高 鐸 馬峰濤 單 強 金宇航 李洪洋 常美楠 孫 鵬

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193)

熱應(yīng)激影響奶牛健康，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)有多種負面影響[1-2]。熱應(yīng)激不僅會降低產(chǎn)奶量[3]、引起奶牛肝臟功能障礙[4]、引起全身炎癥反應(yīng)[5]、降低免疫功能[6]，還會誘發(fā)氧化應(yīng)激[7]，導致奶牛代謝紊亂[8]、細胞損傷[9]以及能量負平衡等[10]。因此，奶牛需要通過增加碳水化合物、脂類和蛋白質(zhì)的代謝來提供能量。雖然風扇、噴淋系統(tǒng)等物理降溫方式已被廣泛采用[11]，但熱應(yīng)激對于奶牛養(yǎng)殖業(yè)仍是一個巨大挑戰(zhàn)。因此，有必要采取其他措施配合物理降溫從而緩解奶牛熱應(yīng)激。中草藥添加劑因其無耐藥性和多功能性的優(yōu)點受到人們的青睞，目前在畜牧業(yè)中已得到大量應(yīng)用[12-13]。金銀花作為一味傳統(tǒng)中草藥，自古就被廣泛使用。金銀花含有多種化學成分，如綠原酸、黃酮、皂苷和環(huán)烯醚萜等[14-15]?；谌撕痛笫蟮闹T多研究表明，金銀花提取物(Lonicerajaponicaextract，LJE)具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和保護肝臟等多種藥理活性[16-18]。本實驗室之前的研究表明，金銀花提取物可以緩解熱應(yīng)激對奶牛的負面影響，并且最佳飼喂劑量為28 g/d[19]。然而，金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛肝臟代謝的影響仍不清楚。轉(zhuǎn)錄組是連接遺傳信息與生物功能之間的重要橋梁。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)方法已被廣泛應(yīng)用，從基因表達的水平來探索動物表型的分子機制[20-21]，可以揭示天然化合物在動物體內(nèi)發(fā)揮的生物學功能[22]。因此，本試驗旨在研究金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛生產(chǎn)性能、抗氧化性能、內(nèi)分泌和免疫功能的影響，并通過肝臟轉(zhuǎn)錄組分析揭示金銀花提取物緩解泌乳奶牛熱應(yīng)激的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗時間

試驗于2019年6—9月在河北省新樂市君源牧業(yè)有限公司開展。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選取6頭泌乳中期荷斯坦奶牛，按照胎次[(1.9±0.5)胎]、產(chǎn)奶量[(28.0±1.0) kg/d]和泌乳天數(shù)[(85±5) d]隨機分為2組，每組3頭牛。對照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，不添加金銀花提取物；金銀花提取物組(LJE組)在基礎(chǔ)飼糧中添加28 g/d的金銀花提取物。金銀花提取物的主要有效成分為綠原酸，含量為10%。根據(jù)NRC(2001)的營養(yǎng)需求配制基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。每天飼喂3次(06：30、13：30和20：30)，自由飲水。試驗期共10周，包括預試期2周，正試期8周。預試期奶牛飼養(yǎng)于熱應(yīng)激環(huán)境，平均溫濕度指數(shù)(THI)為78.8，平均環(huán)境溫度為29.0 ℃。正試期開始前1周，奶牛平均直腸溫度(RT)為39.50 ℃，平均呼吸頻率(RR)為82次/min。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content棉籽粕 Whole cottonseed3.08酵母培養(yǎng)物 Yeast culture1.23磷酸氫鈣 CaHPO4 0.45碳酸氫鈉 NaHCO30.70石粉 Limestone1.03氯化鈉 NaCl0.45氧化鎂 MgO0.12碳酸鉀 K2CO30.16脂肪粉 Fat powder1.11預混料 Premix1)1.32合計 Total100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)粗脂肪 EE5.07粗蛋白質(zhì) CP15.82中性洗滌纖維 NDF27.52酸性洗滌纖維 ADF19.41鈣 Ca0.81磷 P0.44粗灰分 Ash7.84泌乳凈能 NEL/(MJ/kg)6.26

