陳勇江 王金榮* 喬漢楨 蘇蘭利 唐桂芬 黃 進(jìn) 趙銀麗 高溫婷

(1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450011)

溫度、濕度、空氣和飼糧的改變會(huì)引起動(dòng)物應(yīng)激，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起動(dòng)物腸功能障礙，導(dǎo)致進(jìn)食行為異?；蚰c絨毛損傷等腸道問題，通常表現(xiàn)為腹瀉、采食量下降和死亡率升高等[1]。腸道損傷在動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中持續(xù)發(fā)生，預(yù)防和修復(fù)腸道損傷是提高養(yǎng)殖水平、保證養(yǎng)殖效益的重要措施之一。當(dāng)腸道發(fā)生損傷時(shí)，修復(fù)就是恢復(fù)腸道健康的首要策略，除蛋氨酸和精氨酸等功能性氨基酸外，一些益生菌、益生元、微量元素和植物提取物也都有修復(fù)腸道、降低腹瀉率的功能，可以有效地提高動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)報(bào)酬，但是益生元不被機(jī)體吸收，相比益生菌具有更穩(wěn)定的特點(diǎn)[2-3]。王麗[4]發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以有效地改善糖尿病大鼠的氧化損傷，降低大鼠血清中的超氧化物歧化酶(SOD)活性，提高腎臟中的丙二醛(MDA)含量，可以起到清除自由基的效果，表明殼寡糖可以在一定程度上修復(fù)糖尿病模型大鼠氧化損傷的腎臟。馬寧等[5]利用益生菌乳酸菌和功能性寡糖的混合微生態(tài)制劑處理腸道受損小鼠，功能性制劑可以有效地改善腸道菌群，增加腸道平滑肌的收縮功能。同樣，段永艷[6]在低溫應(yīng)激羅非魚飼料中補(bǔ)充L-精氨酸和寡糖，不但可以提高羅非魚在應(yīng)激情況下的免疫能力，同樣還會(huì)提高羅非魚的抗氧化能力和基因修復(fù)能力。吳士[7]也發(fā)現(xiàn)魔芋甘露低聚糖和益生菌的混合使用，可以有效降低腸上皮細(xì)胞損傷所產(chǎn)生的炎癥因子，降低細(xì)胞的損傷程度。前期研究表明，不同濃度的阿司匹林(ASA)可以導(dǎo)致不同程度的腸道損傷，而甘露寡糖(MOS)濃度在600 mg/kg時(shí)，效果最好，低于該濃度效果較差，高于該濃度效果與該濃度效果一致，所以選擇600 mg/kg作為修復(fù)濃度[8]。MOS作為一種功能性寡糖，可以通過調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群、提高機(jī)體免疫能力和維持上皮屏障功能完整性能等有效地提高動(dòng)物的生長性能[9-10]。但對(duì)于單獨(dú)使用MOS對(duì)腸道損傷進(jìn)行修復(fù)的研究相對(duì)較少，通常采用MOS和益生菌的混合添加，或者是MOS和其他益生元共同使用來進(jìn)行研究。因此，本研究擬采用600 mg/kg的MOS來對(duì)不同濃度ASA所導(dǎo)致的腸道損傷進(jìn)行修復(fù)，探討MOS對(duì)大鼠腸道損傷修復(fù)的作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

受試物：ASA(河南某生物科技有限公司，98%)；MOS(某酵母股份有限公司，PW120)。

試驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠購于河南省試驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(豫)2017—0001]。

主要設(shè)備儀器：切片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司，YD-202A)、高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，2018113100)、正置倒置一體熒光顯微鏡(美國Echo公司，RVL-100-G)、酶標(biāo)儀(帝肯奧地利有限責(zé)任公司，1711012817)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，36只6周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重為150～180 g，隨機(jī)分為6組，每組6個(gè)重復(fù)，即空白組、模型組、MOS組、ASA1組、ASA2組和ASA3組，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，飼養(yǎng)過程中每天更換飲水，每2 d更換1次墊料。適應(yīng)期1周，正式試驗(yàn)3周。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 生長性能和臟器指數(shù)測定

