水相合成法制備CuInS2QDs，有效的克服了有機相中實驗條件苛刻、制備過程繁瑣和產(chǎn)品水溶性差等難題，但在應(yīng)用中卻存在PLQY低、穩(wěn)定性差等缺陷。因此，研究者們?nèi)匀辉诓粩鄧L試開發(fā)新的水相配體，以及改進合成方法，期望獲得發(fā)光性能更加優(yōu)異的水溶性CuInS2QDs，滿足生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用需求。

1.2.2 油溶性CuInS2QDs的表面親水修飾

由于有機相合成法制備的CuInS2三元QDs熒光性能優(yōu)異，因此，目前大部分的高質(zhì)量QDs仍采用此方法來合成，然后通過三種方法解決因其表面大量疏水基團存在而導(dǎo)致的親水性差，無法有效在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的難題[62]。第一種方法是配體交換法，顧名思義就是將QDs表面的疏水基團交換為親水基團。Zhao等[63]用CuI、醋酸

銦(In(Ac)3)和Zn(Ac)2為原料，在230 ℃下合成了表面含有疏水性油酰胺(OLA)結(jié)構(gòu)的高效發(fā)光CuInS2/ZnS核殼QDs，PLQY高達70%。隨后，基于MPA對量子點表面具有更高的表面親和能力，從而通過配體交換取代CuInS2/ZnS QDs表面的OLA。緊接著，又通過GSH與MPA之間的配體交換，成功獲得表面含有GSH的親水性CuInS2/ZnS QDs，最終實現(xiàn)其從有機相向水相的轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)化過程如圖4所示。但是，遺憾的是，經(jīng)過兩次配體轉(zhuǎn)化，CuInS2/ZnS QDs的PLQY從最初的70%降至34%。由此可見，雖然可以通過上述配體交換法，制備水溶性CuInS2QDs，但是在配體轉(zhuǎn)化過程中，原有QDs PLQY會被大大降低，進而影響其發(fā)光效率，降低材料的應(yīng)用價值。因此，如何在實現(xiàn)高性能油溶性CuInS2QDs向水溶性轉(zhuǎn)變的同時，還能保留其原有的高發(fā)光特性是研究者們繼續(xù)努力的目標(biāo)。

圖4 水溶性CuInS2/ZnS QDs表面配體交換過程(a、b、c)乳腺腫瘤細(xì)胞成像Fig 4 Ligand exchange process on the surface of water-soluble CuInS2/ZnS QDs, (a, b,c) imaging in MCF10CA1a breast tumor cells

第二種方法是膠束法。例如，Deng等[64]在230 ℃下用油胺為穩(wěn)定劑合成了油溶性的CuInS2/ZnS QDs，隨后將合成的N-琥珀酰N'-辛基殼聚糖膠束(FA-SOC)接枝在CuInS2/ZnS QDs表面，合成了表面含有大量親水基團的水溶性CuInS2QDs，修飾后的QDs保留了初始CuInS2/ZnS QDs的形貌、晶體結(jié)構(gòu)和發(fā)光特性。最后，Deng又在其表面鍵合大量葉酸分子，制備出具有靶向功能的量子點CuInS2/ZnS-FA-SOC，以其作為高效熒光顯影劑，有效應(yīng)用于體內(nèi)和體外熒光成像。