1.3 樣品采集和指標測定

1.3.1 THI、直腸溫度和呼吸頻率

使用溫濕度計測定環(huán)境溫度和相對濕度，每天記錄3次(06：00、14：00、22：00)。通過公式計算THI[23]：

THI=(1.8×T+32)-[(0.55-0.005 5×RH)×(1.8×T-26)]。

式中：T為溫度(℃)；RH為相對濕度(%)。

直腸溫度使用水銀溫度計測定，呼吸頻率通過目測每分鐘胸腹運動次數(shù)來測定。直腸溫度和呼吸頻率每日測定3次(07：30、14：30、21：30)。

1.3.2 干物質(zhì)采食量(DMI)和飼糧營養(yǎng)成分

干物質(zhì)采食量通過從總干物質(zhì)采食量中減去剩料量來計算。每周連續(xù)3 d收集飼糧樣本，然后用于測定干物質(zhì)(DM)[AOAC(2005)，方法930.15]、粗脂肪(EE)[AOAC(2003)，方法4.5.05]、粗蛋白質(zhì)(CP)[AOAC(2000)，方法976.05]、鈣(Ca)[AOAC(1990)，方法985.35]和磷(P)[AOAC(1990)，方法986.24]含量。采用Van Soest等[24]的方法測定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量。

1.3.3 乳成分

每天擠奶3次(05：30、12：30、19：30)，每天記錄每頭牛的產(chǎn)奶量，每周采集1次奶樣，并按早、中、晚=4∶3∶3的比例混合奶樣，奶樣加防腐劑，4 ℃保存以供進一步分析。通過乳成分分析測定儀(Foss MilkoScan 2000)測定乳蛋白率、乳脂率、乳糖率以及非脂乳固體、總固形物含量。

1.3.4 血清生化指標

試驗結(jié)束時(第57天，06：00)，于晨飼前使用真空采血管進行尾根靜脈采血。3 000×g、4 ℃條件下離心15 min制備血清，-20 ℃保存。

血清葡萄糖(glucose，GLU)含量采用全自動生化分析儀測定[25]。血清胰高血糖素(glucagon，GC)含量采用放射免疫法測定。血清總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用試劑盒測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。血清胰島素(insulin，INS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定，試劑盒購于美國Bethyl公司。

1.3.5 總RNA提取、文庫構(gòu)建和測序

肝臟樣本采集于奶牛右側(cè)髖骨結(jié)節(jié)和肩關(guān)節(jié)連線的第11～12根肋骨之間。手術(shù)部位剃毛消毒后，皮下注射3～4 mL鹽酸利多卡因(2%溶液)進行局部麻醉，使用無菌手術(shù)刀切開1.5 cm的切口，用取樣槍在脊柱下方約15 cm處進行肝臟組織取樣。肝臟組織被取出后立即放入RNAlater溶液中，以保護RNA的完整性，隨后置于液氮中保存。

使用TRIzol試劑從肝臟組織中提取總RNA。DNA酶處理消化基因組DNA，再用苯酚-氯仿萃取法去除DNA酶。檢測RNA濃度和完整性，隨后用Oligo(dT)磁珠富集總RNA中具有poly A結(jié)構(gòu)的mRNA，斷裂mRNA為200～300 bp的短片段。以mRNA為模板，通過6堿基隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成第1鏈cDNA，以第1鏈cDNA為模板合成第2鏈cDNA。文庫構(gòu)建完成后，利用PCR擴增文庫片段，然后根據(jù)片段大小進行選擇，得到450 bp的文庫，測定總庫濃度和有效庫濃度。樣品經(jīng)RNA提取、純化和文庫構(gòu)建后，基于Illumina測序平臺進行二代測序。

