王小波，杜洪志，王先菊，蒙燕瑤，石金錢，陳志琳，李 瑋

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025)

苗藥萵比苷(商陸)為商陸科植物商陸PhytoluaccaacinosaRoxb.或垂序商陸PhytolaccaamericanaL.的干燥根。其生品性冷，味苦，屬冷藥，入熱經(jīng)，有毒。具有洼沃(瀉水)、達(dá)洼渥(利尿)之功，主用于普嘎秋(水臌病)、崗秀布(皮膚濕疹)等病癥[1]。其藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，療效突出，但因其作用峻烈，毒性較強(qiáng)，故列為下品。

毒性藥物臨床應(yīng)用時(shí)，為降低其毒性，多炮制后入藥，以保證臨床用藥的安全有效。2020版《中國(guó)藥典》收載商陸的炮制方法為“醋炙商陸”，炮制后作用緩和，苦寒之性降低，以逐水消腫為主，但仍有一定毒性?！独坠谥苏摗分杏涊d：“每修事商陸，刮粗皮，薄切，以水浸兩宿，然后漉出甑蒸，以豆葉一重與商陸一重，如斯蒸，從午至亥出，去豆葉暴干，細(xì)銼用”。結(jié)合民族藥專著的查閱，在苗醫(yī)藥的臨床應(yīng)用中，萵比苷(商陸)通過特殊蒸制為熟品后，味甜性補(bǔ)，可降低毒性，減緩峻瀉作用[1]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，萵比苷(商陸)中化學(xué)成分主要有皂苷類[2]、多糖類[3]等成分，其蒸制后“味甜性補(bǔ)”可能與成分變化有關(guān)，其中多糖類主要有商陸多糖-I(PAP-I)和商陸多糖-Ⅱ(PAP-Ⅱ)[4]，商陸多糖-I能誘生腫瘤壞死因子，提高免疫能力[5]，商陸均一多糖可促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖[6]；而商陸多糖-II有增強(qiáng)免疫和促進(jìn)造血功能的作用，能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖[7]。有關(guān)萵比苷(商陸)不同蒸制方法中總多糖含量變化未見相關(guān)研究報(bào)道。

基于此，本文結(jié)合實(shí)地調(diào)研及相關(guān)文獻(xiàn)資料記載，以總多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用紫外-可見分光光度法及苯酚-硫酸法，探討趁鮮蒸制、烘干后蒸制、流水浸后蒸制等不同炮制方法下，苗藥萵比苷(商陸)樣品中總多糖含量的變化。研究不同蒸制時(shí)間與總多糖含量之間的內(nèi)在聯(lián)系動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。研究結(jié)果為萵比苷(商陸)的炮制加工、藥效物質(zhì)及臨床應(yīng)用奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TU-1810型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；ME204E萬(wàn)分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HH-S4型恒溫水浴鍋(上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展公司)；HS10260D型超聲清洗儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)；101-3AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰士特儀器有限公司)；XL-02A型新型密封式粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

無(wú)水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純)；濃硫酸(重慶川東化工有限責(zé)任公司，分析純)；苯酚(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：GZDD-0523，貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司)；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

萵比苷(商陸)藥材采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為商陸科植物垂序商陸PhytolaccaamericanaL.的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 萵比苷(商陸)不同炮制品的制備

2.1.1 生品

取萵比苷(商陸)鮮藥材，除去雜質(zhì)，洗凈泥土，刮去外皮，趁鮮切厚片(0.2～0.4 cm)，60 ℃烘干，取出，得生品樣品。

2.1.2 醋炙品

取烘干后的凈萵比苷(商陸)片，根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》中收載的商陸“醋炙法”，進(jìn)行醋炙炮制。炒至表面黃棕色，微有醋香氣，取出，攤開放涼，得醋炙品樣品。

2.1.3 趁鮮蒸制

取定量鮮萵比苷(商陸)片，大小分檔，置于蒸制容器中，用鮮大豆葉層層隔開，底部以及頂部覆蓋，一層大豆葉一層商陸片，隔水加熱，分別蒸制2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、18 h、22 h、26 h、32 h，取出，冷卻，60 ℃烘干，得趁鮮蒸制樣品。

2.1.4 烘干后蒸制

取適量直接烘干后的萵比苷(商陸)片，噴淋適量清水后，潤(rùn)透，按“2.1.3”項(xiàng)蒸制法，分別蒸制2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、18 h、22 h、26 h、32 h，取出，冷卻，60 ℃烘干，得烘干后蒸制樣品。