第三種方法是聚合物表面修飾。聚合物具有機械性能良好、質(zhì)量輕、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易于加工成型等優(yōu)點，是對QDs表面進行修飾的優(yōu)良材料。 被聚合物修飾后的QDs，一方面可以通過聚合物分子鏈之間的排斥作用有效防止QDs之間的團聚，另一方面通過聚合物優(yōu)異的加工性能，制備成各種尺寸器件，在太陽能電池、生物探針等領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景[65-66]。在已報道的文獻中，CuInS2QDs表面的聚合物修飾方式主要有兩種，一種是通過疏水或者靜電等弱作用力，將QDs材料分散在聚合物的基體之中，這種方法叫做共混法；另一種方法是通過化學(xué)反應(yīng)用強的共價鍵將QDs與聚合物緊密結(jié)合在一起，這種方法叫做鍵合法。最初因共混法操作簡便而備受青睞，但制備出的材料尺寸分布不均一，且表面易團聚的問題使材料在實際應(yīng)用中完全或部分喪失其特有的價值。與之相比，鍵合法制備的材料尺寸均一且表面粘合度較高，是目前聚合物接枝修飾QDs的主要方法[67]。其中，當(dāng)QDs被用于生物成像或生物診斷等生命學(xué)科時，選取的基體材料是具備生物相容性及水溶性的聚合物，如聚乳酸(PLA)[68]、聚丙烯酸(PAA)[69]、聚乙二醇(PEG)[70]等。例如， 2017年，Yang等[71]在合成的CuInS2/ZnS QDs表面通過鍵合法將二乙烯三胺五乙酸(DTDTPA)沉積到CuInS2/ZnS QDs表面，然后再將Gd3+螯合，制備出CuInS2/ZnS共軛釓復(fù)合物(CuInS2/ZnS QDs@DTDTPA-Gd)，用于近紅外熒光和t1加權(quán)MR雙峰成像(圖5)。

圖5 CuInS2/ZnS QDs @DTDTPA-Gd的制備 Fig 5 Preparation of CuInS2/ZnS QDs @DTDTPA-Gd

上述三種方法相比，第一種配體交換法能夠有效保證QDs的小尺寸和良好的分散性，更有利于生物熒光成像。但是，配體交換過程仍需在有機相中進行，反應(yīng)溫度較高，操作難度大，同時交換后PLQY有一定程度的損失。而后兩種方法會增大QDs的尺寸影響其生物應(yīng)用效果。

2 CuInS2三元QDs在生物領(lǐng)域的應(yīng)用

近年來，由于CuInS2QDs優(yōu)良的發(fā)光特性、強的光穩(wěn)定性和良好的抗光漂白性能，更因為其表現(xiàn)出的低毒環(huán)保特性，其已被視為理想的綠色光學(xué)材料而被廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域，尤其是在生物分子檢測和細(xì)胞成像方面展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。

2.1 生物體系中對離子及分子檢測應(yīng)用

CuInS2QDs的熒光性質(zhì)具有隨著某種外界環(huán)境或外界物質(zhì)含量改變而變化的特性，因此，可通過對某種生物分子的敏感響應(yīng)性能進行定量分析和檢測。而與其它傳統(tǒng)的生物熒光分子探針相比，CuInS2QDs具有連續(xù)激光光譜寬、對稱發(fā)射光譜窄、光化學(xué)穩(wěn)定性高和發(fā)光顏色可控等優(yōu)勢。更重要的是，其低的生物毒性和生物相容性使CuInS2QDs更有利于在生物體中應(yīng)用。

例如，蘇星光課題組[72]采用MPA為穩(wěn)定劑使用一步水熱法合成發(fā)射波長在670 nm的CuInS2QDs，并通過一系列表面功能化修飾，實現(xiàn)對溶菌酶、多巴胺分子、磷酸酶、2,4,6-三硝基苯酚等多分子的檢測。在檢測溶菌酶時，因為聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDAD)可以使CuInS2QDs的熒光猝滅，而溶菌酶分子易于通過靜電作用與PDAD結(jié)合而使熒光恢復(fù)，從而起到有效檢測溶菌酶的作用，其檢出限可達到6 nmol/L。其次，還可利用CuInS2QDs表面的3-氨基苯硼酸與多巴胺分子反應(yīng)生成硼酯鍵，引起QDs熒光淬滅，從而實現(xiàn)對生物分子多巴胺的有效檢測，該方法的檢出限可低至0.02 μmol/L。同時，由于雙氰胺可以與2，3-丁二酮反應(yīng)生成具有鄰位二羥基結(jié)構(gòu)的環(huán)化產(chǎn)物，該物質(zhì)可以與3-氨基苯硼酸反應(yīng)生成硼酯鍵，引起QDs熒光淬滅，可以對牛奶中的雙氰胺進行定量檢測，檢出限為0.6 μmol/L。此外，表面經(jīng)色氨酸修飾后的CuInS2QDs，可與堿性磷酸酶發(fā)生去磷酸化作用，從而實現(xiàn)對癌癥腫瘤標(biāo)志物堿性磷酸酶的檢測，其檢出限可達到3.6 nU/mL。最后，表面經(jīng)牛血清蛋白修飾后的CuInS2QDs可與2,4,6-三硝基苯酚(TNP)發(fā)生相互作用，從而建立了一種檢測2,4,6-三硝基苯酚的有效方法，其檢出限可達到 28 nmol/L。