1.3.6 序列比對及差異表達分析

通過去除poly-N序列、序列接頭和無效序列來獲得高質(zhì)量的Clean Reads[26]。使用HISAT2軟件(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)將獲得的Clean Reads與牛參考基因組(http://asia.ensembl.org/Bos_taurus/Info/Annotation)進行比對[20]。使用HTSeq軟件分析每個基因的表達值，以衡量基因表達水平[27]。在此基礎(chǔ)上，對樣品進行差異表達分析和富集分析。使用DESeq軟件包進行差異表達分析[28]，使用Blast2go進行基因本體論(GO)富集分析[29]。利用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫分析差異表達基因在不同通路的富集情況[30]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

產(chǎn)奶量、乳成分、干物質(zhì)采食量、直腸溫度、呼吸頻率和血清生化指標采用SAS 9.4的UNIVARIATE程序檢驗正態(tài)性。所有數(shù)據(jù)均采用MIXED模塊進行統(tǒng)計學檢驗。其中，試驗處理和時間為固定因素，試驗牛為隨機因素。采用Tukey’s多重比較評價組間差異。P<0.05代表差異顯著，0.05≤P<0.10代表有差異顯著趨勢。

對于差異表達分析，使用Benjamini和Hochberg法得到錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正P值，以控制FDR。P<0.05且差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>1.200或<0.667的基因被視為差異表達基因。在GO和KEGG通路富集分析中，F(xiàn)DR<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 THI、呼吸頻率和直腸溫度

在06：00、14：00和22：00時，牛舍的日平均環(huán)境溫度分別為23.6、31.0和25.7 ℃。如圖1所示，試驗期間平均THI>72。

圖1 THI變化曲線

由表2可見，與CON組相比，飼糧中添加金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛呼吸頻率無顯著影響(P>0.05)，但可顯著降低直腸溫度(P<0.05)。

表2 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛直腸溫度和呼吸頻率的影響

2.2 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛生產(chǎn)性能和乳成分的影響

由表3可見，與CON組相比，飼糧中添加金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛的干物質(zhì)采食量、產(chǎn)奶量、乳蛋白率、乳脂率、乳糖率以及非脂乳固體、總固形物含量均無顯著影響(P>0.05)。

表3 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛生產(chǎn)性能和乳成分的影響

2.3 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛血清生化指標的影響

由表4可見，與CON組相比，飼糧中添加金銀花提取物可顯著提高熱應(yīng)激奶牛血清IL-4和IgG含量(P<0.05)，但對血清IgA、IgM、IL-2、TNF-α和MDA含量無顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加金銀花提取物可顯著提高熱應(yīng)激奶牛血清T-AOC和GSH-Px活性(P<0.05)，但對血清SOD活性和MDA含量無顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加金銀花提取物可顯著提高熱應(yīng)激奶牛血清GLU和GC含量(P<0.05)，但對血清INS含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛血清生化指標的影響

2.4 差異表達分析

差異表達分析結(jié)果顯示，CON組和LJE組之間有17 668個差異表達基因。以FC>1.200或FC<0.667且P<0.05為差異顯著標準，LJE組和CON組奶牛肝臟中共發(fā)現(xiàn)253個差異表達基因，其中127個上調(diào)基因，126個下調(diào)基因。表5列出了顯著富集到相關(guān)通路和代謝過程的典型差異表達基因信息(P<0.05)。

表5 典型差異表達基因信息

續(xù)表5基因符號Gene symbol基因名稱Gene name差異倍數(shù)FCP值P-valueDLL4delta樣典型Notch配體4 delta like canonical Notch ligand 41.610.017SLC51β溶質(zhì)載體家族51 β亞基 solute carrier family 51 beta subunit1.530.018PC丙酮酸羧化酶 pyruvate carboxylase0.640.006DSP橋粒斑蛋白 desmoplakin0.640.004PCDH1原鈣黏附因子1 protocadherin 10.630.005EPM2AIP1EPM2A相互作用蛋白1 EPM2A interacting protein 10.620.029SLC5A12溶質(zhì)載體家族5成員12 solute carrier family 5 member 120.540.046VNN1泛酰疏基乙胺酶1 vanin 10.47<0.001SLC5A1溶質(zhì)載體家族5成員1 solute carrier family 5 member 10.44<0.001

