何婷，倪雪晨，張萍萍，陳茹，宋晶晶，雷佳，王行國

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430062)

0 引言

氨基轉(zhuǎn)移酶(aminotransferase)也稱為轉(zhuǎn)氨酶，催化L-氨基酸和α-酮酸之間的氨基轉(zhuǎn)移[1].反應(yīng)過程中需要磷酸吡哆醛(PLP)作為輔酶,且在多數(shù)情況下使用L-谷氨酸作為氨基供體.氨基轉(zhuǎn)移酶擁有寬泛的底物特異性和較高的轉(zhuǎn)換效率，已被作為生物催化劑廣泛用于L-型氨基酸的工業(yè)化生產(chǎn)[2]. 氨基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)機制為雙底物乒乓反應(yīng)機制，反應(yīng)是可逆的，其平衡常數(shù)為1.0左右[3-4]. 大腸桿菌 (Escherichiacoli) 擁有4種氨基轉(zhuǎn)移酶,分別為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AspAT)，芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(aromatic amino acid transaminase, TyrAT)，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(branched-chain amino acid aminotransferase, IlvAT)和丙纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine-valine aminotransferase, AvtAT).它們通常由2或6個亞基組成，分子量為86～182 kD. 單個亞基的分子量為34～46 kD,氨基酸殘基數(shù)為309～417,且pI值在4.6～5.83之間[5-9].

非天然氨基酸是指天然蛋白質(zhì)中20種天然氨基酸之外的氨基酸，包括L-非天然氨基酸和D-氨基酸. 由于它們的結(jié)構(gòu)和功能多樣性，非天然氨基酸被廣泛應(yīng)用于合成化學(xué)的手性骨架和分子支架，合成蛋白酶抑制劑、腦啡呔、人體激素類似物、煙酰胺乙酰膽堿受體和治療老年癡呆癥、高血壓、止痛、治腫瘤和抗癲癇的藥物[10-14]. 利用非天然氨基酸也能合成新型甜味劑或用于化妝品. 德國贏固賽公司與荷蘭DSM公司是少數(shù)幾個既能生產(chǎn)天然氨基酸又能生產(chǎn)非天然氨基酸的大公司. 目前人工合成出30多種非天然氨基酸，可作為合成活性藥物的重要原料.

非天然氨基酸不是氨基轉(zhuǎn)移酶的天然底物. 使用強制進化(forced evolution)的方法能使大腸桿菌細胞利用非天然氨基酸作底物并催化L-谷氨酸和α-酮酸之間的氨基轉(zhuǎn)移[15].這個結(jié)果提示大腸桿菌氨基轉(zhuǎn)移酶能催化非天然氨基酸的合成. 本研究的目的是利用大腸桿菌4種氨基轉(zhuǎn)移酶作材料，試圖了解氨基轉(zhuǎn)移酶的非天然氨基酸底物特異性. 在此基礎(chǔ)上，使用分子生物學(xué)方法突變氨基轉(zhuǎn)移酶基因，改進氨基轉(zhuǎn)移酶的活性以提高催化非天然氨基酸的效率.使用易錯PCR的方法對酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TyrAT)基因(tyrB)進行突變，篩選出10突變體.在這10個突變酶中，酶蛋白210位都出現(xiàn)Cys替換Phe. 與野生型酶比較，酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶的F210C突變改變酶的催化反應(yīng)最適溫度有提高酶在37 ℃的催化效率.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗菌株、載體和試劑實驗中使用的菌株及質(zhì)粒載體見表1. 細菌通常在LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g，加水至1 L, pH 7.2)中37 ℃培養(yǎng), -80 ℃甘油冷凍貯藏．質(zhì)粒載體通常轉(zhuǎn)化至E.coliDH5a或E.coliTop10細菌中擴增或保存.有機和無機試劑均購自上海中科公司. 抗生素、培養(yǎng)基購自O(shè)xoid公司. ExTaq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶和pMD18-T載體連接試劑盒購自大連寶生物工程有限公司. DNA 凝膠回收試劑盒、PCR 清潔試劑盒購自Axygen 公司.DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸、L-正纈氨酸、L-叔亮氨酸、L-新戊基甘氨酸、D-正亮氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、INT、PES購自Sigma公司；葡萄糖、Tris堿、溴化乙錠、十二烷基硫酸鈉(SDS)、瓊脂糖、IPTG、氨芐青霉素購自Amresco 公司.

