何文棟 蘇雯清 韋坤華 奎玲 王碩 龔小妹 楊曉男 繆劍華

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）10-1196-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.07

摘 要 目的：研究染料木素對(duì)人鼻咽癌CNE1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用并預(yù)測(cè)其可能的作用靶點(diǎn)。方法：采用CCK-8法檢測(cè)0（空白對(duì)照）、12.5、25、50、100、150 ?mol/L染料木素分別作用24、48、72 h對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響;分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0（空白對(duì)照）、15、30、60 ?mol/L染料木素作用24 h對(duì)CNE1細(xì)胞周期、凋亡的影響;采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)0（空白對(duì)照）、10、20、30 ?mol/L染料木素作用24 h對(duì)CNE1細(xì)胞遷移能力的影響。采用高通量測(cè)序法挖掘0（空白對(duì)照）、30 ?mol/L染料木素作用24 h后CNE1細(xì)胞中的差異基因，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-qPCR）對(duì)上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)差異基因mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：與空白對(duì)照比較，12.5、25、50、100、150 ?mol/L染料木素對(duì)細(xì)胞的增殖均有顯著的抑制作用（P<0.01），且呈濃度-時(shí)間-效應(yīng)趨勢(shì);15、30 ?mol/L染料木素可使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期（P<0.05或P<0.01），30、60 ?mol/L染料木素可使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期并顯著促進(jìn)其凋亡（P<0.05或P<0.01）;10、20、30 ?mol/L染料木素可顯著抑制細(xì)胞的遷移能力（P<0.01）。高通量測(cè)序共挖掘出2 271個(gè)差異基因（padj<0.05），其中1 154個(gè)基因上調(diào)、1 117個(gè)基因下調(diào);結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果共篩選出p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、PI3K、AKT等8個(gè)潛在靶點(diǎn)差異基因。經(jīng)RT-qPCR法驗(yàn)證，其中p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、AKT等7個(gè)潛在靶點(diǎn)差異基因mRNA的表達(dá)均顯著下調(diào)（P<0.05），與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。結(jié)論：染料木素能有效抑制人鼻咽癌CNE1細(xì)胞的生長(zhǎng);其抗鼻咽癌機(jī)制可能與抑制突變型p53基因的表達(dá)，恢復(fù)野生型P53蛋白功能以及抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路的活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 染料木素;人鼻咽癌CNE1細(xì)胞;高通量測(cè)序;突變型p53基因;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路

Inhibitory Effect and Target Prediction of Genistein on the Growth of Human Nasopharyngeal Carcinoma CNE1 Cells

HE Wendong1，SU Wenqing2，WEI Kunhua3，4，KUI Ling5，WANG Shuo6，GONG Xiaomei6，YANG Xiaonan3，4，MIAO Jianhua1，2，3，4，6（1. Pharmacy College， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China;2. Pharmacy College， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China; 3. Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China; 4. Guangxi Engineering Research Center of TCM Resource Intelligence Creation， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China; 5. Pharmacy College， Jiangsu University， Jiangsu Zhengjiang 212013， China; 6. National Engineering Laboratory of Southwest Endangered Medicinal Resources Development， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the inhibitory effects of genistein on the growth of human nasopharyngeal carcinoma. CNE1 cells and predict its potential target. METHODS： CCK-8 method was used to test the effects of 0（blank control）， 12.5， 25， 50， 100， 150 ?mol/L genistein on the proliferation of CNE1 cells after treated for 24， 48， 72 h. Flow cytometry was carried out to detect the effects of 0（blank control）， 15， 30， 60 ?mol/L genistein on the cell cycle and apoptosis of CNE1 cells after treated for 24 h. Scratch test was used to investigate the effects of 0（blank control）， 10， 20， 30 ?mol/L genistein on the migration ability of CNE1 cells after treated for 24 h. High throughput sequencing was conducted to discover the differential genes in CNE1 cells after treated with 0 （blank control）， 30 ?mol/L genistein for 24 h. RT-qPCR assay was adopted to verify the mRNA expression of related differential genes in above trials. RESULTS： Compared with blank control，12.5， 25， 50， 100， 150 ?mol/L genistein showed significant inhibitory effect on the proliferation of CNE1 cells （P<0.01）， in a concentration- time-effect manner;15， 30 ?mol/L genistein could arrest CNE1 cell cycle at G0/G1 stage （P<0.05 or P<0.01）; 30， 60 ?mol/L could arrest CNE1 cell cycle at G2/M stage and promoted cell apoptosis （P<0.05 or P<0.01）. 10， 20， 30 ?mol/L genistein could significantly inhibit the migration ability of CNE1 cells （padj<0.01）. High throughput sequencing revealed a total of 2 271 differentialgenes （P<0.05）， 1 154 of which were up-regulated while 1 117 of which were down-regulated; 8 potential target genes， including p53， p21， STC2， FGF2， CDK6， CYCLIN D， PI3K， AKT， were screened by cell experiment. After validated by RT-qPCR assay， mRNA expression of? p53， p21， STC2， FGF2， CDK6， CYCLIN D and AKT were significantly down-regulated （P<0.05）， which consistent with the sequencing results. CONCLUSIONS： Genistein can effectively inhibit the growth of human nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells， the mechanism of which may associated with inhibiting the expression of mutant gene p53， restoring the function of wild-type P53 protein and inhibiting the activity of PI3K/Akt pathway.