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

由圖2可見，圖中列出了FDR<0.05的GO細胞成分過程、GO生物學過程和GO分子功能過程以及碳水化合物代謝和趨化因子相關(guān)過程(P<0.05)。在細胞成分類別中，差異表達基因主要與質(zhì)膜類別有關(guān)(FDR<0.05)，如質(zhì)膜部分、質(zhì)膜、質(zhì)膜內(nèi)在成分和質(zhì)膜整體成分。差異表達基因主要包括溶質(zhì)載體家族2成員8(solute carrier family 2 member 8，SLC2A8)、溶質(zhì)載體家族5成員1(solute carrier family 5 member 1，SLC5A1)、溶質(zhì)載體家族5成員12(solute carrier family 5 member 12，SLC5A12)、溶質(zhì)載體家族7成員5(solute carrier family 7 member 5，SLC7A5)、溶質(zhì)載體家族7成員8(solute carrier family 7 member 8，SLC7A8)、溶質(zhì)載體家族51β亞基(solute carrier family 51 beta subunit，SLC51β)、溶質(zhì)載體家族29成員2(solute carrier family 29 member 2，SLC29A2)、分泌載體相關(guān)膜蛋白5(secretory carrier-associated membrane protein 5，SCAMP5)、細胞附著蛋白4(cytohesin 4，CYTH4)、跨膜蛋白63C(transmembrane protein 63C，TMEM63C)和干擾素誘導跨膜蛋白5(interferon induced transmembrane protein，IFITM5)。在生物學過程中，大部分差異表達基因[細胞間黏附分子3(intercellular adhesion molecule 3，ICAM3)、骨髓基質(zhì)細胞抗原1(bone marrow stromal cell antigen 1，BST1)、柯薩奇病毒腺病毒受體(coxsackievirus adenovirus receptor，CXADR)、原鈣黏附因子1(protocadherin 1，PCDH1)、整合素α9(integrin alpha-9，ITGA9)、橋粒斑蛋白(desmoplakin，DSP)、Thy-1細胞表面抗原(Thy-1 cell surface antigen，THY1)]被富集到細胞黏附類別(FDR<0.05)，包括細胞黏附、細胞黏附調(diào)節(jié)和細胞-細胞黏附。差異表達基因也顯著富集到相關(guān)的免疫過程，包括免疫系統(tǒng)過程、免疫應(yīng)答、免疫效應(yīng)過程和白細胞活化過程(FDR<0.05)。部分差異表達基因與炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)(P<0.05)，包括慢性炎癥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)對損傷的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)。差異表達基因主要包括重組人含V-set和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白4(V-set and immunoglobulin domain containing 4，VSIG4)、唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素10(sialic acid binding Ig like lectin 10，SIGLEC10)、堿性亮氨酸拉鏈ATF樣轉(zhuǎn)錄因子3(basic leucine zipper ATF-like transcription factor 3，BATF3)、S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8，S100A8)、BST1、肌營養(yǎng)不良相關(guān)蛋白(dysferlin，DYSF)和delta樣典型Notch配體4(delta like canonical Notch ligand 4，DLL4)。此外，富集到的生物學過程也與代謝有關(guān)，如泛酸代謝過程和碳水化合物代謝過程(FDR<0.05)。對于分子功能類別，只有泛酰巰基乙胺水解酶活性過程FDR<0.05。值得注意的是，一些差異表達基因，如趨化因子C-C-基元受體1(chemokine C-C motif receptor 1，CCR1)和非典型性趨化因子受體4(atypical chemokine receptor 4，ACKR4)還參與了C-C趨化因子過程，包括C-C趨化因子受體活性、C-C趨化因子結(jié)合、趨化因子配體5結(jié)合和趨化因子配體7結(jié)合等過程(P<0.05)。生物信息學分析也顯示，一些差異表達基因[丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)、EPM2A相互作用蛋白1(EPM2A interacting protein 1，EPM2AIP1)、6-磷酸果糖激酶2，6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase，6-biphosphatase 3，PFKFB3)、磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase，PGAM)]還與葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性和丙酮酸羧化酶活性有關(guān)(P<0.05)。通過KEGG通路富集分析，差異表達基因主要富集在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，泛酸鹽和輔酶A生物合成，Notch信號通路，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路以及鈣信號通路中(P<0.05)。

