趙亞波 張騰龍 張艷梅 白 晨 敖長(zhǎng)金

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

瘤胃微生物以及瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)恒在反芻動(dòng)物對(duì)飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化過(guò)程中起著重要作用。飼糧中的蛋白質(zhì)進(jìn)入奶牛瘤胃后，70%能夠被微生物所消化，其余30%進(jìn)入真胃和小腸等部位進(jìn)行消化。大部分飼糧中蛋白質(zhì)被瘤胃微生物轉(zhuǎn)化為微生物蛋白，其品質(zhì)較優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)差，使飼糧中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的利用率降低。在奶牛飼糧中添加非蛋白氮會(huì)為瘤胃微生物合成微生物蛋白提供氮源，從而能夠提高過(guò)瘤胃蛋白含量，有利于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)在小腸段被消化吸收，進(jìn)而提高其利用率。但是，非蛋白氮的使用需要注意諸多問(wèn)題，如需添加能量飼料、配合粗蛋白質(zhì)使用和防止氨中毒等。因此，探尋安全、有效的新型飼料添加劑有利于奶牛對(duì)飼糧中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的吸收利用，提高飼料轉(zhuǎn)化率，改善乳品質(zhì)。

小肽(SP)通常是指由2～3個(gè)氨基酸組成的寡肽，具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、耗能低和不易飽和等特點(diǎn)，比單一氨基酸更容易被機(jī)體組織吸收和利用。因?yàn)樾‰目杀环雌c動(dòng)物機(jī)體完全吸收，對(duì)反芻動(dòng)物自身的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)具有重要意義，所以，小肽在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用逐漸增多。司丙文等在奶牛飼糧中分別添加5、10和15 g/(頭·d)小肽，結(jié)果表明，添加10 g/(頭·d)小肽效果最佳，能夠顯著提高奶牛的產(chǎn)奶性能和氮的表觀消化率。涂瑞等發(fā)現(xiàn)在不同精粗比飼糧條件下添加小肽對(duì)體外產(chǎn)氣量、養(yǎng)分降解率和發(fā)酵參數(shù)有顯著影響。張智安等研究表明，在湖羊飼糧中添加蜜蜂肽能夠增加瘤胃微生物群落豐富度和多樣性，同時(shí)抑制革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)與繁殖，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵模式趨于乙酸發(fā)酵，提高乙酸/丙酸值。綜上所述，目前關(guān)于小肽對(duì)瘤胃發(fā)酵的調(diào)控還鮮有報(bào)道，尤其是對(duì)奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響的報(bào)道更少。棉籽酶解蛋白是以優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)為原料，經(jīng)組合液態(tài)酶酶解工藝生產(chǎn)的小肽產(chǎn)品，該產(chǎn)品對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵有無(wú)影響還需進(jìn)一步研究。因此，本試驗(yàn)主要通過(guò)體外批次培養(yǎng)法，旨在研究棉籽酶解蛋白對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵和微生物區(qū)系的影響，為該產(chǎn)品作為飼料添加劑在奶牛養(yǎng)殖中的進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用棉籽酶解蛋白是通過(guò)植物蛋白酶解得到的功能肽產(chǎn)品，總蛋白質(zhì)含量在45%以上，其中小肽含量為28%(谷氨酸含量9.55%、天冬氨酸含量4.20%、精氨酸含量4.47%、賴氨酸含量2.86%、亮氨酸含量2.76%、甘氨酸含量2.27%和苯丙氨酸含量2.27%)，由成都某公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取4頭健康、體況和泌乳天數(shù)相近的荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體，每天07：00和18：00飼喂和擠奶，飼糧精粗(干物質(zhì)基礎(chǔ))比為50∶50，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。體外發(fā)酵底物與供體奶牛飼糧水平相同，粉碎后過(guò)1 mm篩。本試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將采集的瘤胃液混勻后分為4組，即對(duì)照組(C組)、低濃度組(E組)、中濃度組(F組)和高濃度組(G組)，并分別在其底物中添加0、0.3%、0.5%和0.7%的棉籽酶解蛋白(干物質(zhì)基礎(chǔ))，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，體外發(fā)酵培養(yǎng)48 h，分別在2、4、6、8、12、24和48 h進(jìn)行樣品采集，每次3個(gè)重復(fù)全部采集瘤胃上清液。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 體外瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)