1.2 基因克隆參照分子克隆手冊[16]介紹的方法進行基因克隆. 首先從E.coliDH5a細菌中抽提總DNA，然后用總DNA為模板、表2列出的寡聚核苷酸序列作為引物和TaqDNA聚合酶進行PCR反應(yīng). PCR反應(yīng)步驟為: 94 ℃變性5 min后, 再在94 ℃ 變性30 s、53 ℃ 復(fù)性90 s、72 ℃ 延伸60 s條件下擴增30個循環(huán), 最后在72 ℃延長5 min. 使用PCR清潔試劑盒回收PCR產(chǎn)物. 將PCR產(chǎn)物直接連接至pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化CaCl2處理的E.coliDH5α感受態(tài)細胞，最后在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選出抗氨芐青霉素的陽性克隆. 陽性克隆在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)8 h后抽提質(zhì)粒DNA. 抽提的質(zhì)粒DNA經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切，鑒定pMD18-T載體是否真正插入外源的DNA片段. 酶切驗證后送重組子質(zhì)粒進行基因測序.

1.3 酶蛋白表達與純化用NdeI和XhoI雙酶切插入目的基因的pMD18-T重組子質(zhì)粒DNA. 8% 瓊脂糖凝膠電泳后，切取目的基因條帶, DNA 凝膠回收試劑盒回收DNA片段. 將回收DNA片段與pET23a混合，加入T4 DNA連接酶，16 ℃連接過夜，形成pET23a重組質(zhì)粒. 將連接后的重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化CaCl2處理的E.coliBL21(DE3) plysS感受態(tài)細胞.來自Paul C Engel實驗室的Pagdh基因則插入ptac85形成ptac85重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化CaCl2處理的E.coliTop10感受態(tài)細胞. 轉(zhuǎn)化后的細菌涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選出抗氨芐青霉素的陽性單個菌落. 挑單菌落并接入5 mL的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)活化.當(dāng)活化的細菌長到對數(shù)期時，按1∶100的比例接入500 mL的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床培養(yǎng).待細菌長到對數(shù)期(OD600=0.6～0.8)時加入0.5 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)4～8 h.

將培養(yǎng)過夜的細菌4 ℃、6 000 r/min高速冷凍離心15 min，收集的菌體用50 mmol/L Tris-Cl緩沖液(pH 8.0)洗3次，然后重懸于60 mL含1 mol/L DTT和5%甘油的50 mmol/L Tris-Cl緩沖液，并在40 W功率，占空比30%的條件下超聲波破碎細胞25 min. 4 ℃、12 000 r/min離心25 min，收集上清液(即粗酶).進行10%SDS-PAGE和考馬斯亮蘭染色檢測目的基因的表達.

使用離子交換層析、疏水層析和凝膠過濾層析三步法純化酶蛋白. 首先，參照文獻[16-18]使用離子交換層析進行第一步純化. 具體步驟如下: 用含50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)平衡Q-sepharose FF陰離子交換層析柱，流速控制在2 mL/min. 上樣后用0～0.5 mol/L 的NaCl濃度梯度洗脫，自動收集器收集樣本，紫外分光光度計檢測每管的A280值. 層析完成后收集A280峰值處的蛋白并用10% SDS-PAGE檢測目的蛋白. 收集含目的蛋白的樣本，分別在TyrAT、IlvAT、AspAT和AvtAT蛋白樣品中緩慢地加入40%、30%、45%和35%的硫酸銨，4 ℃保存?zhèn)溆? 第二步純化則使用疏水層析. 參照文獻[17-20], 分別用含40%、30%、45%和35% 硫酸銨的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液平衡Butyl-Sepharose 4B柱，流速為1 mL/min. 上樣后分別用40%～0%、30%～0%、45%～0%和35%～0% 硫酸銨的梯度緩沖液洗脫并自動收集4種氨基轉(zhuǎn)移酶. 依照紫外分光光度計檢測的A280洗脫圖譜, 10% SDS-PAGE檢測目的蛋白并收集目的蛋白樣本. 最后用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)透析過夜，4 ℃保存?zhèn)溆? 第三步純化使用凝膠過濾層析[16-17,21], 用含有5 mmol/L NaCl的Tris-Cl(pH 8.0)平衡Sepharose 4 FF層析柱, 流速控制在0.5 mL/min. 上樣后繼續(xù)用含有5 mmol/L NaCl的Tris-Cl洗脫，自動收集和檢測A280.用10% SDS-PAGE檢測目的蛋白并收集目的蛋白樣本, 并加15%甘油后置-80 ℃冷凍冰箱中保藏.