KEYWORDS? ?Genistein; Human nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells; High throughput sequencing; Mutant gene p53; PI3K/Akt pathway

染料木素又稱染料木黃酮、金雀異黃酮，分子式為C15H10O5，化學(xué)名為4′，5，7-三羥基異黃酮，為淡黃至淺褐色粉末，溶于二甲基亞砜和乙醇，是一種天然的異黃酮類化合，存在于千斤拔、淡豆豉、雞血藤等多種天然藥物中，其結(jié)構(gòu)與動(dòng)物雌激素雌二醇相似，故有植物雌激素之稱[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，染料木素具有清除自由基、抗氧化、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、防治阿爾茨海默病等多種作用[4-7]。除此之外，染料木素還因具有顯著的抗腫瘤作用而備受關(guān)注，如其對(duì)乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、口腔癌、喉癌、甲狀腺癌等多種癌癥均有抑制作用[8-15]。

鼻咽癌是發(fā)病率最高的頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病地區(qū)主要集中在我國(guó)廣東、廣西、福建等南部地區(qū)以及東南亞地區(qū)，具有顯著的地域性特征[16]。鼻咽癌的發(fā)生主要是因?yàn)楦腥玖薊B病毒，我國(guó)2014年鼻咽癌每十萬(wàn)人口的發(fā)病率和死亡率分別為3.26和1.77，顯著高于世界平均水平[17]。由于鼻咽癌發(fā)病部位深，且與眾多重要器官相近，難以手術(shù)切除，放、化療依然是鼻咽癌的主要治療手段，但其具有較強(qiáng)的副作用，臨床治療效果有限[18]。據(jù)相關(guān)研究表明，染料木素對(duì)雌、雄大鼠均無(wú)生殖毒性，無(wú)致畸性，且對(duì)子代大鼠生長(zhǎng)、發(fā)育的毒性較小，安全耐受，是一種安全性較高的抗腫瘤藥物[19-22]。

高通量測(cè)序可以準(zhǔn)確分析出腫瘤細(xì)胞和組織在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上的基因圖譜，進(jìn)而為不同癌癥的治療提供更準(zhǔn)確的靶點(diǎn)信息[23]。鑒于此，本研究擬以人鼻咽癌CNE1細(xì)胞為模型，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)等方法考察染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和遷移能力的影響，并與高通量測(cè)序相結(jié)合，初步考察染料木素抗鼻咽癌的作用及其潛在靶點(diǎn)，再采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-qPCR）驗(yàn)證潛在靶點(diǎn)mRNA的表達(dá)情況，為染料木素在抗鼻咽癌領(lǐng)域的進(jìn)一步研究、利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

M200 Pro型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司;GNP-980型恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精密儀器儀表公司;guava easyCyte型流式細(xì)胞儀購(gòu)自默克化工技術(shù)（上海）有限公司;IX73型顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;T100型PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;QuantStudio 3型RT-qPCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;BGIDL-50型全自動(dòng)樣品加載系統(tǒng)、BGISEQ-500RS型基因測(cè)序儀均購(gòu)自深圳華大智造科技股份有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