1.3.1 瘤胃液采集及瘤胃緩沖液的配制

瘤胃液采集：本試驗(yàn)選取4頭健康、體況和泌乳天數(shù)相近的荷斯坦奶牛，于07：00進(jìn)行晨飼，11：00采用口腔采集法收集瘤胃液，每頭牛收集800 mL瘤胃液[10]。將采集的瘤胃液均勻混合后經(jīng)4層紗布過(guò)濾后，倒入用熱水預(yù)熱和充有二氧化碳的保溫瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室。

瘤胃液緩沖液參照Menke等[11]的方法制備：400 mL蒸餾水、200 mL A液(39 g NaHCO3和2 g NH4HCO3溶于1 L蒸餾水)、0.1 mL B液(13.2 g CaCl2·2H2O、10 g MnCl2·4H2O、1 g CoCl2·6H2O、8 g FeCl3·6H2O溶于100 mL蒸餾水)、200 mL C液(5.7 g Na2HPO4、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O溶于1 L蒸餾水)、1 mL刃天青溶液以及40 mL還原劑溶液(95 mL蒸餾水、4 mL NaOH和0.625 g Na2S·9H2O)。在與瘤胃液混合前加入還原劑溶液并置于39 ℃水浴鍋中并持續(xù)通入二氧化碳直至混合液顏色變淡或無(wú)色時(shí)即可使用。

1.3.2 體外發(fā)酵培養(yǎng)與樣品采集

采用瓶口向上且蓋有橡膠塞的250 mL玻璃瓶作為人工瘤胃培養(yǎng)瓶。試驗(yàn)前，將精確稱取的2.00 g基礎(chǔ)培養(yǎng)底物放入人工瘤胃培養(yǎng)瓶中，C組、E組、F組和G組分別加入0、6.00、10.00和14.00 mg棉籽酶解蛋白。參照Menke等[12]的體外培養(yǎng)方法，將過(guò)濾后的瘤胃液與配制好的緩沖液按照1∶2的比例混勻于持續(xù)通入二氧化碳的三角瓶中，制成人工瘤胃培養(yǎng)液，三角瓶置于39 ℃水浴中。抽取200 mL人工瘤胃培養(yǎng)液分裝于預(yù)熱至39 ℃并通有二氧化碳的培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶塞，放入39 ℃水浴搖床上開(kāi)始厭氧培養(yǎng)。將玻璃瓶的2/3浸于控溫水浴搖床中，搖床頻率為40 r/min。試驗(yàn)過(guò)程中，每30 min進(jìn)行1次排氣，培養(yǎng)時(shí)間48 h。

在體外發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，分別在2、4、6、8、12、24和48 h取出3瓶，停止發(fā)酵。取出的樣品使用EL20型酸度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液pH后，分為3部分：一部分取5 mL瘤胃液裝在含有2 mL 25%偏磷酸的10 mL離心管中，-20 ℃保存，用于測(cè)定瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度；一部分放到10 mL離心管中，-20 ℃保存，用于測(cè)定瘤胃液中氨態(tài)氮(NH3-N)和菌體蛋白(MCP)濃度；一部分裝在50 mL離心管中，-80 ℃保存，用于后期瘤胃微生物DNA的提取和測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 飼料常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定

飼糧中粗蛋白質(zhì)含量使用凱氏定氮法測(cè)定(GB/T 6432—2018)；粗脂肪含量使用濾袋法測(cè)定(GB/T 6433—2006);粗灰分含量按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6438—2007進(jìn)行測(cè)定；酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量采用范氏(Van Soest)[13]洗滌纖維分析法測(cè)定；鈣和磷含量分別使用高錳酸鉀法(GB/T 6436—2002)和鉬黃分光光度法(GB/T 6437—2002)測(cè)定。

1.4.2 瘤胃內(nèi)環(huán)境指標(biāo)的測(cè)定

樣品解凍后5 000×g離心10 min，收集上清液，用氣相色譜法測(cè)定VFA濃度[14]。NH3-N濃度采用靛酚比色法測(cè)定[15]。MCP濃度使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[16]。