Liu等[73]采用一鍋水熱法將氨基酸L-半胱氨酸(cys)接枝修飾于CuInS2QDs表面，合成了平均粒徑為3.3 nm，尺寸均一，

熒光穩(wěn)定，發(fā)射波長在656 nm的Cys-CuInS2QDs。當(dāng)在其水溶液中加入Cu2+后，由于Cys-CuInS2QDs表面半胱氨酸的胺基與Cu2+之間的發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致Cys-CuInS2QDs表面無輻射e-/h+發(fā)生了重組，從而造成Cys-CuInS2QDs的熒光發(fā)生猝滅，如圖6所示。此外，Liu利用β-葡萄糖苷酶(β-Glu)降解生氰苷Amy，使其轉(zhuǎn)化為游離CN-，再基于CN-與Cu2+的結(jié)合作用，干擾Cys-CuInS2QDs與Cu2+之間的電子轉(zhuǎn)移過程，從而使熒光得以恢復(fù)，以此建立一種簡便且可逆的檢測β-Glu的熒光方法。另一方面，在β-Glu抑制劑的存在下，β-Glu活性被抑制，系統(tǒng)熒光將再次保持“熄滅”狀態(tài)。因此，Cys-CuInS2QDs也可被用于對β-Glu抑制劑的篩選。圖6為“開關(guān)型”熒光納米顆粒探針用于β-Glu測定及其抑制劑篩選的示意圖。

圖6 “開關(guān)型”熒光納米顆粒用于β-Glu測定和制劑篩選的示意圖Fig 6 Schematic diagram of fluorescent “on-off” nanoprobe for β-Glu determination and inhibitor screening

此外，Liu等[74]研究對比了18種氨基酸對CuInS2/ZnS QDs的修飾效果，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸(Cys)與蘇氨酸(Thr)協(xié)同修飾后所得CuInS2/ZnS QDs的PLQY最佳。該QDs平均粒徑為4.8 nm, 發(fā)射波長為710 nm，位于近紅外區(qū)。隨后他們系統(tǒng)研究該CuInS2/ZnS QDs對Cd2+的熒光響應(yīng)效果和機理。研究結(jié)果表明，隨著CuInS2/ZnS QDs溶液中Cd2+濃度的不斷增大，體系熒光出現(xiàn)明顯的增強現(xiàn)象，且Cd2+的濃度于熒光強度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。機理研究進一步表明，由Cys和Thr修飾的CuInS2/ZnS QDs外層的Zn2+可與Cd2+發(fā)生陽離子交換而被取代，而表面形成的CdS由于減少了電子-空穴相互作用，導(dǎo)致熒光強度顯著增強，從而實現(xiàn)對Cd2+的靈敏檢測，其檢出限可達到7.8 nmol/L。此外，Liu等進一步研究了CuInS2/ZnS QDs在A549肺癌細(xì)胞中對Cd2的檢測情況及多色成像的效果，如圖7所示。CuInS2/ZnS QDs在710 nm處發(fā)射紅色熒光，隨著體系中Cd2+的濃度增加熒光增強，從而到達了在細(xì)胞中有效檢測Cd2+的效果。