染料木素對(duì)照品（批號(hào)RFS-R00111812016，純度>98%）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;含0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化液（批號(hào)20181218）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;CCK-8試劑盒（批號(hào)20200720）購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)液、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20201118）、熒光素FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20200610）均購(gòu)自江蘇凱基生物科技股份有限公司;總RNA提取試劑盒（批號(hào)10029777）購(gòu)自美國(guó)BioLabs公司;MGIEasy RNA文庫(kù)制備試劑盒（批號(hào)A0002）、MGIEasy DNA純化磁珠（批號(hào)A0212）和BGISEQ-500RS高通量測(cè)序試劑盒（批號(hào)A20）均購(gòu)自深圳華大智造科技股份有限公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)N20426）、RT-qPCR反應(yīng)試劑盒（批號(hào)O10318）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人鼻咽癌CNE1細(xì)胞（批號(hào)CC-Y1118）購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

將CNE1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。每3天傳代1次，每次用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化液消化3 min后，收集細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。待傳至10～20代時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響

采用CCK-8法進(jìn)行考察。將CNE1細(xì)胞用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成密度為1×104 mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將其分為空白對(duì)照組（0 ?mol/L）和不同濃度染料木素組（12.5、25、50、100、150 ?mol/L），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并另設(shè)調(diào)零孔。分別于加藥干預(yù)24、48、72 h時(shí)，在每孔中加入CCK-8溶液10 ?L，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值）/（空白對(duì)照組A值-調(diào)零孔A值）×100%。使用SPSS 21.0軟件分別計(jì)算上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)抑制濃度（IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定。將CNE1細(xì)胞用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成密度為1.5×105 mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將其分為空白對(duì)照組（0 ?mol/L）和不同濃度染料木素組（15、30、60 ?mol/L，以CCK-8實(shí)驗(yàn)48 h的IC50為中劑量組、1/2倍 IC50為低劑量組、2倍IC50為高劑量組），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加藥干預(yù) 24 h后，用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化液消化并收集細(xì)胞，按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒方法進(jìn)行固定、染色，然后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。使用ModFit 5.0軟件進(jìn)行圖片分析，計(jì)算各個(gè)周期細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞按“2.3”項(xiàng)下方法接種、分組和給藥。加藥干預(yù) 24 h后，用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化液消化并收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒方法進(jìn)行染色，然后使用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞的凋亡情況，以Q2、Q3象限細(xì)胞所占比例之和為凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞遷移的影響

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。將CNE1細(xì)胞用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成密度為4×105 mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將其分為空白對(duì)照組（0 ?mol/L）和不同濃度染料木素組（10、20、30 ?mol/L，為避免過(guò)高劑量使細(xì)胞脫落影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，以CCK-8實(shí)驗(yàn)48 h的IC50值為高劑量組、1/2倍IC50為中劑量組、1/3倍IC50為低劑量組）。常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔的90%時(shí)，在6孔板的后側(cè)用標(biāo)記筆劃3條等距黑線，然后用10 ?L槍頭在培養(yǎng)孔內(nèi)劃3條平行等距的線垂直于黑線，再給藥干預(yù)。分別在加藥干預(yù)0、24 h時(shí)，每組隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行拍照。使用Image J 1.48軟件分別測(cè)定劃痕面積，取平均值，然后計(jì)算傷口愈合率：傷口愈合率（%）=（0 h時(shí)的平均劃痕面積-24 h時(shí)的平均劃痕面積）/ 0 h時(shí)的平均劃痕面積×100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.6 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞中基因表達(dá)的影響

將CNE1細(xì)胞用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成密度為3×105 mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和30 ?mol/L染料木素組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加藥干預(yù)24 h后，常規(guī)消化、收集細(xì)胞。按照總RNA提取試劑盒方法提取細(xì)胞中總RNA，并按照MGIEasy RNA文庫(kù)制備試劑盒方法對(duì)總RNA進(jìn)行富集、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和純化等操作后得到RNA文庫(kù)，再對(duì)RNA文庫(kù)進(jìn)行均一化、環(huán)化、酶切消化和純化后，按照高通量測(cè)序試劑盒方法對(duì)其進(jìn)行芯片加載和高通量測(cè)序，以得到空白對(duì)照組和30 ?mol/L染料木素組細(xì)胞中基因的堿基序列（即原始測(cè)序數(shù)據(jù)）。用FastQC 0.11.9軟件對(duì)堿基序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，用Trimmomatic 0.36軟件去除與接頭匹配率超過(guò)30%的測(cè)序片段并過(guò)濾掉長(zhǎng)度低于50 bp的片段后，再用Botie2 2.4.2軟件將質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)映射到人類參考基因組上，并計(jì)算人類參考基因組中各基因的表達(dá)量（記為“Count”值）。利用DESeq2 3.13軟件計(jì)算分析各基因表達(dá)量的差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值[log2（Fold change）]，且得到對(duì)應(yīng)的padj值（矯正后的P值）， 以log2（Fold change）<0為表達(dá)下調(diào)，log2（Fold change）>0為表達(dá)上調(diào)，以log2（Fold change）>1且padj<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因，利用R語(yǔ)言包中的ggplot2包繪制差異基因火山圖。結(jié)合上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出調(diào)控相關(guān)過(guò)程的8個(gè)差異基因以進(jìn)行后續(xù)研究，并采用在線網(wǎng)站Morpheus（https：//software.broadinstitute.org/morpheus/）以log2Count值繪制熱圖。