cell adhesion：細胞黏附；biological adhesion：生物黏附；plasma membrane part：質(zhì)膜部分；cell periphery：細胞周邊；plasma membrane：質(zhì)膜；intrinsic component of plasma membrane：質(zhì)膜的固有成分；cell motility：細胞運動；localization of cell：細胞定位；immune system process：免疫系統(tǒng)過程；regulation of anion channel activity：陰離子通道活性的調(diào)節(jié)；immune response：免疫反應(yīng)；immune effector process：免疫效應(yīng)的過程；regulation of cell adhesion：細胞黏附調(diào)節(jié)；integral component of plasma membrane：質(zhì)膜的組成部分；second messenger mediated signaling：第二信使介導信號；cell migration：細胞遷移；cell-cell adhesion：細胞-細胞黏附；locomotion：運動；leukocyte activation：白細胞激活；pantothenate metabolic process：泛酸鹽代謝過程；positive regulation of anion channel activity：陰離子通道活性的正調(diào)控；positive regulation of anion transmembrane transport：負離子跨膜轉(zhuǎn)運的正調(diào)控；pantetheine hydrolase activity：泛酰硫氫乙胺水解酶活性；regulation of locomotion：運動調(diào)節(jié)；cell differentiation involved in embryonic placenta development：參與胚胎胎盤發(fā)育的細胞分化；cell activation：細胞激活；carbohydrate metabolic process：碳水化合物代謝過程；positive regulation of heterotypic cell-cell adhesion：異型細胞黏附的正向調(diào)節(jié)；pyruvate carboxylase activity：丙酮酸羧化酶活性；glucose transmembrane transporter activity：葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運活性；C-C chemokine receptor activity：C-C趨化因子受體活性；C-C chemokine binding：C-C趨化因子結(jié)合；carbohydrate binding：碳水化合物結(jié)合；chemokine receptor activity：趨化因子受體的活動；chemokine ligand 7 binding：趨化因子配體7的結(jié)合；chemokine ligand 5 binding：趨化因子配體5的結(jié)合；chemokine binding：趨化因子結(jié)合。

3 討 論

3.1 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛直腸溫度和呼吸頻率的影響

當THI大于68時，奶牛就有可能出現(xiàn)熱應(yīng)激[31]。呼吸頻率和直腸溫度是衡量奶牛熱應(yīng)激的重要指標，當呼吸頻率大于60次/min或直腸溫度大于39.2 ℃時，奶牛就有可能遭受熱應(yīng)激[32]。即使是直腸溫度輕微的升高，也會對組織、器官和內(nèi)分泌功能產(chǎn)生顯著影響，導致生長、泌乳和繁殖性能有所下降[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗期間的日平均THI大于72，CON組奶牛的呼吸頻率和直腸溫度分別為39.68 ℃和85.82次/min，表明奶牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加金銀花提取物雖然未顯著影響奶牛呼吸頻率，但顯著降低了直腸溫度，說明金銀花提取物可以有效降低奶牛的體溫，有利于緩解熱應(yīng)激的負面影響。