圖7 半胱氨酸和蘇氨酸協(xié)同修飾CuInS2/ZnS QDs的合成及其在Cd2 +定量和多色成像中的應(yīng)用Fig 7 Synthesis of Cys- and Thr- Capped CuInS2/ZnS QDs and their applications in Cd2+ quantification and multicolor imaging

2019年，Li等[75]首先合成一種發(fā)射峰位于638 nm附近(紅色熒光)，PLQY高達28.6 %的CuInS2/ZnS QDs，然后用配體谷胱甘肽(GSH)對其進行修飾，以增強其水溶性，修飾后的QDs發(fā)射峰藍移至520 nm附近 (綠色熒光)。接著將Ce3+偶聯(lián)于該QDs表面，產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)。再通過ATP與金屬離子Ce3+較強的結(jié)合能力，將QDs表面的Ce3+解離出來，恢復(fù)QD原有熒光強度。因此，可通過這種簡便的陽離子交換策略，實現(xiàn)對生物分子ATP的靈敏檢測，示意圖如圖8所示。最后，他們將Ce3+偶聯(lián)的CuInS2/ZnS QDs與人胚胎成纖維細(xì)胞(HELF)和腫瘤Hela細(xì)胞共孵育，通過在共聚焦顯微鏡觀察熒光強弱變化情況。研究結(jié)果表明，由于正常細(xì)胞HELF中ATP含量較低，QDs與HELF共孵育后，在細(xì)胞成像過程中沒有獲得強熒光信號。但是，由于在腫瘤細(xì)胞中ATP含量較高，通過與QDs表面Ce3+的偶聯(lián)作用，使熒光增強，從而在Hela細(xì)胞中觀察到較強的熒光信號。此外，Ca2+可以激活線粒體中脫氫酶以促進ATP的產(chǎn)生。在用Ca2+處理過的Hela細(xì)胞中，由于ATP含量增高，在細(xì)胞成像中獲得最強的熒光信號， 因此，該研究為監(jiān)測癌細(xì)中ATP水平提供了一種有效方法和熒光探針材料。

圖8 (a) 探針CuInS2/ZnS QDs的制備、(c、d、e)不同濃度的Ce3+、ATP的熒光圖以及校準(zhǔn)曲線、(b)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的成像對比Fig 8 (a) Preparation of CuInS2/ZnS QDs Probe, (c, d,e) fluorescence graphs and calibration curves of Ce3+ and ATP at different concentrations, (b) imaging contrast of HELF cells and Hela cells

綜上所述，各種各樣表面功能化的CuInS2QDs在生物檢測領(lǐng)域已取得了一定的效果，但是目前仍然面臨一些問題，例如：與其它熒光生物探針相比，水溶性CuInS2QDs具有發(fā)光效率較低，檢出限較高等缺陷。研究者們還需要通過各種方法來解決這個長期的問題，從而提高CuInS2QDs作為熒光探針在生物檢測中的應(yīng)用價值。

2.2 生物成像應(yīng)用

迄今為止，大量研究表明，QDs可以通過與生物大分子偶聯(lián)而融入到細(xì)胞體內(nèi)，實現(xiàn)對活細(xì)胞、蛋白質(zhì)和DNA等生命物質(zhì)進行長時間的熒光標(biāo)記，使得QDs在臨床診斷和藥物篩選等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。但是，傳統(tǒng)含重金屬Cd2+的QDs由于具有高的生物毒性，限制了其在生物醫(yī)學(xué)鄰域的廣泛應(yīng)用。相比之下，CuInS2QDs的生物毒性較低，熒光壽命長，且發(fā)光顏色可覆蓋部分近紅外區(qū)，有利于穿透組織層進行深組織成像，同時可大大降低生物組織由于自發(fā)熒光而產(chǎn)生的干擾。因此，相比于其它類型的熒光探針材料，CuInS2QDs在生物成像(體內(nèi)和體外)應(yīng)用方面具有獨特的優(yōu)勢和巨大的潛力。

