高 彬，黎貴鳳，孫僑生，馬延紅，劉文華

(肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院·廣東 肇慶 526001)

魚腥草為三白草科蕺菜屬蕺菜(HouttuyniacordataThunb.)帶根全草，因新鮮植株莖葉破碎后有濃烈的魚腥氣味而得名，干燥后腥味消散，且略有芳香，為“藥食兩用”中藥?，F(xiàn)代藥理研究證明魚腥草具有抗炎、抗菌、抗病毒、增強機體免疫力等作用[1]，2003年“非典”期間，魚腥草是衛(wèi)生部推薦的8種抗SARS中藥之一，可改善臨床癥狀，減輕炎癥反應(yīng)等[2]。此后，魚腥草類注射劑產(chǎn)量激增，全國各地接連出現(xiàn)其不良反應(yīng)報道，甚至出現(xiàn)致死案例，在國家食品藥品監(jiān)督管理局印發(fā)《關(guān)于暫停使用和審批魚腥草注射液等7個注射劑的通告》[3]后，決定暫停使用和審批含魚腥草成分的7個注射劑，隨后又審批陸續(xù)恢復(fù)使用。

《本草綱目》記載:“氣味辛、微溫、有小毒?！薄睹t(yī)別錄》記載:“多食令人氣喘。”民間未有食用魚腥草急性中毒的案例，且上述魚腥草注射劑事件中，尚不能排除企業(yè)粗制濫造及操作不當(dāng)?shù)热藶橐蛩?，但有關(guān)魚腥草的安全性研究鮮有報道，應(yīng)在藥理、毒理等各方面對魚腥草作系統(tǒng)性的研究，以便更好地指導(dǎo)用藥。本實驗使用不同溶劑依次萃取，得到魚腥草不同極性段萃取物并進行細(xì)胞毒性實驗，同時進一步分離并分析其化學(xué)成分，旨在探究其毒理性質(zhì)，豐富魚腥草化合物信息數(shù)據(jù)庫。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人胚胎肝細(xì)胞系CCC-HEL-1：北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物與試劑 魚腥草干品購自肇慶藥材市場，經(jīng)肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院陳雄偉教授鑒定為蕺菜屬植物蕺菜的干燥全草。DMEM高糖培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)：北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；0.25%胰酶：美國Gibco；磷酸鹽緩沖液：美國Gibco；MTT(5 g/L)： 美國Sigma；甲醇(色譜純)：天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；其余試劑乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、DMSO均為分析純。

1.3 儀器 500兆赫超導(dǎo)核磁共振譜儀：瑞士Bruker Avance Ⅲ；三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國TSQ Quantum Ultra；制備液相色譜儀：日本YMC LC-FORTE/R；CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo HERAcell 150i；800TS酶標(biāo)儀：美國Biotek；SY-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮；YMC-Triart C18色譜柱(250 mm×20.0 mm, 5 μm)；Sephadex LH-20凝膠：日本YMC；柱色譜硅膠(200～300目)：青島海洋化工廠；薄層色譜硅膠板：青島海洋化工廠；津隆微孔濾膜(0.45 μm)： 天津科億隆實驗設(shè)備有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 化合物分離 取魚腥草全株5 kg，粉碎成粉末狀，75%乙醇(料液比1∶4)回流提取2次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏670.5 g，去離子水懸浮，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，減壓濃縮得到二氯甲烷部位浸膏10.07 g、乙酸乙酯部位浸膏18.4 g、正丁醇部位浸膏53.59 g。

二氯甲烷萃取物經(jīng)正相硅膠柱色譜分離得到10個流分，第7流分以石油醚/乙酸乙酯(10%～40%)梯度洗脫，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離得化合物1 (8.7 mg)，TLC展開后，在365 nm波長下呈藍綠色熒光斑點；第8流分用甲醇溶解，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離及正相硅膠柱純化后，得到在365 nm下呈藍色的化合物2 (8 mg)。乙酸乙酯萃取物經(jīng)正相硅膠柱色譜分離得到9個流分，第4流分經(jīng)硅膠柱色譜分離后，用甲醇溶解，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，得到在365 nm下呈黃色的化合物3 (13.2 mg)；第7流分經(jīng)硅膠柱色譜分離后，用甲醇溶解，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離及C18反相柱色譜(甲醇/水=20%～50%)梯度洗脫分離得到在365 nm下呈藍色的化合物4 (7 mg)。

2.2 MTT法鑒定毒性 取少量二氯甲烷部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏分別用DMSO溶解后，加入培養(yǎng)基配置成1 g/L母液(DMSO終濃度≤0.1%)，濾過除菌，冷藏待用。

按照北京協(xié)和細(xì)胞資源中心提供的標(biāo)準(zhǔn)流程，將CCC-HEL-1培養(yǎng)于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)箱中，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，每3 d傳代一次。取對數(shù)生長期的CCC-HEL-1，調(diào)整濃度為5×104個/mL，以100 μL/孔的量接種于96孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍。將母液等梯度稀釋，給藥組加入含不同濃度浸膏的培養(yǎng)基100 μL/孔，對照組加入等量培養(yǎng)基，以上均設(shè)3個復(fù)孔。在周圍加入等量的PBS作為空白調(diào)零孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，加入100 μL/孔MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，加入100 μL/孔DMSO，振蕩10 min，測定各孔490 nm處吸光度值。每個處理做3 次重復(fù)實驗。