純化的酶蛋白濃度使用分光光度計進行測定，依照公式C(mg/mL)=(1.55×A280-0.76×A260)×稀釋倍數(shù)來估算酶蛋白濃度(mg/mL).

1.4 酶活性測定由于氨基酸和酮酸都沒有可供檢測的光譜，只能用水合茚三酮染色鑒定氨基酸[22].利用光譜檢測轉(zhuǎn)氨酶活力則需要偶聯(lián)另外一個酶反應(yīng)，如將脫氫酶反應(yīng)與轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)偶聯(lián)起來即可測定NADH在340 nm處的吸收值(如圖1所示). 實驗中使用的脫氫酶為PaGDH(嗜溫性厭氧型鏈球菌(Peptostreptoccusasaccharolyticus)谷氨酸脫氫酶). 圖1還顯示，如在酶反應(yīng)中加入PES(吩嗪乙基硫酸鹽)和INT(碘硝基氯化四氮唑藍)，生成紫紅色產(chǎn)物甲臜(formazan). 甲臜在512 nm處有最大的吸收值, 因此也可以用96孔板檢測轉(zhuǎn)氨酶活性.

圖1 脫氫酶與轉(zhuǎn)氨酶偶聯(lián)的酶催化反應(yīng)示意圖

依據(jù)上述原理，可用3種方法進行酶活性定性或定量測定. 一種是分光光度計法，即在1 mL反應(yīng)體系中, 3 mmol/L非天然氨基酸、2 mmol/Lα-酮戊二酸、2 μmol/L PLP、1 mmol/L NAD+、5 μL 0.2 mg/mL PaGDH、50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)混勻后加入轉(zhuǎn)氨酶，并在Shmadzu UV-2550分光光度計上37 ℃、340 nm處測定酶反應(yīng)初速度[23]. 另一種是酶標(biāo)儀檢測法，即在上述1 mL反應(yīng)體系中再加0.04 mg/mL INT和0.3 mg/mL PES. 96孔板每個孔中加入200 μL 反應(yīng)液，混勻后37 ℃培養(yǎng)箱中放置10 min， BioTek酶標(biāo)儀測定512 nm吸光值或直接拍照. 最后一種方法是TLC法[15]，即用正丁醇∶冰乙酸∶dH2O (4∶1∶3) 預(yù)處理Silica gel 60硅膠板. 每個樣品取3 μL反應(yīng)混合物點樣到硅膠板上，然后將硅膠板置于盛有正丙醇∶dH2O(7∶3,V/V) 展層液的層析缸中進行TLC.TLC完成后取出硅膠板并在45 ℃烘干，最后用0.5%水合茚三酮乙醇溶液噴霧顯色.氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成紫紅色斑點,因此TLC法可用來進行氨基轉(zhuǎn)移酶活性的定性檢測.

1.5 易錯PCR與定向進化篩選以實驗室構(gòu)建好的pET23a-tyrB質(zhì)粒DNA為模板，使用引物tyrB-F和tyrB-R進行易錯PCR (sequential error-prone PCR) 擴增. 通過調(diào)整PCR反應(yīng)條件，如提高鎂離子濃度、添加錳離子、改變體系中4種dNTPs濃度和運用低保真度DNA聚合酶等來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機突變體.參照文獻[24-25]的方法,進行易錯PCR. PCR反應(yīng)程序為：94 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s、59 ℃ 1.5 min、72 ℃ 1 min擴增30個循環(huán)并72 ℃延伸7 min. PCR反應(yīng)產(chǎn)物用0.7 %瓊脂糖凝膠電泳分析.回收的PCR產(chǎn)物溶于40 μL無菌超純水并在-20 ℃保存?zhèn)溆?