2.2.1 體外成像應(yīng)用

近年來，由于具有近紅外(NIR)發(fā)光性能的CuInS2QDs表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性、高的熒光效率、深的組織穿透能力和低的生物毒性等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于近紅外熒光成像領(lǐng)域。例如，Su等[76]首先以CuCl2和InCl3為金屬前體，CS(NH2)2為硫源，MPA為配體，在150 ℃、pH=11的條件下反應(yīng)21 h制備水溶性的CuInS2QDs，然后將即具有載藥能力又具有靶向能力的跨膜分子MUC1-(CGA)7適體鍵合于CuInS2QDs表面，最后將抗癌藥物DNR(柔紅霉素)修飾到CuInS2QDs表面，實現(xiàn)了對PC3M cells(人前列腺癌細(xì)胞)和HepG2 cells(肝癌細(xì)胞)的診療一體(圖9)。

圖9 DNR-MUC1-CuInS2 QDs的制備、(A)前列腺細(xì)胞成像、(B)肝癌細(xì)胞成像、(C)細(xì)胞存活率Fig 9 Preparation of DNR-MUC1-CuInS2 QDs, (A) imaging in PC3M cells, (B) imaging in HepG2 cells, (C) Cell viability

Hu等[77]首先以CuCl2、InCl3·4H2O和Zn(Ac)2為金屬前體，Na2S為硫源，MPA為配體合成CuInS2/ZnS QDs，然后采用“微流控芯片法”將變性的牛血清蛋白(dBSA)修飾在CuInS2/ZnS QDs表面，合成了生物相容性良好的dBSA-CuInS2/ZnS QDs，其發(fā)射波長位于近紅外范圍內(nèi)，且可通過調(diào)整反應(yīng)條件使其波長從650 nm紅移至750 nm。此外，dBSA-CuInS2/ZnS QDs呈現(xiàn)較長的熒光壽命(153.66 ns)。為了進一步的探究dBSA-CuInS2/ZnS QDs在生物成像中的適用性，該課題組將具有靶向功能的葉酸分子和透明質(zhì)酸修飾在dBSA-CuInS2/ZnS QDs表面，研究其對巨噬細(xì)胞(RAW264.7 cells)、肝癌細(xì)胞(HepG2 cells)和胰腺癌細(xì)胞(Panc-1 cells)的細(xì)胞毒性和成像效果。結(jié)果表明，dBSA-CuInS2/ZnS QDs具有較低的細(xì)胞毒性和對腫瘤細(xì)胞良好的靶向成像功能。這種基于“一步式”的合成方法提供了一種快速、簡便且廉價的三元QDs納米晶體合成方式(圖10)。

圖10 (a) dBSA-CuInS2/ZnS QDs的制備、(b)巨噬細(xì)胞成像、(c)肝癌細(xì)胞成像、(d)胰腺癌細(xì)胞成像Fig 10 (a) Preparation of dBSA-CuInS2/ZnS QDs, (b) imaging of RAW264.7 cells, (c) imaging of HepG2 cells, (d) imaging of Panc-1 cells

最近，Chen等[78]基于水溶性聚合物PEG合成一種具有良好生物相容性的新型PEG-CuInS2/ZnS QDs，并系統(tǒng)研究該三元QDs的毒理學(xué)特征，尤其是免疫毒性。他們使用DC2.4細(xì)胞系(小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞)對PEG-CuInS2/ZnS QDs進行了體外細(xì)胞毒性研究，同時進行了BALB/c小鼠(常見實驗小鼠)的體內(nèi)免疫毒性測試。體外細(xì)胞實驗表明，PEG-CuInS2/ZnS QDs被DC2.4細(xì)胞吸收后可促進細(xì)胞活力，并增強腫瘤壞死因子-α的釋放，從而刺激脂多糖降低白介素6(IL-6)的水平(白介素6是炎癥早期的敏感性物質(zhì))。小鼠體內(nèi)研究表明，PEG-CuInS2/ZnS QDs進入小鼠體內(nèi)一天后即增加了白介素4(IL-4)(白介素4是過敏性和自身免疫性疾病的發(fā)病中起重要的作用)的水平，并在第28 d增強了白介素10(IL-10) (白介素10是炎癥與免疫抑制因子)和白介素13(IL-13) (白介素13是炎癥與免疫抑制因子)的水平。治療1與28 d相比，脾臟淋巴細(xì)胞的數(shù)量、器官指標(biāo)、血液學(xué)和免疫器官組織無明顯差異，表明PEG-CuInS2/ZnS QDs在生物體內(nèi)和體外都具有較低的毒性和很高的生物相容性，具有較高的生物應(yīng)用潛力。PEG-CuInS2/ZnS QDs 對DC2.4細(xì)胞活力和細(xì)胞因子產(chǎn)生的體外影響如圖11所示。

