熊 雪，李 鵬，向 準(zhǔn)▲，趙曉朋，汪建文

(1貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009；2貴陽學(xué)院，貴州 貴陽 550002；3貴州科學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

長(zhǎng)根菇(Oudemansiellaradicata)屬于白蘑科、奧德蘑屬，又名長(zhǎng)根奧德蘑、長(zhǎng)根金錢菌、長(zhǎng)根小奧德蘑等[1-2]。其菌肉白色而薄，味道鮮美，口感細(xì)嫩，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素等營養(yǎng)成分，深受消費(fèi)者喜歡[1-3]。同時(shí)其特有的長(zhǎng)根菇素對(duì)高血壓患者有明顯的降低血壓的作用，其多糖成分對(duì)腫瘤有明顯的抑制作用[3-6]，是一種優(yōu)質(zhì)的食藥用真菌[7]，具有極大的研究?jī)r(jià)值。長(zhǎng)根菇分布地廣，在我國云南、河北、吉林、江蘇、安徽、福建、廣西、四川、西藏等大部分地區(qū)均有分布[8]。但由于長(zhǎng)根菇栽培中需培土栽培，可重復(fù)性差、產(chǎn)量較低、病蟲害嚴(yán)重，目前還很難實(shí)行規(guī)?；耘郲8]。因此，本文探索不同碳源、氮源對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響，挑選較為適宜其生長(zhǎng)的營養(yǎng)條件、溫度條件，為培育高質(zhì)量的長(zhǎng)根菇菌絲奠定基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)根菇的規(guī)?；a(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試長(zhǎng)根菇菌株保藏于貴州省生物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B110 mg，瓊脂粉20 g，去離子水1000 mL，pH自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素B110 mg，瓊脂20 g，去離子水1000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

制備長(zhǎng)根菇活化培養(yǎng)基平板10個(gè)，無菌環(huán)境下將試管母種接種到長(zhǎng)根菇活化培養(yǎng)基平板上(接種至平板的中心位置)，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化備用。

1.3.2 不同碳源試驗(yàn)

以長(zhǎng)根菇基礎(chǔ)碳源培養(yǎng)基為對(duì)照，分別以等量果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，作為不同碳源培養(yǎng)基，每處理5次重復(fù)，將菌絲長(zhǎng)至平板三分之二的活化平板用5 mm的打孔器將菌落打成圓片，然后接種于不同碳源平板的中心位置，25 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)后開始采用劃線法每日標(biāo)記菌落直徑(十字交叉法)，培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿或停止生長(zhǎng)，測(cè)量菌落直徑。菌絲鋪滿平板時(shí)，觀察記錄菌落的菌絲形態(tài)、色澤、菌落形狀、菌絲長(zhǎng)勢(shì)和邊緣特征等，用“+”“-” 表示菌絲的長(zhǎng)勢(shì)，“+” 越多表示菌絲生長(zhǎng)得越好、越健壯、均勻，“-”表示菌絲不生長(zhǎng)。

1.3.3 不同氮源試驗(yàn)

以等量的蛋白胨、酵母膏、谷氨酸、硝酸鉀、尿素分別代替基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基中的氮源硫酸銨，每處理5次重復(fù)。后續(xù)操作同1.3.2。

1.3.4 不同碳氮比試驗(yàn)

在固定溫度培養(yǎng)基中調(diào)整碳氮比進(jìn)行試驗(yàn)，碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，碳源濃度為2%，添加不同重量蛋白胨，配成碳氮比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1和100∶1(蛋白胨含碳量忽略不計(jì))的培養(yǎng)基，每處理5次重復(fù)。后續(xù)操作同1.3.2。

1.3.5 不同溫度試驗(yàn)

將菌絲長(zhǎng)至平板三分之二的活化平板用5 mm的打孔器將菌落打成圓片，然后接種于長(zhǎng)根菇活化培養(yǎng)基上，將接種好的平板分別放置在15 ℃、18 ℃、20 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理5次重復(fù)。其余操作同1.3.2。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCLE及PASW Statistics 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響

如表1所示，對(duì)于試驗(yàn)所選5種不同碳源，長(zhǎng)根菇接種培養(yǎng)48 h后均能萌發(fā)，且正常吸收，菌絲鋪滿平板后為絨毛狀白色圓形菌落。但不同碳源培養(yǎng)下日均生長(zhǎng)速度不同，蔗糖、乳糖為碳源培養(yǎng)時(shí)，速度顯著快于其他處理，平板鋪滿時(shí)間也最短，菌絲萌發(fā)后鋪滿平板僅需8 d，且長(zhǎng)勢(shì)最佳；碳源為果糖時(shí)，生長(zhǎng)速度顯著低于其他處理，鋪滿時(shí)間最長(zhǎng)(11 d)，且長(zhǎng)勢(shì)最差。整體呈現(xiàn)蔗糖(10.00 mm/d)>乳糖(9.96 mm/d)>麥芽糖(8.81 mm/d)>葡萄糖(8.50 mm/d)>果糖(7.60 mm/d)的趨勢(shì)。綜上所述，在5種供試碳源中，長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)最佳碳源為蔗糖，其次為乳糖、麥芽糖。

表1 不同碳源對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effect of different carbon sources on the mycelial growth of Oudemansiella radicata