1.4.3 瘤胃微生物的測(cè)定

解凍瘤胃液樣品，采用TIANGEN糞便基因組DNA提取試劑盒[天根]生化科技(北京)有限公司〗提取DNA，具體操作參考說(shuō)明書(shū)步驟。用分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品的濃度與OD260/OD280值；取5 μL DNA樣品進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳并拍照，檢測(cè)DNA的完整性和質(zhì)量。

以提取的瘤胃液總微生物DNA為模板，檢測(cè)瘤胃黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、反芻月形單胞菌、布氏普雷沃氏菌、易北普雷沃氏菌、總細(xì)菌絕對(duì)含量變化。各細(xì)菌的擴(kuò)增引物序列如表2所示。參考王堯悅[17]的方法計(jì)算各樣品中每種細(xì)菌的拷貝數(shù)。熒光定量PCR反應(yīng)體系如表3所示，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)采集設(shè)置在60 ℃(每循環(huán)第2步反應(yīng)時(shí))。

表2 引物序列

表3 熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行整理，并運(yùn)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行各組間的顯著性比較，并使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵的影響

2.1.1 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液pH的影響

由表4可知，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，瘤胃發(fā)酵液pH均處于正常水平之中。在體外培養(yǎng)的8 h以內(nèi)，各組的pH均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；當(dāng)培養(yǎng)8～48 h，除24 h的E組pH高于對(duì)照組外，其他各時(shí)段試驗(yàn)組的pH均低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液pH的影響

2.1.2 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液NH3-N濃度的影響

由表5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組NH3-N濃度均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)8 h后，各試驗(yàn)組瘤胃發(fā)酵液中NH3-N濃度明顯上升，24～48 h則趨于平緩。在培養(yǎng)2～12 h，各組瘤胃發(fā)酵液中NH3-N濃度均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；在培養(yǎng)24和48 h時(shí)，F(xiàn)組瘤胃發(fā)酵液中NH3-N濃度均顯著高于其他3組(P<0.05)。除在2 h，F(xiàn)組和G組之間差異不顯著(P>0.05)外，其余各時(shí)間段各組之間NH3-N濃度均呈差異顯著(P<0.05)。

表5 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液NH3-N濃度的影響

2.1.3 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液MCP濃度的影響

由表6可知，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各組瘤胃液中MCP濃度均呈先上升再下降，再上升，再下降的趨勢(shì)；在培養(yǎng)2～8 h，對(duì)照組MCP濃度呈上升狀態(tài)，之后趨于平緩。在各時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組瘤胃發(fā)酵液中MCP濃度顯著升高(P<0.05)；除2、12和24 h外，G組在各時(shí)間點(diǎn)瘤胃發(fā)酵液中MCP濃度顯著高于其他組(P<0.05)。

表6 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液中MCP濃度的影響

2.1.4 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液VFA濃度的影響

由表7可知，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各試驗(yàn)組總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸濃度和乙酸/丙酸均呈先急劇上升，后緩慢上升趨勢(shì)。各試驗(yàn)組之間TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度在各時(shí)間段內(nèi)均呈差異顯著(P<0.05)；其中，C組和G組的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度均在較高水平波動(dòng)，顯著高于E組和F組(P<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)的E組和F組乙酸/丙酸總體上顯著低于對(duì)照組和G組(P<0.05)。

表7 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液中VFA濃度的影響

續(xù)表7項(xiàng)目Items時(shí)間Time/h組別 GroupsCEFGSEMP值P-value丙酸Propionate/(mmol/L)212.74c8.54a17.05d9.73b0.0690.011417.38d12.42c11.94b9.15a0.0660.011618.51d12.36a15.84c15.41b0.0800.012820.29c18.24a19.10b23.79d0.0600.0051219.18c10.60a19.24d17.13b0.0600.0062424.38c15.10a16.82b25.94d0.0770.0054821.75d19.22b16.18a21.25c0.0690.015丁酸Butyrate/(mmol/L)28.36c6.21a11.07d6.43b0.0770.01349.61d9.23c8.34b6.53a0.0870.013610.04b9.18a10.74d10.31c0.1980.011812.13a14.22c12.62b15.87d0.0560.0181210.94b9.69a13.48d13.06c0.0490.0062419.87c11.68a15.37b26.38d0.0370.0144816.25d15.91c12.38a15.45b0.0620.013乙酸/丙酸Acetate/propionate22.50c2.59c2.28a2.40b0.0230.02442.14a2.63c2.38b2.30b0.0370.01462.42b2.91c2.26a2.40b0.0640.00782.16a2.55b2.58b2.57b0.2030.032122.92d2.01a2.46b2.57c0.0720.007242.85d2.64c1.78a2.21b0.0320.012482.49c2.03a2.23b2.87d0.1030.012