2.7 差異基因表達(dá)的驗(yàn)證

采用RT-qPCR法進(jìn)行驗(yàn)證。按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、給藥、收集和提取細(xì)胞中總RNA。將總RNA按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以cDNA為模板使用SYBR Green Ⅰ法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。RT-qPCR反應(yīng)體系（共20 ?L）包括cDNA模板1 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.4 ?L，qPCR反應(yīng)緩沖液（2×）10 ?L，熒光染料（50×）0.4 ?L，無(wú)酶水7.8 ?L。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃變性5 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量（將空白對(duì)照組的值定義為1）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1（引物序列由本課題組使用Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成）。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

加藥干預(yù)24、48、72 h后，與空白對(duì)照組比較，12.5、25、50、100、150 ?mol/L染料木素組細(xì)胞的增殖抑制率均顯著升高（P<0.01）。在相同濃度染料木素作用下，細(xì)胞的增殖抑制率有隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高的趨勢(shì);在加藥干預(yù)相同時(shí)間時(shí)，細(xì)胞的增殖抑制率有隨染料木素濃度增加而升高的趨勢(shì)。藥物作用24、48、72 h時(shí)的IC50分別為56.32、34.13、21.90 ?mol/L?？梢?jiàn)，染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且該作用呈濃度-時(shí)間-效應(yīng)趨勢(shì)。不同濃度染料木素作用不同時(shí)間后對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞周期的影響結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，15、30 ?mol/L染料木素組G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05或P<0.01），但60 ?mol/L染料木素組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01）;15、30、60 ?mol/L染料木素組S期細(xì)胞比例均顯著降低（P<0.01）;30、60 ?mol/L染料木素組G2/M期細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與15 ?mol/L染料木素組比較，30、60 ?mol/L染料木素組G2/M期細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05或P<0.01），但60 ?mol/L染料木素組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01）;與30 ?mol/L染料木素組比較，60 ?mol/L染料木素組G0/G1細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），但G2/M期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01）。不同濃度染料木素作用24 h后對(duì)CNE1細(xì)胞周期分布影響的流式細(xì)胞圖見(jiàn)圖1，細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞凋亡的影響

空白對(duì)照組和15、30、60 ?mol/L染料木素組細(xì)胞的凋亡率分別為（4.37±2.02）%、（13.06±3.96）%、（23.28±6.87）%、（29.41±7.43）%。與空白對(duì)照組比較，15、30、60 ?mol/L染料木素組細(xì)胞的凋亡率均有不同程度升高，且具有一定的濃度依賴性趨勢(shì)，其中30、60 ?mol/L染料木素組細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P<0.05或P<0.01）。不同濃度染料木素作用24 h后對(duì)CNE1凋亡影響的流式細(xì)胞圖見(jiàn)圖2。

3.4 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞遷移能力的影響結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，10、20、30 ?mol/L染料木素組細(xì)胞的傷口愈合率均顯著降低（P<0.01）;與10 ?mol/L染料木素組比較，20 ?mol/L染料木素組的傷口愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但30 ?mol/L染料木素組的傷口愈合率則顯著降低（P<0.01）;與20 ?mol/L組比較，30 ?mol/L染料木素組的傷口愈合率也顯著降低（P<0.01）。不同濃度染料木素作用24 h后對(duì)CNE1細(xì)胞遷移能力影響的顯微圖見(jiàn)圖3，傷口愈合率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.5 染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞中基因表達(dá)的影響

