薛夢(mèng)迪，楊鴻源，馬占宇，夏彥玲

（東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040）

鹿茸角是所有哺乳動(dòng)物組織中唯一可以循環(huán)再生的器官，能夠周期性生長(zhǎng)脫落［1］，其發(fā)育是一個(gè)非常獨(dú)特的復(fù)雜過(guò)程，涉及到軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨等骨生長(zhǎng)方式，許多研究表明鹿茸再生是基于干細(xì)胞（骨膜細(xì)胞），不涉及細(xì)胞的去分化，和蠑螈肢體再生過(guò)程不相同［2］。

鹿茸角是鹿茸和鹿角的總稱(chēng)，是鹿科雄性動(dòng)物（馴鹿除外）的第二性征。東北狍屬于一種中小型鹿科食草動(dòng)物，劉繼華等［3］的研究表明，狍茸和鹿茸中的化學(xué)成分基本相同，都擁有生精補(bǔ)髓、益血壯陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨、促進(jìn)造血、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效［4］。

近年來(lái)有研究表明，ARL3基因參與細(xì)胞內(nèi)微管調(diào)節(jié)和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，且和多種生物學(xué)過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［5］，尤其是與人類(lèi)腦部發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤［6］有著密切的關(guān)聯(lián)。人們對(duì)ARL3基因與鹿科動(dòng)物茸角生長(zhǎng)相關(guān)性方面知之甚少。為此，本試驗(yàn)對(duì)東北狍（Capreolus pygargus）茸角中的ARL3基因進(jìn)行克隆和序列分析，為深入探討鹿科動(dòng)物茸角生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

選取一頭人工馴養(yǎng)的健康成年?yáng)|北狍（來(lái)源于大興安嶺加格達(dá)奇地區(qū)）作為試驗(yàn)動(dòng)物，在未骨化的狍茸頂端組織中選取大約4 cm樣品，采集樣品時(shí)應(yīng)注意使用嚴(yán)格消毒的手術(shù)刀。將采集到的樣品放入凍存管，再放置于液氮中保存，備用。

1.2 主要試劑和儀器

RNA提取試劑盒、pMD 18－T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；M－MLVⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自TOYOBO公司；膠純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠快速純化回收試劑盒，購(gòu)自Galen Biopharm公司；紫外分光光度計(jì)（型號(hào)為Ultrospec 2100 Pro），購(gòu)自General Electric公司。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 總RNA的提取及cDNA合成 將保存于液氮中的試驗(yàn)樣品約50 mg取出并研磨至粉末狀，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取狍茸頂端組織的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光法檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。以提取的狍茸尖端組織總RNA為模板，加入抑制劑RNase Inhibitor、底物dNTP Mixture、引物Oligo－dT、以M－MLVⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.2 東北狍ARL3基因的克隆 參照GenBank中牛、白唇鹿等物種的基因序列設(shè)計(jì)同源引物（上游引物5′－GCGGGAGGATGGGCTTAC－3′和下游引物5′－ATCTACGGCTGGAATGGGG－3′）。PCR擴(kuò)增包含ARL3基因全部編碼區(qū)的cDNA序列，PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2.0μL，上下游引物各1.0μL，rTaqDNA聚合酶0.2μL，ddH2O 17.3μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，54.5℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；在4℃進(jìn)行保存。將產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，確認(rèn)得到目的基因后，利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，涂板，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6～8 h，經(jīng)PCR陽(yáng)性克隆檢測(cè)后送往庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 采用ORF程序的ORF Finder軟件查找序列的開(kāi)放閱讀框，并使用Prot-Param和ProtScale在線程序預(yù)測(cè)蛋白的基本理化性質(zhì)及其親水性。用Signal P 3.0軟件預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽，用TMpred軟件預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，在PSORTⅡ在線服務(wù)器中預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位。通過(guò)GOR4預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISSMODEL對(duì)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模分析，并使用NetPhos 2.0和NetAcet 1.0 Server對(duì)ARL3蛋白磷酸化位點(diǎn)和乙?；稽c(diǎn)分別進(jìn)行預(yù)測(cè)，用NCBI上的CD－Search Tool預(yù)測(cè)蛋白功能結(jié)構(gòu)域，用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北狍ARL3基因總RNA的提取及cDNA克隆