2.2 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液微生物區(qū)系的影響

2.2.1 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液普雷沃氏菌數(shù)量的影響

由表8可知，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，布氏普雷沃氏菌數(shù)量呈平緩式下降，易北普雷沃氏菌數(shù)量呈波動(dòng)式下降；F組布氏普雷沃氏菌數(shù)量顯著高于其他3組(P<0.05)，E組布氏普雷沃氏菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；G組布氏普雷沃氏菌數(shù)量在2～12 h培養(yǎng)過(guò)程中顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。在培養(yǎng)2 h時(shí)，F(xiàn)組易北普雷沃氏菌數(shù)量顯著高于其他3組(P<0.05)，而E組易北普雷沃氏菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組和G組(P<0.05)；在培養(yǎng)8 h時(shí)，G組易北普雷沃氏菌數(shù)量顯著低于其他3組(P<0.05)；在培養(yǎng)24 h時(shí)，E組易北普雷沃氏菌數(shù)量顯著低于其他3組(P<0.05)；在培養(yǎng)48 h時(shí)，F(xiàn)組和G組易北普雷沃氏菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組和E組(P<0.05)。

表8 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液中普雷沃氏菌數(shù)量的影響

2.2.2 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液反芻獸新月形單胞菌數(shù)量的影響

由表9可知，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各試驗(yàn)組反芻獸新月形單胞菌數(shù)量的變化趨勢(shì)相似，在培養(yǎng)2～4 h呈下降趨勢(shì)，在4～6 h急劇上升，之后趨于平緩趨勢(shì)。在培養(yǎng)2～6 h，F(xiàn)組反芻獸新月形單胞菌數(shù)量顯著高于其他3組(P<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)G組反芻獸新月形單胞菌數(shù)量顯著低于其他3組(P<0.05)。

表9 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液中反芻新月形單胞菌數(shù)量的影響

2.2.3 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液中瘤胃球菌數(shù)量的影響

由表10可知，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各試驗(yàn)組的黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌數(shù)量變化趨勢(shì)大體相同；黃色瘤胃球菌數(shù)量呈先增加后降低趨勢(shì)，白色瘤胃球菌數(shù)量呈平緩上升趨勢(shì)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)F組的黃色瘤胃球菌數(shù)量和白色瘤胃球菌數(shù)量顯著高于其他3組(P<0.05)。

表10 棉籽酶解蛋白對(duì)體外瘤胃發(fā)酵液中黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌數(shù)量的影響

續(xù)表10時(shí)間Time/h組別 GroupsCEFGSEMP值P-value4817.28a17.56b17.87c17.57b0.070.012白色瘤胃球菌 Ruminococcus albus214.53a15.05b15.66c15.56c0.130.013414.70a15.76b15.90b15.68b0.140.009614.74a15.91b15.93b15.97b0.150.011815.39a16.27c16.45d16.05b0.120.0121215.07a15.97c16.33d15.84b0.130.0012416.00a16.42b16.42b16.04a0.060.0034815.88a15.94ab16.15c15.75a0.050.011

3 討 論

3.1 棉籽酶解蛋白對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液pH是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵狀況的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其數(shù)值主要在5.5～6.8變化，呈現(xiàn)中性或弱酸性[18]。瘤胃是瘤胃微生物發(fā)酵的主要場(chǎng)所，pH過(guò)高或過(guò)低可直接影響瘤胃微生物的生長(zhǎng)代謝，同時(shí)還可以反映反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)發(fā)酵和有機(jī)酸的代謝情況。在本試驗(yàn)中，各組瘤胃發(fā)酵液pH均在6.31～6.74變化，表明本試驗(yàn)條件下能夠保證瘤胃微生物正常生長(zhǎng)代謝。在培養(yǎng)2～8 h，各組pH顯著低于對(duì)照組，而在培養(yǎng)12～48 h，各試驗(yàn)組之間pH沒(méi)有顯著差異。王夢(mèng)芝等[19]使用4種形式的氮源底物研究其對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示pH呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明小肽能夠促進(jìn)瘤胃中碳水化合物的發(fā)酵，使VFA生成增多。