2.1.5 流水浸后蒸制

取定量鮮萵比苷(商陸)片，流水浸泡3 d，取出，瀝干水，按“2.1.3”項(xiàng)蒸制法蒸制12 h。取出，冷卻，60 ℃烘干，得萵比苷(商陸)流水浸后蒸制樣品。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品粉末(過二號(hào)篩)0.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入60 mL無(wú)水乙醇，回流提取兩次，每次0.5 h，趁熱過濾。剩余的殘?jiān)?0 mL無(wú)水乙醇洗滌兩次，棄去濾液。將殘?jiān)蜑V紙自然揮干后放入100 mL錐形瓶中，加入10 mL蒸餾水，超聲提取(功率300 W，50 kHz)1 h，趁熱過濾，精密吸取續(xù)濾液1 mL置于100 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品約5 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得0.1014 mg/mL無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取0.1014 mg/mL無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液2 mL、3 mL、4 mL、6 mL、7 mL、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，精密吸取不同濃度對(duì)照品溶液1 mL，再分別精密吸取5%苯酚溶液1.6 mL、濃H2SO47 mL，充分搖勻，進(jìn)行顯色，沸水浴5 min，冰水浴15 min。以蒸餾水溶液為空白對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)488 nm下測(cè)定吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度X為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，得線性回歸方程為：Y=8.682X-0.0073(R2=0.9999)，結(jié)果表明在0.02028 ～ 0.08112 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

吸取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液，共6份。按照“2.4.1”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度并計(jì)算RSD值。得RSD值為0.63%<3%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取同一供試品溶液1 mL，按照“2.4.1”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，分別在顯色后0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。得RSD值為0.50%<3%，表明該樣品在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品共6份，每份0.5 g，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行樣品制備，按照“2.4.1”項(xiàng)方法進(jìn)行 顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。得RSD值為2.32%<3%，表明供試品提取、顯色方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

取同一樣品共6份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入適量無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行樣品制備，按照“2.4.1”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，測(cè)其吸光度，計(jì)算加樣回收率。得該方法的加樣回收率平均值為103.89%，RSD值為2.39%<3%，說(shuō)明檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性良好。

2.5 不同炮制品總多糖含量測(cè)定

分別取萵比苷(商陸)不同炮制樣品，按照“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行樣品制備，按照“2.4.1”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，測(cè)定不同樣品中的總多糖含量，以干燥品計(jì)算，研究結(jié)果見表1和圖1。

表1 萵比苷(商陸)不同炮制品總多糖含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.1 Content determination results of total polysaccharides inMiao medicine Vob Bix Gheib(Phytolaccae Radix)processed bydifferent methods(n=3)

圖1 萵比苷(商陸)不同炮制品中總多糖含量趨勢(shì)圖Fig.1 Content of total polysaccharides in Miao medicine Vob Bix Gheib(Phytolaccae Radix) processed by different methods

由表1和圖1可得，萵比苷(商陸)不同炮制方法中總多糖的含量差異較大，生品及醋炙品總多糖含量分別為8.73%和8.60%，趁鮮蒸制不同時(shí)間樣品總多糖含量為7.65%～10.67%，烘干后蒸制不同時(shí)間樣品的總多糖含量為6.99%～10.45%，流水浸后蒸制12 h樣品總多糖含量為5.36%，其中以趁鮮蒸制12 h含量最高，為10.67%。同時(shí)，在一定蒸制時(shí)間內(nèi)，含量隨著蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，達(dá)最大值后呈下降趨勢(shì)，其中趁鮮蒸制以12 h為最大值，烘干后蒸制以14 h為最大值。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以總多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，與生品與醋炙品比較，萵比苷(商陸)蒸制一定時(shí)間后，多糖含量有所增加，不同蒸制時(shí)間，總多糖含量不同，其中趁鮮蒸制以12 h為最大值，烘干后蒸制以14 h為最大值。結(jié)果表明蒸制不同時(shí)間后，多糖類物質(zhì)發(fā)生改變，而流水浸后蒸制品含量最低，表明流水浸泡過程中，成分流失過多，研究結(jié)果為進(jìn)一步探討其炮制減毒增效作用奠定良好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，為了進(jìn)一步優(yōu)選提取條件和顯色條件，對(duì)提取方法、乙醇除雜濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比等提取條件以及顯色劑用量、顯色時(shí)間等顯色條件進(jìn)行了考察，為研究結(jié)果提供重要保證。

萵比苷(商陸)為少數(shù)民族地區(qū)常用藥材，其分布廣泛，藥效明確，藥用歷史悠久，但因其毒性明顯，臨床應(yīng)用受到限制，且其主要毒性物質(zhì)目前尚無(wú)明確定論。但在苗醫(yī)藥臨床應(yīng)用中，通過炮制蒸熟后，其藥性改變，毒性下降，具有補(bǔ)虛扶弱之功，且在古代本草《雷公炮炙論》中也有蒸制減毒的記載。通過文獻(xiàn)資料的查閱，萵比苷(商陸)中多糖具有提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[6-7]。故本文以總多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選蒸制炮制工藝，進(jìn)一步探討萵比苷(商陸)蒸制不同時(shí)間后，其總多糖含量的動(dòng)態(tài)變化。不同蒸制時(shí)間多糖含量的變化是否與藥效結(jié)果相關(guān)，以及是否與炮制減毒存效作用機(jī)理相關(guān)有待進(jìn)一步研究論證。