圖11 PEG-CuInS2/ZnS QDs 對DC2.4細(xì)胞活力和細(xì)胞因子產(chǎn)生的體外影響Fig 11 In vitro effects of CuInS2/ZnS QDs on viability and cytokine production of DC2.4 cells

綜上所述，由于各種功能化的CuInS2QDs所發(fā)射的近紅外熒光具有優(yōu)異的組織穿透能力和較低的背景熒光，且在細(xì)胞成像中表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光性質(zhì)和較好的生物相容性，已被用于生物醫(yī)學(xué)診斷和治療中，具有相對比較成熟的發(fā)展。

2.2.2 體內(nèi)成像

相比于生物體外熒光成像，活體熒光成像能夠?qū)崿F(xiàn)將分子成像技術(shù)從體外轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，能夠更準(zhǔn)確觀測活體動物內(nèi)的基因表達和細(xì)胞活動，由此提供有關(guān)治療或疾病進展的生物學(xué)效應(yīng)的最完整信息，對醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究意義重大。

實現(xiàn)體內(nèi)生物熒光成像的關(guān)鍵是高性能熒光探針的使用。為了滿足生物體內(nèi)應(yīng)用要求，熒光探針材料必須具備以下幾點特性：(1) 強的親水性；(2) 低的生物毒性；(3)優(yōu)異的生物相容性；(4)在生理pH條件下和在水中保持結(jié)構(gòu)和熒光穩(wěn)定性；(5)具有靶向功能，易于與生物標(biāo)記物結(jié)合。因而，體外應(yīng)用所報道的部分熒光探針，例如鎘基QDs材料，是無法滿足體內(nèi)成像要求的。相比之下，親水性CuInS2QDs是一種高效發(fā)光的無毒半導(dǎo)體納米材料，具有在可見光和近紅外可調(diào)、光穩(wěn)定性好、熒光效率高、組織穿透深、毒性低等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于生物體內(nèi)近紅外熒光成像中。例如，Zhu等[79]用碘化亞銅、乙酸銦和生物分子核糖核酸酶A(RNAse-A)制備了水溶性的A-CuInS2QDs。該A-CuInS2QDs在小鼠成骨細(xì)胞(MC3T3-E1 cells)有良好的成像效果。為了進一步證實該A-CuInS2QDs在體內(nèi)的成像應(yīng)用效果，該課題組進一步將A-CuInS2QDs注射到小鼠體內(nèi)，通過體內(nèi)示蹤和體外成像技術(shù)在小鼠胃部監(jiān)測到強的熒光信號，組片分析結(jié)果表明，該A-CuInS2QDs未使小鼠組織產(chǎn)生毒性效應(yīng)，且具有良好的體內(nèi)成像性能、強的組織穿透性和優(yōu)異的光穩(wěn)定性。