經(jīng)染料木素干預(yù)后，產(chǎn)生了眾多差異基因，如圖5A所示（圖中，每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)基因，灰色代表無(wú)顯著變化的基因，紅色代表顯著上調(diào)的基因，藍(lán)色代表顯著下調(diào)的基因，且差異越顯著其離散程度越高）。與空白對(duì)照組比較，30 ?mol/L染料木素組細(xì)胞中共有2 271個(gè)差異基因（padj<0.05），其中有1 154個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)、 1 117個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)合本研究中相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，篩選出p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYLIN D、PI3K、AKT等8個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，這8個(gè)基因表達(dá)量趨勢(shì)如圖5B所示（圖中，從藍(lán)色到紅色代表了差異基因表達(dá)量從低到高的變化趨勢(shì)）。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，30 ?mol/L染料木素組細(xì)胞中上述8個(gè)基因的表達(dá)均呈下調(diào)的趨勢(shì)。

3.6 CNE1細(xì)胞中8個(gè)差異基因mRNA表達(dá)情況的驗(yàn)證結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，30 ?mol/L染料木素組細(xì)胞中上述8個(gè)差異基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均有不同程度降低，其中p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、AKT等7個(gè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞中8個(gè)差異基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

本研究結(jié)果顯示，12.5～150 ?mol/L染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞的增殖均有不同程度的抑制作用，10～30 ?mol/L染料木素可以抑制CNE1細(xì)胞的遷移，15～60 ?mol/L染料木素可不同程度地促進(jìn)CNE1細(xì)胞凋亡，且可以阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。其中，30 ?mol/L的染料木素可以使CNE1細(xì)胞的G0/G1期和G2/M期都發(fā)生阻滯;而當(dāng)染料木素濃度提高到60 ?mol/L時(shí)，CNE1細(xì)胞則大量阻滯于G2/M期，這可能是由于高濃度的染料木素對(duì)CNE1細(xì)胞G2/M期相關(guān)基因或蛋白的調(diào)控作用更加顯著所造成的，但具體的作用過(guò)程及機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

本研究用30 ?mol/L的染料木素干預(yù)CNE1細(xì)胞后共獲得2 271個(gè)差異基因，并用RT-qPCR法驗(yàn)證了其中8個(gè)基因的mRNA表達(dá)與測(cè)序結(jié)果相符，這8個(gè)基因也在染料木素對(duì)鼻咽癌CNE1細(xì)胞的抑制作用中發(fā)揮重要作用。p53基因已被證實(shí)在抗腫瘤方面作用明顯，通常過(guò)表達(dá)的p53基因會(huì)通過(guò)調(diào)控其下游基因的表達(dá)，直接或間接參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)展和死亡過(guò)程，其主要通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抗腫瘤作用[24]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，在染料木素干預(yù)后的CNE1細(xì)胞中，p53基因的表達(dá)水平并沒(méi)有升高反而顯著降低，因此筆者推測(cè)p53基因可能在CNE1細(xì)胞中發(fā)生了突變。已有研究表明，p53基因突變?cè)谌祟惸[瘤細(xì)胞中非常常見(jiàn)，約有50%的人類腫瘤細(xì)胞都會(huì)發(fā)生p53基因突變，30%～50%的頭頸部腫瘤患者細(xì)胞中會(huì)發(fā)生p53基因突變[25-26]。與野生型p53基因不同，突變型p53基因并沒(méi)有表現(xiàn)出抗癌的作用，反而會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，加快腫瘤發(fā)展進(jìn)程，表現(xiàn)出了與野生型p53基因完全相反的作用[27-29]。研究表明，野生型P53蛋白可以促進(jìn)E3型泛素化連接酶MDM2的表達(dá)，而后者可使P53蛋白泛素化降解;然而，突變型P53蛋白不會(huì)激活MDM2，因此導(dǎo)致突變型P53蛋白積聚于腫瘤細(xì)胞內(nèi)[30]。又有報(bào)道證實(shí)，抑制突變型p53基因的表達(dá)或使突變型P53蛋白與某些小分子結(jié)合，使突變型P53蛋白發(fā)生穩(wěn)定折疊而恢復(fù)其野生型P53蛋白的功能后，可達(dá)到抗腫瘤的目的[31-32]。因此筆者推測(cè)，在CNE1細(xì)胞中突變型p53基因編碼翻譯的突變型P53蛋白無(wú)法激活MDM2，導(dǎo)致其積聚于細(xì)胞內(nèi)難以降解，而染料木素能抑制細(xì)胞中突變型p53基因表達(dá)，甚至與突變型P53蛋白結(jié)合，使突變型P53蛋白發(fā)生折疊而恢復(fù)了野生型P53蛋白的功能，從而阻滯CNE1細(xì)胞周期、誘導(dǎo)其凋亡，最終發(fā)揮抗鼻咽癌的作用。而人類正常細(xì)胞不表達(dá)突變型p53基因[33-34]，這意味著染料木素在抑制突變型p53基因表達(dá)的同時(shí)不會(huì)對(duì)正常組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，因此該化合物針對(duì)突變型p53基因靶向治療鼻咽癌有望得以實(shí)現(xiàn)。