正式試驗(yàn)開始前對(duì)大鼠進(jìn)行稱重記錄初體重，試驗(yàn)期間每天定時(shí)對(duì)大鼠的飼糧重和體重進(jìn)行稱重記錄，試驗(yàn)結(jié)束前1天禁食，自由飲水，解剖前稱量記錄末體重，計(jì)算體增重(BWG)、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)。曲頸處死大鼠后進(jìn)行解剖，對(duì)臟器進(jìn)行稱重記錄。計(jì)算臟器指數(shù)，公式如下：

臟器指數(shù)(VI，%)=[臟器重(g)/ 體重(g)]×100。

1.3.2 血清生化指標(biāo)測定

采用摘眼球方法對(duì)大鼠取血，血液在室溫下自然凝固，3 000 r/min下離心20 min，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?duì)大鼠的血清溶菌酶(LZM)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、髓過氧化物酶(MPO)活性及白細(xì)胞介素-2(IL-2)、D-乳酸(D-Lac)含量進(jìn)行檢測。具體操作方法嚴(yán)格按照上海鑫樂生物科技有限公司試劑盒說明書進(jìn)行，最后在酶標(biāo)儀450 nm的波長下測量吸光度。

1.3.3 腸道組織學(xué)的觀察與測定

取大鼠在空腸中段取5 cm，用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行清洗，后在10%福爾馬林中室溫下保存，將腸段用流動(dòng)水沖洗12 h，用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，經(jīng)過石蠟包埋，制作切片，利用蘇木精-伊紅染色后，用顯微鏡觀察腸道絨毛，測量絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度比值(VH/CD)。

1.3.4 腸道黏液量的測定

在腸道距幽門10 cm處取5 cm，PBS中保存；將腸道勻漿后加入1 mL的PBS溶液，成懸浮狀。在4 ℃時(shí)，以15 000 r/min離心15 min。加入高碘酸(0.1%，100 μL)在37 ℃下孵育2 h，加入100 μL希夫試劑，室溫下孵育30 min。在紫外可見分光光度計(jì)555 nm的波長下測量吸光度[11]。

1.3.5 腸道黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量測定

截取5 cm靠近十二指腸的空腸處的腸組織，將腸段在紗布上剪開鋪平，用玻璃片刮取腸黏膜置于離心管中，-80 ℃存放，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測黏膜sIgA含量，按照sIgA試劑盒(上海鑫樂生物科技有限公司)說明書進(jìn)行試驗(yàn)操作，最后在酶標(biāo)儀450 nm的波長下測量吸光度[12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 MOS對(duì)大鼠生長性能和臟器指數(shù)的影響

由表2可知，與空白組相比，模型組的生長性能均有下降趨勢，大鼠的BWG、ADG、ADFI和FCR分別降低了14.67%、31.22%、9.34%和23.81%(P>0.05)。與模型組相比，MOS可以提高ASA3組大鼠的BWG、ADFI和FCR，分別提高了7.97%、2.13%和6.25%(P>0.05)。ASA1和ASA2組的生長性能均低于空白組，但是差異不顯著(P>0.05)。

表2 MOS對(duì)大鼠生長性能影響

由表3可知，與空白組相比，模型組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別降低了9.70%、9.10%和15.79%(P>0.05)，MOS組肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)分別升高了1.39%和9.09%(P>0.05)。與模型組相比，ASA3組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別升高了1.02%、5.00%和6.25%(P>0.05)。

表3 MOS對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響

2.2 MOS對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，模型組血清LZM和T-SOD活性顯著降低(P<0.05)，分別降低了45.22%和46.14%，而血清MPO活性及IL-2和D-Lac含量顯著增加(P<0.05)，分別提高了106.60%、38.80%、137.93%；ASA1組血清MPO活性和D-Lac含量分別提高了39.82%和12.58%(P<0.05)，但I(xiàn)L-2含量及LZM和T-SOD活性不存在顯著差異(P>0.05)；ASA2組血清LZM、MPO和T-SOD活性和D-Lac含量存在顯著差異(P<0.05)。與模型組相比，ASA3組血清MPO活性和IL-2、D-Lac含量分別降低了17.80%、13.21%、2.90%，LZM和T-SOD活性分別提高了5.70%和17.69%，但只有T-SOD達(dá)到顯著差異(P<0.05)。

表4 MOS對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.3 MOS對(duì)大鼠腸道發(fā)育的影響