細(xì)胞存活率(%)=[(OD給藥組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)]×100%

2.3 細(xì)胞存活率 見表1。

表1 不同極性段萃取物對細(xì)胞存活率的影響

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃綠色針狀結(jié)晶。APCI-MSm/z∶278.0[M-H]-。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ∶7.86(1H, s, H-2), 9.12(1H, d, J=8.0 Hz, H-5), 7.57(2H, m, H-6, 7), 7.96(1H, d, J=6.0 Hz, H-8), 7.14(1H, s, H-9), 4.05(3H, s, 4-OCH3), 4.04(3H, s, 3-OCH3), 10.85(1H, s,-NH);13C-NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ∶168.4(-CONH-), 121.6(C-4a), 154.3(C-3), 150.4(C-4), 109.9(C-2), 119.9(C-1), 127.5(C-7), 126.9(C-5), 125.9(C-4b), 125.5(C-6), 129.1(C-8), 134.9(C-8a), 104.6(C-9), 135.1(C-10), 123.3(C-10a), 57.0(3-OCH3), 60.0(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[4]，故鑒定為馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ(aristololactam BⅡ)。

化合物2：黃色毛絨狀結(jié)晶。APCI-MSm/z∶264.0[M-H]-。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ∶10.66(1H, s,-NH), 9.26(1H, m, H-5), 7.93(1H, m, H-8), 7.77 (1H, s, H-2), 7.54 (2H, m, H-6, 7), 7.13 (1H, s, H-9), 4.05 (3H, s, 4-OCH3);13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ∶57.2 (3-OCH3), 104.4 (C-9), 108.6 (C-2), 114.4 (C-4a), 116.0 (C-1), 124.3 (C-11), 125.0 (C-7), 126.6 (C-6), 127.7 (C-8a), 127.5 (C-5), 128.7 (C-8), 134.2 (C-5a), 135.2 (C-10), 148.2 (C-4), 149.3 (C-3), 169.0 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[5]，故鑒定為胡椒內(nèi)酰胺A (piperolactam A)。

化合物3：黃色顆粒狀。 ESI-MSm/z: 286.0 [M]+。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ∶6.17 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6), 6.38 (1H, d,J=2.1 Hz, H-8), 8.07 (2H, d,J=8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.89 (2H, d,J=8.9 Hz, H-3′, 5′);13C-NMR (126 MHz, CD3OD) δ∶148.0 (C-2), 137.1 (C-3), 177.3 (C-4), 162.5 (C-5), 99.3 (C-6), 165.5 (C-7), 94.5 (C-8), 158.2 (C-9), 104.5 (C-10), 123.7 (C-1′), 130.6 (C-2′, 6′), 116. 3 (C-3′, 5′), 160.5 (C4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[6]，故鑒定為山柰酚(kaempferol)。

化合物4： 棕白色粉末狀。ESI-MSm/z∶335.0 [M-H]-。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ∶6.86 (1H, m, H-2), 4.41 (1H, m, H-3), 3.91 (1H, dd,J= 7.5, 4.2 Hz, H-4), 5.25 (1H, dt,J=7.6, 5.3 Hz, H-5), 2.86 (1H, dd,J=18.3, 5.2 Hz, H-6a), 2.32 (1H, dd,J=18.5, 5.5 Hz, H-6b), 7.05 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-2′), 6.78 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5′), 6.95 (1H, dd,J= 8.1, 2.1 Hz, H-6′), 7.56 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 6.28 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8′);13C-NMR (126 MHz, CD3OD) δ∶ 130.3 (C-1), 138.9 (C-2), 71.4 (C-3), 70.0 (C-4), 67.3 (C-5), 29.2 (C-6), 169.7 (C-7), 127.7 (C-1′), 116.5 (C-2′), 146.8 (C-3′), 149.7 (C-4′), 115.2 (C-5′), 123.0 (C-6′), 147.3 (C-7′), 115.0 (C-8′), 168.6 (C-9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[7]，故鑒定為 5-咖啡?；Р菟?5-O-caffeoylshikimic acid)。

3 討論

魚腥草中含有豐富的生物堿[8]，是其活性成分的來源之一，其中頗有爭議的是馬兜鈴內(nèi)酰胺類(aristololactam, AL)生物堿。AL既是馬兜鈴酸(aristolochic acid, 一種具有強烈腎毒性的物質(zhì))在肝中的代謝產(chǎn)物[9]，又作為一種獨立成分廣泛存在于自然界；體外細(xì)胞實驗已證明AL-Ⅰ具有腎細(xì)胞毒性，可造成DNA突變，腎間質(zhì)纖維化等[10-11]；但并非所有AL都具有毒性，且迄今魚腥草中發(fā)現(xiàn)的AL皆無毒。

肝是藥物或毒物生物轉(zhuǎn)化的主要場所，本實驗橫向比較了魚腥草3 個極性段萃取物對肝細(xì)胞的毒性，并發(fā)現(xiàn)魚腥草有毒成分富集在二氯甲烷部位，以往的文獻報道中雖未發(fā)現(xiàn)魚腥草含有有毒成分，不能排除其含量低、且脂溶性毒物在體內(nèi)積蓄的可能，有造成慢性損傷的風(fēng)險。本次實驗只針對浸膏進行了初步毒性鑒定，其中具體成分尚不明確，因此有必要深入研究魚腥草的化學(xué)成分。筆者認(rèn)為，探明魚腥草AL物質(zhì)種類及其活性，將是一個很好的切入點。