將改變鎂離子、錳離子和4種dNTPs濃度的PCR產(chǎn)物回收后混合,用NdeI和XhoI雙酶切, 插入pET23a質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3) plysS,建立突變文庫(5 000菌落). 將突變文庫的細菌接種到以5 mmol/LDL-高苯丙氨酸或5 mmol/LD-正亮氨酸為氮源的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h. 再按1∶100接種至含有3 mmol/LDL-高苯丙氨酸或3 mmol/LD-正亮氨酸為氮源的M9培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24 h. 然后按1∶100接種至含有1 mmol/LDL-高苯丙氨酸或1 mmol/LD-正亮氨酸為氮源的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h.通過3輪定向進化篩選后, 涂1 mmol/LDL-高苯丙氨酸或1 mmol/LD-正亮氨酸為氮源的M9培養(yǎng)基平板，收集篩選出的單個菌落，抽提重組子質(zhì)粒，靶基因DNA測序確定突變位點，并進行酶蛋白表達和純化以及酶活性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 4種氨基轉(zhuǎn)移酶基因克隆、酶蛋白表達純化與酶活性經(jīng)PCR反應(yīng)后，成功獲得大腸桿菌4種氨基轉(zhuǎn)移酶基因aspC、ilvE、avtA和tyrB.其基因大小分別為1 191 bp、930 bp、1 254 bp和1 194 bp. 將它們分別克隆至pET23a表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3) plys S, 表達的酶蛋白大小分別為43 kD、33.5 kD、46.7 kD和43 kD，與基因庫報道的大小一致. 4種氨基轉(zhuǎn)移酶,即天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AspAT)、丙纈氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AvtAT)、支鏈氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(IlvAT)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TyrAT)，經(jīng)三步層析分離純化，每L細菌培養(yǎng)物可得到30～58 mg純蛋白. 10% SDS-PAGE顯示純化后的4種酶蛋白純度達到電泳純 (見圖2).

依據(jù)氨基轉(zhuǎn)移酶催化氨基酸和α-酮戊二酸生成α-酮酸和谷氨酸的酶反應(yīng)機理，設(shè)計酶反應(yīng)體系檢測純化的4種氨基轉(zhuǎn)移酶的活性. 在酶反應(yīng)體系中，分別用天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸/纈氨酸、酪氨酸和α-酮戊二酸作AspAT、IlvAT、AvtAT、TyrAT的底物, PLP(磷酸吡哆醛)為輔酶.通過TLC檢測產(chǎn)物谷氨酸的生成，判斷純化的氨基轉(zhuǎn)移酶是否具有酶活性.TLC的結(jié)果顯示，4種氨基轉(zhuǎn)移酶都具有轉(zhuǎn)氨活性(見圖3).

1：AspAT; 2：IlvAT; 3：AvtAT; 4：TyrAT圖2 4 種大腸桿菌純酶蛋白的10% SDS-PAGE

1和2：氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品; 3：未加酶的負對照; 4：酶反應(yīng)物.(a) AspAT; (b) IlvAT; (c) AvtAT; (d) TyrAT圖3 4 種大腸桿菌氨基轉(zhuǎn)移酶的酶活性TLC分析

1：空白對照；2和3分別為E. coli BL21(DE3)粗酶液和含pET23a質(zhì)粒的E. coli BL21(DE3)粗酶液; 4. AvtAT純酶;5.TyrAT純酶; 6. AspAT純酶; 7. IlvAT純酶.圖4 4種氨基轉(zhuǎn)移酶對6種非天然氨基酸底物特異性