由表5可知，與空白組相比，模型組VH、CD與VH/CD分別降低了24.27%、9.66%和14.98%，但只有VH和VH/CD達(dá)到顯著水平(P<0.05)；而MOS組的VH和CD分別增加了2.62%和9.22%(P>0.05)；ASA1和ASA2組的VH均有一定程度的降低，分別降低了9.88%和14.56%(P<0.05)，而CD和VH/CD與空白組相比均無顯著差異(P>0.05)。與模型組相比較，ASA3組VH和VH/CD分別提高了2.79%和10.85%，VH/CD達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表5 MOS對(duì)大鼠腸道發(fā)育的影響

2.4 MOS對(duì)大鼠腸道黏液量和黏膜sIgA含量的影響

由表6可知，與空白組相比，模型組黏膜sIgA含量減少了30.32%(P<0.05)，ASA1組黏膜sIgA含量與空白組不存在顯著差異(P>0.05)，ASA2組和ASA3組分別降低了7.39%和12.50%(P<0.05)；與模型組相比，ASA3組升高了25.59%(P<0.05)；與空白組相比，模型組黏液量降低了12.42%，其他ASA組相對(duì)于空白組均有一定程度的降低，但是都不存在顯著差異(P>0.05)。

表6 MOS對(duì)大鼠黏液量和黏膜sIgA含量的影響

3 討 論

很多研究證明了MOS具有益生作用，不僅可以提高養(yǎng)殖動(dòng)物的生長性能和免疫能力，還可以改善動(dòng)物的腸道形態(tài)和腸道菌群免疫能力[13-14]。但是關(guān)于生長性能的試驗(yàn)結(jié)果卻有所不同。熊阿玲等[15]在不同生長階段肉雞的飼糧中添加0.3～0.6 g/kg的MOS，可以提高1～42日齡的肉雞的ADG和ADFI。而與本試驗(yàn)結(jié)果相同的是Biggs等[16]在肉雞的飼糧中補(bǔ)充MOS，并不會(huì)影響生長肉雞的生長性能。本試驗(yàn)大鼠的ADG、ADFI和FCR并沒有因?yàn)樘砑覯OS而受到影響。肝臟、脾臟和胸腺作為動(dòng)物的免疫器官，這些免疫器官的指數(shù)大小可以用來評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)[17]。本試驗(yàn)中，ASA1、ASA2和ASA3組的肝脾指數(shù)相較于模型組都有一定升高的趨勢，這一點(diǎn)也與沈文康等[18]在小鼠的試驗(yàn)中得到的結(jié)果相同。ASA3組的肝臟指數(shù)與模型組相比都出現(xiàn)了一定幅度的上升，但是效果不明顯。這也表明了灌服600 mg/kg的MOS對(duì)ASA損傷大鼠的生長性能和免疫能力的修復(fù)效果不明顯。

大鼠血清中的IL-2含量和LZM活性也可以反映大鼠的免疫能力，而血清MPO與T-SOD活性可以反映ASA致大鼠損傷機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，血清D-Lac含量則可以反映腸道的通透性。本試驗(yàn)中的模型組大鼠血清中的IL-2含量升高了38.8%，LZM活性降低了45.22%，后經(jīng)過600 mg/kg的MOS處理后，IL-2含量降低了13.21%，LZM活性提高了5.70%，雖然有所改善，但是不存在顯著差異。另外經(jīng)過50和100 mg/kg ASA損傷的大鼠血清IL-2含量恢復(fù)到了一個(gè)正常的范圍內(nèi)，與IL-2含量變化不同的是，ASA3組(200 mg/kg ASA損傷)的血清T-SOD活性比模型組高了17.69%，出現(xiàn)顯著差異，但是ASA3組的活性仍低于空白組，且存在顯著差異。SOD活性的提高表明MOS可以有效地提高大鼠的抗氧化能力，降低大鼠氧化損傷造成的危害。郭志勛等[19]在魚飼料中添加益生元低聚糖，魚血清中的LZM和SOD活性都有一個(gè)很明顯的提升作用。同樣，梁金逢等[20]的試驗(yàn)表明，MOS配合復(fù)合益生菌可以提高育成期牛血清中的SOD的活性，提高抗氧化能力。血清中D-Lac含量的升高表明腸道損傷導(dǎo)致了腸道黏膜屏障功能受損，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的代謝廢物透過腸屏障進(jìn)入血液循環(huán)。劉靜波等[21]在斷奶仔豬的腸道屏障試驗(yàn)結(jié)果中指出，攝入短鏈果寡糖可以顯著降低仔豬血清中D-Lac含量，保護(hù)腸道屏障功能。而本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加MOS不會(huì)對(duì)大鼠的腸道通透性有影響，而且MOS對(duì)200 mg/kg ASA損傷大鼠的腸道通透性并沒有很明顯的修復(fù)作用，對(duì)于50、100 mg/kg ASA所導(dǎo)致的腸道損傷雖然有一定的修復(fù)趨勢，但并沒有達(dá)到損傷前的健康水平，表明灌服600 mg/kg的MOS對(duì)大鼠腸道輕微損傷有修復(fù)的作用。