3.2 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛免疫功能的影響

檢測和分析血液炎性細胞因子如IL-2、IL-4、TNF-α等有助于了解奶牛的炎癥反應(yīng)狀況[34-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加金銀花提取物可以通過提高血清IL-4和IgG含量，進而改善熱應(yīng)激奶牛的免疫功能[37-38]。肝臟轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，許多差異表達基因與免疫反應(yīng)相關(guān)，如免疫系統(tǒng)過程、免疫反應(yīng)、免疫效應(yīng)過程、白細胞激活和炎癥反應(yīng)。上調(diào)的基因如VSIG4、SIGLEC10、CCR1、BATF3、S100A8、BST1、DYSF、ACKR4和DLL4在減輕肝臟炎癥、調(diào)節(jié)中性粒細胞遷移、激活體液免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮了重要作用。其中，SIGLEC10在白細胞中表達，并通過細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合B細胞和單核細胞。SIGLEC10還可以識別炎癥細胞上抑制性受體，抑制局部的炎癥反應(yīng)[39-40]。巨噬細胞通過分泌炎性細胞因子介導免疫功能，并受Th2細胞分泌的細胞因子調(diào)控[41-42]。DDL4和VSIG4參與了巨噬細胞介導的炎癥反應(yīng)，其中DLL4能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞的促炎激活作用及免疫細胞的表型[43]，VSIG4在巨噬細胞上表達，并在調(diào)控巨噬細胞介導的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[44]。在炎癥反應(yīng)中，中性粒細胞從血液遷移到炎癥部位用以增強免疫防御功能[45]。與此功能一致，S100A8是中性粒細胞的強大刺激因子，參與中性粒細胞向炎癥部位遷移的過程[46]。Th2細胞分泌的細胞因子可以促進B細胞的增殖并促進其分化為漿細胞，進而促進抗體的產(chǎn)生[41-42]。在體液免疫應(yīng)答方面，BATF對Th2細胞具有積極的作用，可以加快外周B細胞向漿細胞分化所需的轉(zhuǎn)錄過程[47]。本研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子CCR1和ACKR4與C-C趨化因子受體活性、C-C趨化因子結(jié)合、趨化因子配體5結(jié)合和趨化因子配體7結(jié)合等過程相關(guān)。趨化因子通過調(diào)節(jié)白細胞定位和遷移，在調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[48]。趨化因子通過介導G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體(chemokine receptors，CCRs)信號轉(zhuǎn)導來發(fā)揮生物學功能[49]，同時趨化因子也可以與ACKRs結(jié)合[50]。作為一種重要的調(diào)控因子，ACKR4調(diào)控早期激活的B細胞分化和抗體產(chǎn)生[51]。此外，趨化因子受體CCR1在自然殺傷細胞和單核細胞表面表達，并在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[52]。CCR1也被鑒定為來源于肥大細胞的外泌體中的樞紐基因，通過肥大細胞釋放的外泌體參與T細胞激活和Th2細胞分化，以此間接調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[53]。當暴露于氧化應(yīng)激環(huán)境時，肥大細胞釋放的外泌體也可以抑制細胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)[54]。綜上所述，參與免疫過程的多個差異基因表明，飼糧中添加金銀花提取物可能提高了熱應(yīng)激奶牛的免疫功能。