2.2 4種氨基轉(zhuǎn)移酶對6種非天然氨基酸的催化活性使用氨基轉(zhuǎn)移酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)的方法，通過甲臜的顏色反應(yīng)調(diào)查4種氨基轉(zhuǎn)移酶催化6種非天然氨基酸(DL-高苯丙氨酸、L-正纈氨酸、L-正亮氨酸、D-正亮氨酸、L-叔亮氨酸和L-新戊基甘氨酸)的酶活性，判斷它們的非天然氨基酸底物特異性. 圖4的結(jié)果顯示: 在37 ℃、pH 8.0條件下，AvtAT基本不催化6種非天然氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移，而AspAT僅對DL-高苯丙氨酸顯示極微弱的催化反應(yīng). TyrAT能用DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正纈氨酸作底物進行的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng), 而IlvAT則催化DL-高苯丙氨酸、L-正纈氨酸、L-正亮氨酸、L-叔亮氨酸和L-新戊基甘氨酸的氨基轉(zhuǎn)移. 圖4的甲臜顏色反應(yīng)結(jié)果與TLC法測得的結(jié)果(未顯示)一致.

2.3 酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因突變與突變酶的非天然氨基酸底物特異性4種氨基轉(zhuǎn)移酶對6種非天然氨基酸的催化活性檢測發(fā)現(xiàn)，TyrAT僅催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正纈氨酸的氨基轉(zhuǎn)移. 因此，我們選擇TyrAT進行基因突變,試圖擴大這個酶的非天然氨基酸底物特異性.易錯PCR后獲得5 000個單菌落的突變體文庫，然后使用DL-高苯丙氨酸和L-正亮氨酸作碳源進行定向進化篩選. 從篩選出的菌落中抽提重組質(zhì)粒DNA并進行靶基因測序，獲得的結(jié)果見圖5. 圖5顯示: 使用DL-高苯丙氨酸作氮源定向進化，篩選出6種不同的氨基酸變異突變體，其中H-14突變體催化DL-高苯丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移的活性最高. 在用L-正亮氨酸作氮源定向進化篩選中僅獲得4種不同的氨基酸變異突變體，其中N-19突變體催化L-正亮氨酸氨基轉(zhuǎn)移的活性最高. 粗酶液活性分析發(fā)現(xiàn)H-14突變體的DL-高苯丙氨酸催化活力比野生型提高5倍，而N-19突變體的L-正亮氨酸催化活力比野生型提高14.6 倍. 在兩種非天然氨基酸的定向進化篩選中，所有的突變體都在F210位上出現(xiàn)了半胱氨酸(Cys)的替換. TLC和96孔板顏色反應(yīng)檢測10個突變酶對6種非天然氨基酸的催化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)它們?nèi)耘c野生型酶一樣,僅催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正纈氨酸的氨基轉(zhuǎn)移，并未改變該酶的非天然氨基酸底物特異性.

圖5 易錯PCR突變體文庫中篩選的TyrAT突變體

2.4 F210C突變酶的酶學(xué)特性鑒于所有的突變體都在Phe210位上出現(xiàn)了半胱氨酸(Cys)的替換，我們對F210C突變的作用進行了深入的探討. H-40突變體酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因上有3位點的堿基改變，135位的A突變?yōu)镚、629位的T突變?yōu)镚以及843位的C突變?yōu)門. A135G和C843T為同義突變，酶蛋白相應(yīng)位點Q45和R281的氨基酸仍未改換. 只有T629G位點突變導(dǎo)致酶蛋白相應(yīng)位點210上的Phe被替換成Cys. 因此，我們選用H-40突變酶來研究Phe210Cys的酶學(xué)特性，探討210位Cys替換Phe對酶活性的影響.

在不同的pH (7.0、7.5、8.0、8.5) 和不同的溫度(25、30、37、45、50、55 ℃) 條件下，使用分光光度計法檢測野生型和F210C突變酶催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正纈氨酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng).結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型和F210C突變酶在不同pH條件下沒有顯著性差異，而溫度變化則影響兩種酶催化3種非天然氨基酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng). 圖6顯示了野生型和F210C突變酶催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正纈氨酸轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的結(jié)果. 野生型TyrAT催化DL-高苯丙氨酸和L-正纈氨酸轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的最適溫度為45 ℃，催化L-正亮氨酸的最適溫度為37 ℃. 與野生型酶不同，F(xiàn)210C突變酶催化DL-高苯丙氨酸和L-正纈氨酸轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的最適溫度為37 ℃，僅催化L-正亮氨酸的最適溫度仍為37 ℃. 此外, F210C突變酶在37 ℃催化DL-高苯丙氨酸和L-正纈氨酸的轉(zhuǎn)氨活性明顯比野生型高(見圖6中(a)和(c)). 分光光度計法檢測的結(jié)果顯示，F(xiàn)210C突變酶37 ℃催化DL-高苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨的酶活力為1.36 U/mg, 是野生型酶的酶活力(0.79 U/mg)的1.72倍. 這些結(jié)果表明TyrAT 210位Phe突變?yōu)镃ys顯著地改變了酶的催化反應(yīng)最適溫度.