STC2基因是錫鈣素家族的成員，STC2以及其所編碼的錫鈣素2（STC2）蛋白具有調(diào)節(jié)鈣和磷酸鹽分泌的重要作用[35]。目前，已有研究證實(shí)，STC2的異常表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后不良存在一定關(guān)系[36]。STC2蛋白是人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲的正向調(diào)節(jié)劑;而成細(xì)胞纖維生長(zhǎng)因子2（FGF2）作為TGF家族的一員，與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān);STC2、FGF2蛋白對(duì)磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）等PI3K/Akt通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)均有正向調(diào)節(jié)作用，可增強(qiáng)頭頸部鱗狀細(xì)胞HNSCC的增殖、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移能力[37-40]。而本研究結(jié)果表明，染料木素可以顯著抑制CNE1細(xì)胞的增殖和遷移，且可以顯著降低CNE1細(xì)胞中STC2、FGF2基因的表達(dá)，而調(diào)控PI3K/Akt通路的關(guān)鍵基因AKT、PI3K的表達(dá)也有不同程度的下降，因此筆者推測(cè)是STC2、FGF2基因表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致了PI3K/Akt通路活性被抑制。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）家族和D型細(xì)胞周期蛋白（CYCLIN D）是PI3K/Akt通路的下游蛋白，CDK家族依賴CYCLIN D與其結(jié)合才能被激活，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄、生長(zhǎng)的作用[41-42]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，染料木素可直接與CDK6/CYCLIN D復(fù)合物結(jié)合，從而直接發(fā)揮抗鼻咽癌的作用[43]。本研究已經(jīng)證實(shí)，經(jīng)染料木素干預(yù)后，CNE1細(xì)胞中CDK6、CYCLIN D基因表達(dá)均顯著下調(diào)，細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，這可能是CDK6基因表達(dá)下調(diào)直接導(dǎo)致了CDK6激酶的表達(dá)水平降低;同時(shí)，CYCLIN D基因調(diào)控CYCLIN D的表達(dá)，使蛋白表達(dá)水平降低從而抑制CDK6激酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期被阻滯、轉(zhuǎn)錄受阻，最終使CNE1細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。因此，染料木素的抗鼻咽癌機(jī)制可能與其抑制PI3K/Akt通路活性有關(guān)。已有的研究表明，染料木素可以通過(guò)調(diào)控p21、ART、p15等基因mRNA的表達(dá)和凋亡調(diào)節(jié)劑相關(guān)X蛋白、胱天蛋白酶8（Caspase-8）、裂解型胱天蛋白酶9（Cleaved-caspase-9）等蛋白靶點(diǎn)，參與鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和發(fā)展的過(guò)程，已確定染料木素能通過(guò)抑制Hedgehog通路活性發(fā)揮抗鼻咽癌作用[44-45]。p21可以參與多條信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，如P53通路和PI3K/Akt通路，其可正向調(diào)控P53通路，負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt通路[46-47]。而本研究結(jié)果顯示，p21基因表達(dá)量顯著下降，與p53基因表達(dá)趨勢(shì)相同，提示其可能是受到P53通路的調(diào)控。

綜上所述，本研究除了通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了染料木素抗鼻咽癌的活性外，還通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)和RT-qPCR方法相互印證，挖掘出了p53、STC2、FGF2、AKT、PIK、CDK6和CYCLIN D等抗鼻咽癌的相關(guān)靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)染料木素可能通過(guò)抑制突變型基因p53的表達(dá)，恢復(fù)野生型P53蛋白的功能，從而發(fā)揮抗鼻咽癌的作用。筆者還在mRNA水平上初步證明了染料木素可以抑制PI3K/Akt通路的活性，從而抑制鼻咽癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。雖然本研究只涉及了基因水平，仍需蛋白水平和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，但本研究依托高通量測(cè)序技術(shù)挖掘出了新的染料木素抗鼻咽癌靶點(diǎn)和通路，也為該化合物的后續(xù)研究以及鼻咽癌的治療提供了理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-02-04 修回日期：2021-03-02）

（編輯：林 靜）