最近，Rama S. Verma等[80]首先用CuI、In(Ac)3和硬酯酸鋅(Zn(St)2)為金屬前體，1-十二烷硫醇(1-DDT)為配體在230 ℃下采用微波輔助法合成了油溶性的CuInS2/ZnS QDs，其PLQY高達76%。然后通過表面配體交換的方式將11-巰基十二酸(MUA)接枝修飾在CuInS2/ZnS QDs表面，大大增加了CuInS2/ZnS QDs的水溶性。最后，他們又在該QDs表面鍵合大量葉酸分子，制備出具有靶向功能的量子點FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs。細(xì)胞實驗結(jié)果表明FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs對人卵巢畸胎瘤細(xì)胞(PA1 cells)表現(xiàn)出顯著的生物相容性，與商用熒光染料Hoechst相比具有更高的標(biāo)記穩(wěn)定性和更強的光穩(wěn)定性。為了進一步證FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs在體內(nèi)的成像效果，他們將B16F10(小鼠黑色素瘤細(xì)胞)選為小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞系，進行小鼠體內(nèi)熒光成像實驗。測試結(jié)果表明，F(xiàn)A-MUA-CuInS2/ZnS QDs在2 h內(nèi)具有較高的葉酸受體陽性腫瘤靶向能力。此外，F(xiàn)A-MUA-CuInS2/ZnS QDs可以深層穿透小鼠皮下黑色素瘤中且均勻分布。通過組織切片和血液學(xué)分析證明FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs在小鼠主要的器官和血液中未產(chǎn)生毒性效應(yīng)，如圖12所示。該工作為CuInS2QDs在生物體內(nèi)靶向成像和示蹤提供了新思路和方法。

圖12 第一步：MUA-CuInS2/ZnS QDs的制備、第二步：FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs的制備、第三步：生物體內(nèi)和體外的靶向成像Fig 12 Step 1: preparation of MUA-CuInS2/ZnS, Step2: preparation of FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs, Step3: targeted imaging in vivo and in vitro

目前，基于干細(xì)胞的修復(fù)和再生療法是當(dāng)今生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)行業(yè)最熱門的領(lǐng)域之一，而全面了解活體模型被移植干細(xì)胞的遷移，植入和再生能力對該領(lǐng)域的發(fā)展尤為重要。最近，Chetty等[81]利用所合成的NIR MSCs-CuInS2/ZnS QDs來標(biāo)記臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，標(biāo)記效率達98%。他們首先采用微波輔助法在6 min內(nèi)制備了以1-十二烷硫醇(1-DDT)為配體的 DDT-CuInS2/ZnS QDs，通過表面配體交換的方式將MUA接枝修飾在CuInS2/ZnS QDs表面，以增強CuInS2/ZnS QDs的水溶性。然后再在QDs表面標(biāo)記MSCs，提高QDs的生物相容性。體內(nèi)熒光跟蹤實驗表明，在患有肝損傷的小鼠尾靜脈注射MSCs-CuInS2/ZnS QDs后，經(jīng)2 h QDs逐漸聚集在受傷的肝臟中。同時，MSCs-CuInS2/ZnS QDs的再生潛力是通過肝細(xì)胞周圍的門靜脈，膽管和肝動脈組成的門道來確認(rèn)的。經(jīng)過激光掃描共聚焦顯微鏡以及組織病理學(xué)和血液學(xué)分析證實，MSCs-CuInS2/ZnS QDs移植后3天未觀察到明顯的炎癥、壞死或者凋亡。MUA-CuInS2/ZnS QDs的制備及其在生物體內(nèi)和體外的成像潛能如圖13所示。該研究提出了一種可在急性肝損傷動物模型中無創(chuàng)跟蹤移植臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的方法，為未來的圖像引導(dǎo)細(xì)胞療法提高了新思路。

圖13 MUA-CuInS2/ZnS QDs的制備及其生物體內(nèi)和體外的靶向成像Fig 13 Preparation of MUA-CuInS2/ZnS QDs and targeted imaging in vivo and in vitro