3.3 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛GLU代謝的影響

熱應(yīng)激抑制GC的分泌，導致機體血液GLU含量下降[8]。GC通過刺激糖異生和糖原分解反應(yīng)，促進肝臟GLU輸出，在提高血液GLU含量方面發(fā)揮作用[55]。在熱應(yīng)激條件下，奶牛需要更多的GLU供應(yīng)來滿足能量需求[56]。肝臟的主要功能與營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和再分配有關(guān)，在對外界變化的環(huán)境做出反應(yīng)的同時，維持穩(wěn)定的血液GLU含量。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加奶牛金銀花提取物可以提高血液中GLU和GC含量，說明金銀花提取物有助于維持熱應(yīng)激奶牛的能量平衡。肝臟轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)金銀花提取物可以影響GLU代謝過程、葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性和丙酮酸羧化酶活性的相關(guān)基因表達。在熱應(yīng)激時期，飼糧中添加金銀花提取物可以降低奶牛肝臟中PC、EPM2AIP1、PFKFB3和PGAM基因的表達水平。EPM2AIP1是糖原合成酶相關(guān)的基因，小鼠EPM2AIP1的敲除可以減弱糖原合成酶的活化作用，減少肝糖原的合成[57]。EPM2AIP1表達水平的降低可能表明機體通過抑制肝糖原合成來減少血液中GLU向肝臟的輸入過程。糖異生是主要的GLU來源，以丙酸鹽為有效底物[58]，PC是丙酮酸羧化酶基因，作為肝糖異生的限速酶發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[59]。當奶牛遭受熱應(yīng)激時，肝臟內(nèi)PC的表達水平增加[60-61]，并且奶牛體溫的升高也會直接導致PC的表達水平增加[11]，在本研究中，PC表達水平的降低可能表明金銀花提取物對奶牛熱應(yīng)激具有緩解作用。PGAM作為一種糖酵解酶基因，在細胞核、細胞質(zhì)和線粒體中表達，催化3-磷酸甘油酸向2-磷酸甘油酸的可逆轉(zhuǎn)化過程[62]。綜上所述，添加金銀花提取物促進了GC的分泌，進而提高了血液中的GLU含量，有利于緩解熱應(yīng)激引起的機體能量負平衡。

3.4 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶?？寡趸阅艿挠绊?/h3>

本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加金銀花提取物提高了泌乳奶牛血清T-AOC和GSH-Px活性，表明金銀花提取物能夠改善熱應(yīng)激奶牛的抗氧化狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，泛酰硫氫乙胺水解酶活性是GO分子功能中唯一富集到的FDR<0.05的過程。此外，泛酸代謝過程和泛酸鹽和輔酶A生物合成過程也被富集到。結(jié)果表明，VNN1和VNN2基因參與了這些富集過程。VNN基因家族有3個成員(VNN1、VNN2、VNN3)，其中VNN1和VNN2已被鑒定出具有酶活性[63]。VNN1主要在肝臟中表達，是編碼泛酰巰基乙胺酶的主要轉(zhuǎn)錄本[64]。作為輔酶A代謝途徑的一部分，泛酰巰基乙胺酶可以催化水解泛酰巰基乙胺產(chǎn)生泛酸(維生素B5)和半胱胺。熱應(yīng)激導致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡而誘發(fā)氧化應(yīng)激[65]。在肝臟中，半胱胺具有清除活性氧的功能，與細胞中的谷胱甘肽一樣，作為一個活躍的氧化還原劑，還原型半胱胺和氧化型半胱胺的比值處于平衡狀態(tài)[66]。半胱胺具有抗氧化活性，與胱胺一起參與保護細胞免受氧化應(yīng)激[67]。敲除小鼠的VNN1基因可以緩解氧化性組織損傷，減少炎癥反應(yīng)和細胞凋亡[68]。也有研究證實，VNN1在氧化應(yīng)激反應(yīng)中表達上調(diào)[69]。因此，飼喂熱應(yīng)激奶牛金銀花提取物后，VNN1表達水平的降低可能表明其具有一定的抗氧化作用。從文獻來看，很少有研究表明金銀花提取物可以影響體內(nèi)半胱胺的含量。然而，在小鼠肝臟中，VNN1敲除小鼠的谷胱甘肽含量升高，作為GSH-Px的生成底物，谷胱甘肽在抵抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[68]，這可能間接表明了金銀花提取物的抗氧化作用。VNN2也是一種泛酰巰基乙胺酶，在中性粒細胞中以可溶性和膜結(jié)合的形式表達，通過調(diào)節(jié)整合素的功能來促進中性粒細胞的黏附及遷移到炎癥部位的過程[70]。本研究中VNN2的上調(diào)可能提示金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛具有炎癥調(diào)節(jié)作用。