腸道形態(tài)直接關(guān)系到動(dòng)物的生長性能，良好的腸道形態(tài)可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。VH可以體現(xiàn)出動(dòng)物腸道與營養(yǎng)物質(zhì)接觸面積，其值越高表明動(dòng)物的吸收能力越強(qiáng)，CD與腸上皮生長速率有關(guān)，VH/CD反映出腸道的功能狀態(tài)[22]。本試驗(yàn)中，模型組的VH、CD與VH/CD都出現(xiàn)下降趨勢，表明腸道損傷動(dòng)物的腸道形態(tài)遭到了破壞，模型組的VH、VH/CD較空白組分別降低了24.27%和14.98%。本試驗(yàn)與Galdino等[23]的研究結(jié)果是一致的，添加寡糖可以改善損傷動(dòng)物的腸道形態(tài)。同樣的，Hagiographa等[24]在鵪鶉的飼糧中添加MOS，可以顯著提高空腸VH。本試驗(yàn)中，在50、100和200 mg/kg ASA導(dǎo)致的腸道損傷動(dòng)物飼糧中補(bǔ)充MOS，3個(gè)試驗(yàn)組的VH都沒有出現(xiàn)顯著變化，但是ASA3組的VH/CD與模型組相比上升了10.85%，達(dá)到了與空白組相同的水平，ASA1和ASA2組的CD都與空白組無顯著差異，處于健康狀態(tài)。這表明MOS對(duì)腸道損傷大鼠的腸道形態(tài)具有一定的修復(fù)作用。

腸道作為機(jī)體最大的免疫器官和消化外界營養(yǎng)物質(zhì)的場所，腸道免疫屏障也是至關(guān)重要的，而黏液和免疫蛋白是維持腸道屏障功能健康的主要成分[25-26]。喻振等[27]在5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的大鼠腸黏膜損傷模型中，模型組的大鼠腸道sIgA含量顯著降低。本試驗(yàn)中ASA2和ASA3組的黏膜sIgA含量變化可以看出后添加MOS可以提高免疫蛋白的含量，但是并不會(huì)使sIgA含量恢復(fù)到正常水平，而ASA1組的黏膜sIgA含量可以恢復(fù)到健康狀態(tài)。大鼠sIgA含量的增加表明MOS可以降低腸道內(nèi)的細(xì)菌和抗原等物質(zhì)對(duì)腸道的損傷，修復(fù)改善了腸黏膜損傷導(dǎo)致的sIgA含量減少的情況。同樣，本試驗(yàn)中的所有試驗(yàn)組腸道黏液量都不存在顯著差異，MOS并不會(huì)減少大鼠腸道黏液量的分泌，表明腸道損傷的大鼠，后期補(bǔ)充MOS雖然可以提高大鼠腸道黏膜免疫，但對(duì)腸道損傷的修復(fù)沒有明顯作用。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，大鼠灌服600 mg/kg MOS對(duì)不同劑量ASA導(dǎo)致的大鼠腸道損傷修復(fù)作用不同。MOS可以提高ASA1組大鼠血清IL-2含量、LZM活性及黏膜sIgA含量，顯著提高ASA2組血清中的IL-2含量。在腸道形態(tài)方面，600 mg/kg的MOS可以有效提高不同劑量ASA損傷大鼠VH/CD，表明腸道損傷的大鼠經(jīng)灌服MOS后，對(duì)ASA導(dǎo)致的大鼠腸道損傷具有一定的修復(fù)作用。