瘤胃液中NH3-N濃度是瘤胃氮代謝過(guò)程中外源蛋白質(zhì)和內(nèi)源性含氮物質(zhì)降解的重要產(chǎn)物。瘤胃中NH3-N濃度處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，經(jīng)常受到氮攝入、飼糧蛋白質(zhì)降解、MCP合成速率和瘤胃對(duì)NH3-N的吸收等因素影響[20]。在本試驗(yàn)中，各組瘤胃液NH3-N濃度顯著低于對(duì)照組，表明添加棉籽酶解蛋白可以增加微生物對(duì)氨氮的利用。殷云浩[21]和Jones等[22]研究發(fā)現(xiàn)，添加小肽可顯著降低瘤胃液中NH3-N濃度，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。當(dāng)瘤胃液NH3-N濃度為8.5 mg/dL時(shí)，瘤胃微生物合成蛋白質(zhì)的能力達(dá)到飽和，即使超過(guò)這一濃度，MCP產(chǎn)量不再增加[23]，而過(guò)高的NH3-N，既不能被微生物充分利用，還會(huì)導(dǎo)致大量的NH3-N通過(guò)瘤胃壁吸收進(jìn)入血液。最后，被吸收NH3-N在肝臟中轉(zhuǎn)化成尿素，并以尿液的形式排出體外。NH3-N的過(guò)量吸收不但會(huì)導(dǎo)致氮資源的浪費(fèi)，而且還會(huì)導(dǎo)致氨中毒[24]。因此，在奶牛飼糧中添加小肽能夠在正常范圍內(nèi)降低NH3-N濃度，減少通過(guò)瘤胃壁進(jìn)入血液的NH3-N，從而減輕機(jī)體對(duì)氮代謝的負(fù)擔(dān)。

飼糧中大部分的蛋白質(zhì)飼料均在瘤胃中被瘤胃微生物所降解，形成肽、氨基酸及NH3-N，瘤胃微生物能夠利用NH3-N合成MCP，供給奶牛機(jī)體利用，是其最主要的氮源供應(yīng)者，可滿足機(jī)體蛋白質(zhì)需要量的40%～80%[25]。前人研究報(bào)道，在飼糧中添加小肽可以促進(jìn)瘤胃細(xì)菌生長(zhǎng)和纖維降解[26]，并發(fā)現(xiàn)無(wú)論是體內(nèi)還是體外大豆小肽均可顯著提高瘤胃MCP濃度[27-28]。在本試驗(yàn)中，各組瘤胃發(fā)酵液MCP濃度顯著高于對(duì)照組，與前人研究結(jié)果一致。因此，在奶牛飼糧中添加棉籽酶解蛋白能夠有效促進(jìn)其瘤胃微生物對(duì)NH3-N的利用，提高瘤胃微生物合成MCP的能力，從而提高奶牛對(duì)蛋白質(zhì)飼料的利用率。

VFA是碳鏈為1～6的脂肪酸，對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃的代謝有著極為關(guān)鍵的作用，其中，乙酸、丙酸和丁酸約占瘤胃發(fā)酵VFA總產(chǎn)量的95%[29]。有研究表明，瘤胃中VFA不僅為瘤胃消化吸收提供能量，而且還與瘤胃壁組織的發(fā)育密切相關(guān)[30]?？梢?jiàn)，VFA對(duì)反芻動(dòng)物的作用以及對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃的功能有著重要影響。前人研究表明，小肽能夠顯著提高瘤胃中VFA濃度，降低乙酸/丙酸[21,31]。而在本試驗(yàn)中，TVFA和乙酸、丙酸、丁酸濃度總體呈上升趨勢(shì)，與前人研究結(jié)果一致。因此，在飼糧中添加不同濃度的棉籽酶解蛋白對(duì)瘤胃微生物體外發(fā)酵產(chǎn)生VFA具有一定的調(diào)控作用。