3.5 金銀花提取物對熱應(yīng)激奶牛肝臟細胞功能的影響

通過肝臟轉(zhuǎn)錄組進一步分析發(fā)現(xiàn)，有些差異表達基因的功能主要與質(zhì)膜部分、質(zhì)膜、質(zhì)膜內(nèi)在組分和質(zhì)膜整體組分有關(guān)。如SLC2A8、SLC5A1、SLC5A12、SLC7A5、SLC7A8、SLC51B、SLC29A2、SCAMP5、CYTH4、TMEM63C和IFITM5，這些基因編碼的蛋白在細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運中具有重要作用。如SLC5A12、SLC2A8、SLC5A1、SLC7A5、SLC7A8、SLC51B和SLC29A2編碼的溶質(zhì)載體蛋白家族，在細胞膜上的物質(zhì)轉(zhuǎn)運中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。如SLC2A8是果糖和GLU的轉(zhuǎn)運體，并且具有很高的親和力和物質(zhì)結(jié)合能力[71-72]。SLC7A5和SLC7A8是異構(gòu)體氨基酸的轉(zhuǎn)運體[73-74]。SLC29A2是核苷及其結(jié)構(gòu)類似物的轉(zhuǎn)運體[75]。SLC5A1、SLC5A12和SLC51B屬于SLC5異構(gòu)體，是GLU、半乳糖、乳酸、短鏈脂肪酸、維生素、膽汁酸和共軛類固醇的轉(zhuǎn)運體[76]。此外，在GO生物學過程中，多數(shù)差異表達基因(ICAM3、BST1、CXADR、PCDH1、ITGA9、DSP和THY1)被富集到細胞黏附過程，主要包括細胞黏附、細胞黏附調(diào)節(jié)和細胞-細胞黏附。例如，BST1是一種支持細胞生長及調(diào)節(jié)細胞黏附和遷移的多功能分子[77]。作為免疫球蛋白超家族的細胞表面受體，ICAM亞家族成員(ICAM1、ICAM2、ICAM3)具有結(jié)構(gòu)和功能上的同源性，介導與免疫過程相關(guān)的細胞-細胞黏附過程。ICAM亞家族和白細胞整合素之間的相互黏附可以促進特定抗原的T細胞應(yīng)答[78]。黏附分子按其結(jié)構(gòu)特征可分為整合素家族、選擇素家族、鈣黏蛋白家族和免疫球蛋白超家族。PCDH1是鈣黏蛋白超家族中最大的亞基，是一種跨膜受體，有助于細胞間黏附和調(diào)節(jié)細胞間交流[79]。DSP是一種細胞橋粒和高度組織的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域，其功能是將中間絲連接到細胞表面的細胞黏附位點[80-81]。然而，現(xiàn)有的文獻僅能證明金銀花提取物具有一些細胞保護、細胞周期阻滯和影響細胞凋亡的作用[82-84]。雖然很難確定這些與質(zhì)膜和細胞黏附相關(guān)的差異表達基因的確切生物學意義，但這些與細胞功能相關(guān)的過程可能預示著高效的細胞間交流和細胞代謝過程。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加金銀花提取物可以顯著降低熱應(yīng)激奶牛的直腸溫度，但對干物質(zhì)采食量、產(chǎn)奶量、乳成分及呼吸頻率無顯著影響。

② 通過分析肝臟轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，金銀花提取物影響的基因主要參與免疫過程、炎癥過程、泛酸代謝過程、碳水化合物代謝過程以及質(zhì)膜和細胞黏附過程。金銀花提取物可以提高熱應(yīng)激奶牛的免疫功能、促進體內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝過程。

③ 通過肝臟轉(zhuǎn)錄組分析，為闡明金銀花提取物在緩解奶牛熱應(yīng)激的機制提供了新的見解。