CuInS2QDs因其優(yōu)異的熒光性質(zhì)而被越來越多的應(yīng)用于生物體內(nèi)成像，但CuInS2QDs在基于熒光/光聲成像技術(shù)的多合一治療腫瘤方面的應(yīng)用報道較少。Liang等[82]首先合成一種核殼結(jié)構(gòu)CuInS2/ZnS QDs，然后將一種親水性大分子藥物膠束mPEG2000-DSPE接枝于量子點表面，形成富含藥物的大尺寸納米粒子CuInS2/ZnS NMs-80和小尺寸納米粒子CuInS2/ZnS NMs-25。最后將兩種 QDs與小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1 cells共孵育，探究其體外光療功效和細(xì)胞毒性，證實該QDs材料低的細(xì)胞毒性和良好的光療功效。接著，Liang等探究了CuInS2/ZnS NMs QDs在小鼠體內(nèi)MOST成像(顯微光學(xué)切片斷層成像)以及PTT / PDT協(xié)同治療效果。他們先將乳腺癌細(xì)胞注入小鼠尾靜脈使其在小鼠體內(nèi)形成腫瘤，隨后再注入CuInS2/ZnS NMs QDs，使其同時充當(dāng)“間諜衛(wèi)星”和“精密武器”的作用，在精確診斷的同時有效消除腫瘤。MOST成像結(jié)果表明，CuInS2/ZnS NMs QDs能夠清晰的顯示小鼠體內(nèi)腫瘤大小，且CuInS2/ZnS NMs-25比CuInS2/ZnS NMs-80具有更長的腫瘤保留時間、更高的腫瘤吸收率和更深的腫瘤穿透力。此外，該課題組還深入研究了CuInS2/ZnS NMs QDs光誘導(dǎo)腫瘤消融的能力，證實在660 nm的單激光照射下，CuInS2/ZnS NMs QDs可以同時提供光熱和光動力效應(yīng)，從而產(chǎn)生了有效的協(xié)同光療功效。因此，CuInS2/ZnS NMs QDs作為多功能納米藥物不僅具有很高的治療功效，且可通過成像技術(shù)無創(chuàng)檢測腫瘤部位的分布情況，具有作為一種精確治療癌癥納米藥物的巨大潛力。圖14是CuInS2/ZnS NMs在熒光/光聲成像技術(shù)的“多合一”治療腫瘤方面的應(yīng)用示意圖。

圖14 CuInS2/ZnS NMs用作治療腫瘤納米藥物Fig 14 CuInS2/ZnS NMs are used as nanomedicine for the treatment of tumors Phototherapy

綜上所述，CuInS2QDs因其優(yōu)異的發(fā)光性能和近紅外熒光強大的組織穿透力優(yōu)勢，在生物體內(nèi)示蹤、診斷和治療等方面發(fā)揮越來越重要的作用，漸漸成為生物成像及醫(yī)學(xué)診療的明星材料。

3 結(jié) 語

綜上所述，QDs因其特殊的光、電、磁學(xué)性質(zhì)而受到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。其中CuInS2三元QDs因其不含毒重金屬元素且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，被視為一種綠色無毒的環(huán)保型納米光學(xué)材料，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。一方面，基于CuInS2QDs熒光對某種特定生物分子的高靈敏響應(yīng)性，而被廣泛應(yīng)用于生物分子的定量分析檢測中。另一方面，基于CuInS2QDs熒光大的斯托克斯位移，長的熒光壽命以及近紅外發(fā)射帶來強的組織穿透能力，在生物成像(體內(nèi)和體外)領(lǐng)域備受關(guān)注，并發(fā)揮越來越重要的作用。

迄今為止，雖然研究者們已在CuInS2QDs的生物功能化修飾和應(yīng)用方面做出了很大的努力，也取得了較為理想的成果，但是要滿足生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用要求，還有很長的路要走。例如，目前在提高水溶性CuInS2QDs的PLQY以及更深層次的醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究遠遠不夠，尤其是在生物分子定量檢測和生物成像時，如何在實現(xiàn)優(yōu)異水溶性的同時保留材料原有高的發(fā)光效率等。因此， 如何通過水相合成法或在油溶性CuInS2QDs表面有效進行功能化修飾以提高水溶性和生物相容性，最終制備出高熒光效率及發(fā)光覆蓋近紅外區(qū)域水溶性CuInS2QDs仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。