圖6 溫度對野生型和F210C突變酶催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-叔亮氨酸轉(zhuǎn)氨反應(yīng)速率的影響

3 討論

本實驗使用PCR技術(shù)，成功從大腸桿菌基因組DNA中克隆出4種氨基轉(zhuǎn)移酶基因aspC、ilvE、avtA和tyrB.克隆的基因插入pET23a表達質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化E.coliBL(DE3) plysS和IPTG誘導(dǎo)表達后，使用離子交換層析、疏水層析和凝膠過濾層析三步法純化，獲得30～58 mg/L電泳純酶蛋白. 4種氨基轉(zhuǎn)移酶(AspAT、AvtAT、IlvAT、TyrAT)對6種非天然氨基酸底物特異性檢測發(fā)現(xiàn)，4種氨基轉(zhuǎn)移酶中只有IlvAT催化DL-高苯丙氨酸、L-正纈氨酸、L-正亮氨酸、L-叔亮氨酸和L-新戊基甘氨酸的氨基轉(zhuǎn)移，而TyrAT僅催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正纈氨酸的氨基轉(zhuǎn)移.其他2種氨基轉(zhuǎn)移酶對6種非天然氨基酸無催化活性.

使用易錯PCR突變tyrB基因并建立突變體文庫后，用DL-高苯丙氨酸和L-正亮氨酸作氮源進行定向進化篩選，共獲得10個不同位點突變的TyrAT突變酶. 與野生型酶一樣，這些突變酶僅催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正纈氨酸的氨基轉(zhuǎn)移. 雖然突變酶的酶活性不同于野生型酶但并未改變TyrAT的非天然氨基酸底物特異性. F210C突變酶的酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，TyrAT中210位的Phe突變?yōu)镃ys后顯著地改變了酶的催化反應(yīng)最適溫度. 野生型TyrAT催化DL-高苯丙氨酸和L-叔亮氨酸的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)最適溫底為45 ℃，而F210C突變酶催化反應(yīng)的最適溫度為37 ℃. TyrAT 酶210位氨基酸的改變(Phe→Cys)能有效降低催化反應(yīng)的最適溫度. 很明顯，利用易錯PCR和定向進化技術(shù)擴大TyrAT酶的非天然氨基酸底物特異性仍是一個需要深入探索的課題.

圖7a顯示芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的三維結(jié)構(gòu)，Ser293為該酶的催化基團[26]. 依據(jù)野生型芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3TAT)，利用Discovery Studio 2.5軟件進行分析發(fā)現(xiàn)，H-14突變酶的L108V和V145M分別位于底物結(jié)合位點Ser109和Arg292、Ser296、Ser297附近，而它的N243S突變位點位于輔酶結(jié)合位點Ser255和Lys258附近. 這些突變可能有利于DL-高苯丙氨酸在活性袋內(nèi)結(jié)合和輔酶的穩(wěn)定，從而使突變酶的活力高于野生型.N-19突變酶的T186A突變位點位于底物識別位點Arg386和Phe360附近，氨基酸殘基的親水性和側(cè)鏈變小可能有利于α-酮酸底物的結(jié)合，使突變酶對L-正亮氨酸的催化活力高于野生型. 所有10個突變酶的F210位都發(fā)生Cys替換(見圖7b)，但都沒有在S293催化位點發(fā)生突變. F210C突變位點位于底物識別位點Asp222和Leu39附近，Cys替換Phe后可能改變活性袋的柔性. 210位的Cys替換Phe有利于非天然氨基酸底物在活性袋內(nèi)運動，使底物分子容易調(diào)整至正確的催化位置，從而降底酶的催化反應(yīng)最適溫度.

圖7 芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的三維結(jié)構(gòu)與F210C突變示意圖