2.2 不同氮源對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響

如表2所示，長(zhǎng)根菇菌絲在所選6種氮源培養(yǎng)下，菌落表現(xiàn)有差異。氮源為尿素時(shí)，菌絲不生長(zhǎng)，其余5種氮源培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)48 h后菌絲萌發(fā)，菌落為絨毛狀白色圓形菌落。菌絲日均生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)出酵母膏(10.06 mm/d)>硝酸鉀(9.89 mm/d)>蛋白胨(9.88 mm/d)>谷氨酸(9.67 mm/d)>硫氨酸(8.87 mm/d)>尿素(0 mm/d)。其中，菌落長(zhǎng)勢(shì)最好的為酵母膏，萌發(fā)后鋪滿平板時(shí)間也最短(8 d)；菌落長(zhǎng)勢(shì)較差的為硫酸銨，鋪滿平板時(shí)間最長(zhǎng)(10天)。綜上可知，長(zhǎng)根菇的最佳氮源為酵母膏，其次為硝酸鉀和蛋白胨，不能吸收尿素。

表2 不同氮源對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of different nitrogen sources on the mycelial growth of Oudemansiella radicata

2.3 不同碳氮比對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響

結(jié)合表3、圖1可知，在所設(shè)10∶1～100∶1碳氮配比范圍間，長(zhǎng)根菇接種培養(yǎng)48 h后均可萌發(fā)，長(zhǎng)滿平板后菌落呈絨毛狀白色圓形菌落。菌絲生長(zhǎng)速度存在一定差異，隨著碳源的增加，整體呈波浪式增長(zhǎng)。碳氮比為40∶1、60∶1、100∶1時(shí)，菌落長(zhǎng)勢(shì)較好且快，僅需8 d鋪滿平板；其余處理下菌落長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)，速度較慢，需9 d方能鋪滿平板。在碳氮比為40∶1時(shí)菌絲日均生長(zhǎng)速度最快(11.53 mm/d)，在碳氮比為10∶1時(shí)菌絲日均生長(zhǎng)速度最慢(9.14 mm/d)。綜上可知，碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨時(shí)，長(zhǎng)根菇對(duì)碳氮配比的要求不嚴(yán)，均能較快的生長(zhǎng)，其中最佳碳氮比為40∶1。

表3 不同碳氮比對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effect of different carbon-nitrogen ratios on the mycelial growth of Oudemansiella radicata

圖1 不同碳氮比對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.1 Effect of different carbon-nitrogen ratios on the mycelial growth speed of Oudemansiella radicata

2.4 不同溫度對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響

如表4、圖2所示，在不同溫度條件下，長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)過程表現(xiàn)出明顯差異。隨著溫度的增加，菌絲生長(zhǎng)速度整體呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，其中23 ℃下菌絲生長(zhǎng)最快(8.84 mm/d)，15 ℃下菌絲生長(zhǎng)最慢(6.63 mm/d)。15～20 ℃下，菌絲生長(zhǎng)慢、長(zhǎng)勢(shì)差，萌發(fā)后所需鋪滿時(shí)間也較長(zhǎng)。23～25 ℃條件下，菌絲僅需48 h方可萌發(fā)，萌發(fā)后10 d內(nèi)鋪滿平板，整體長(zhǎng)勢(shì)較好。27～30 ℃條件下，菌絲萌發(fā)時(shí)間晚，但生長(zhǎng)速度快，整體長(zhǎng)勢(shì)一般。綜上可知，長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)對(duì)溫度條件的適應(yīng)范圍較廣，15～30 ℃均能正常萌發(fā)，且生長(zhǎng)速度較快，但結(jié)合菌絲長(zhǎng)勢(shì)及萌發(fā)時(shí)間可得，最適宜長(zhǎng)根菇生長(zhǎng)的溫度為23～25 ℃。

表4 不同溫度對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.4 Effect of different temperature on the mycelial growth of Oudemansiella radicata

圖2 不同溫度對(duì)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different temperature on the mycelial growth of Oudemansiella radicata

3 結(jié)論與討論

在以往國內(nèi)學(xué)者對(duì)長(zhǎng)根菇的研究中，或深或淺都有提到長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)階段對(duì)碳氮源的吸收較為廣泛[9-10]。本文也證實(shí)了這一點(diǎn)，在試驗(yàn)所選5種碳源、7種氮源中，除氮源尿素外，長(zhǎng)根菇菌絲對(duì)其他氮源都能較好的吸收，且對(duì)酵母膏的吸收是最好的，這一點(diǎn)同李建宗的研究結(jié)果相同，不同的是長(zhǎng)根菇菌絲對(duì)碳源乳糖的吸收與否存在較大差異，這很有可能因地方上長(zhǎng)根菇品種上的差異造成的，但具體原因需更進(jìn)一步的研究。樊有賦等人研究長(zhǎng)根菇鱗柄變種的營養(yǎng)條件得到，長(zhǎng)根菇鱗柄變種同樣能吸收碳源乳糖，且最佳氮源為硫酸銨和牛肉膏[11]，這同本文及李建宗的研究結(jié)果有相似也有差異的地方，品種可能是造成這類差異的首要原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)對(duì)碳氮比要求不嚴(yán)，碳氮比10∶1～100∶1均能較好、較快的生長(zhǎng)，最適碳氮比為40(葡萄糖)∶1(蛋白胨)，且菌絲在15～30 ℃下均能萌發(fā)且較快生長(zhǎng)，有較廣的適溫范圍。綜上說明長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)對(duì)碳氮源的種類及配比選擇都較為廣泛，對(duì)溫度的適應(yīng)范圍也廣，在生產(chǎn)中，該菌種母種生產(chǎn)應(yīng)是易于把握的。但實(shí)際上長(zhǎng)根菇目前仍無法實(shí)現(xiàn)較為大規(guī)模的種植推廣，這難關(guān)很大可能集中在子實(shí)體原基的形成和子實(shí)體的生長(zhǎng)上，具體需要更進(jìn)一步對(duì)長(zhǎng)根菇栽培技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。