3.2 棉籽酶解蛋白對(duì)瘤胃微生物數(shù)量的影響

奶牛的瘤胃可以為多種微生物(細(xì)菌、原蟲(chóng)和真菌)提供棲息地[32]，并保證微生物發(fā)酵順利進(jìn)行，其發(fā)酵本質(zhì)是瘤胃內(nèi)微生物對(duì)飼料纖維素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵、降解，以實(shí)現(xiàn)更有效的利用[33]。瘤胃菌群結(jié)構(gòu)與反芻動(dòng)物機(jī)體健康和生產(chǎn)性能密切相關(guān)[34]。瘤胃的主要功能菌群包括：纖維分解菌、半纖維素分解菌、蛋白質(zhì)分解菌、淀粉分解菌、脂肪分解菌、乳酸產(chǎn)生菌和乳酸利用菌[35]。在本試驗(yàn)中，主要研究了棉籽酶解蛋白對(duì)纖維分解菌(白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌)和蛋白分解菌(普雷沃氏菌和反芻獸新月形單胞菌)數(shù)量的影響。

瘤胃中主要的纖維分解菌包括：產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌[36]。在本試驗(yàn)中，添加棉籽酶解蛋白制劑能夠明顯增加瘤胃中黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數(shù)量，且添加量為干物質(zhì)的0.5%時(shí)，黃色瘤胃球菌數(shù)量在培養(yǎng)8～12 h均顯著增加，白色瘤胃球菌數(shù)量在各時(shí)段均增加，效果較為理想。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)肽和纖維分解菌之間關(guān)聯(lián)的統(tǒng)一觀點(diǎn)，但是，一部分學(xué)者認(rèn)為非氨態(tài)氮(蛋白質(zhì)、肽和氨基酸)能夠促進(jìn)瘤胃微生物的纖維降解能力[37]。王文娟等[38]也通過(guò)瘤胃灌注方法，發(fā)現(xiàn)大豆小肽能夠提高魯西黃牛對(duì)于纖維素的表觀消化率。李琍等[39]通過(guò)混合瘤胃微生物體外培養(yǎng)方法，證明肽能夠顯著提高纖維分解菌的活力和粗纖維的降解率，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。

目前研究報(bào)道的蛋白降解菌主要包括嗜淀粉瘤胃桿菌、反芻獸新月形單胞菌、溶纖維丁酸弧菌和普雷沃氏菌屬，除了一些纖維降解菌沒(méi)有蛋白酶活性外，大多數(shù)的瘤胃細(xì)菌都具有一定的降解蛋白質(zhì)的能力，其中反芻獸新月形單胞菌還可以利用瘤胃中的乳酸將其生成揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)[40]。本試驗(yàn)中選取了反芻獸新月形單胞菌和普雷沃氏菌屬中的易北普雷沃氏菌與布氏普雷沃氏菌為研究對(duì)象，試驗(yàn)結(jié)果表明，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，F(xiàn)組布氏普雷沃氏菌和反芻獸新月形單胞菌數(shù)量顯著高于其他3組，可能是添加棉籽酶解蛋白能為其生長(zhǎng)提供底物。雖然瘤胃中反芻獸新月形單胞菌數(shù)量顯著增加，但是并未提高瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸濃度，具體原因需進(jìn)一步試驗(yàn)論證。有研究指出，一定濃度的肽反而會(huì)降低某些蛋白分解菌的數(shù)量，進(jìn)而會(huì)抑制蛋白質(zhì)的降解[39]，而本試驗(yàn)中G組布氏普雷沃氏菌數(shù)量在培養(yǎng)2～12 h過(guò)程中顯著低于對(duì)照組，與其說(shuō)法相似。

4 結(jié) 論

① 添加棉籽酶解蛋白能夠在合理的范圍內(nèi)降低瘤胃液pH和NH3-N的濃度，增加MCP濃度，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，但對(duì)VFA的產(chǎn)生有一定抑制作用。

② 添加棉籽酶解蛋白能夠增加瘤胃球菌的數(shù)量，促進(jìn)瘤胃微生物對(duì)纖維的降解能力。同時(shí)，棉籽酶解蛋白會(huì)減少瘤胃中普雷沃氏菌的數(shù)量，有可能會(huì)抑制瘤胃微生物對(duì)蛋白質(zhì)的降解。通過(guò)瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物數(shù)量綜合比較各組結(jié)果，棉籽酶解蛋白的最適添加劑量為0.5%。