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取狍茸頂端組織總RNA，RNA條帶中28 S、18 S和5 S均無(wú)降解現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。這說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量較好。PCR擴(kuò)增獲得1條約721 bp的條帶，見(jiàn)圖2。該條帶與預(yù)期目的基因片段大小一致。轉(zhuǎn)化后經(jīng)陽(yáng)性克隆獲得了721 bp的條帶，表明成功獲得目的基因。

圖1 RNA完整性檢測(cè)結(jié)果

圖2 PCR電泳圖譜

2.2 東北狍ARL3基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 ARL3基因的cDNA序列分析 本試驗(yàn)獲得的ARL3基因的cDNA序列長(zhǎng)度為721 bp，使用ORF Finder軟件對(duì)目的片段的開(kāi)發(fā)閱讀框進(jìn)行查找，顯示ARL3基因cDNA 序列的編碼區(qū)包含549 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA，共編碼182個(gè)氨基酸，見(jiàn)圖3。

圖3 東北狍ARL3基因cDNA編碼區(qū)及編碼氨基酸序列

2.2.2 東北狍ARL3蛋白基本理化性質(zhì) 東北狍ARL3蛋白包含182個(gè)氨基酸，其組成中亮氨酸含量最高，占12.64%。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為44.63，存在16個(gè)疏水區(qū)和25個(gè)親水區(qū)，親水平均系數(shù)為－0.312，該蛋白的親水性較強(qiáng)；理論等電點(diǎn)為6.83。SignalP 3.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白無(wú)信號(hào)肽。用TMpred軟件進(jìn)行的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，該蛋白為非跨膜蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析的結(jié)果表明ARL3基因編碼的蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體的概率分別是69.6%、21.7%、4.3%。

2.2.3 東北狍ARL3二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 GOR4軟件預(yù)測(cè)顯示該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為61個(gè)氨基酸組成無(wú)規(guī)則卷曲，84個(gè)氨基酸組成α－螺旋，37個(gè)氨基酸組成延伸鏈，分別占46.15%、33.52%、20.33%，見(jiàn)圖4。運(yùn)用ExPASy中的SWISS－MODEL的程序?qū)RL3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，結(jié)果表明，與輸入目標(biāo)序列的一致度為96.11%，GMQE值為0.88，見(jiàn)圖5。該模型圖表明東北狍ARL3蛋白主要由α－螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，此結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本相同。

圖4 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

圖5 三級(jí)結(jié)構(gòu)模型

2.2.4 東北狍ARL3蛋白磷酸化位點(diǎn)、乙酰化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)分析 對(duì)東北狍ARL3蛋白磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)表明，該蛋白含有1個(gè)蘇氨酸和5個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，分別是第103位蘇氨酸和第12，43，58，94，137位絲氨酸，不存在酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。乙?；稽c(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示有一個(gè)序列（—MGLLS）存在乙?；揎?。ARL3蛋白中含有20個(gè)糖基化位點(diǎn)，其連接位點(diǎn)是甘氨酸。

2.2.5 東北狍ARL3蛋白結(jié)構(gòu)域分析 利用CD Search Tool在線工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果（見(jiàn)圖6）顯示，ARL3蛋白3～175位氨基酸含有一個(gè)ARL3蛋白活性結(jié)構(gòu)域，與P－loop＿NTPase超家族相似度很高。ARL3結(jié)構(gòu)域中包含多個(gè)功能活性結(jié)合位點(diǎn)，包括2個(gè)開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)換區(qū)：switchⅠ和switchⅡ；一個(gè)酶類(lèi)作用位點(diǎn)：GTP／Mg2＋結(jié)合位點(diǎn)（GTP／Mg2＋binding site）。

圖6 蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

2.3 東北狍ARL3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站下載8個(gè)物種ARL3蛋白氨基酸序列，并用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果表明，東北狍與白尾鹿親緣關(guān)系最近，與野牦牛、長(zhǎng)江江豚、非洲爪蟾的親緣關(guān)系較近，與家貓、美洲河貍等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，此進(jìn)化樹(shù)符合進(jìn)化關(guān)系，并且與物種傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)地位相符。

圖7 東北狍ARL3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

本試驗(yàn)中，成功克隆了含有東北狍ARL3基因編碼區(qū)的cDNA序列，其中CDS區(qū)全長(zhǎng)549 bp，共編碼182個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ARL3蛋白為親水性蛋白質(zhì)且不存在信號(hào)肽。經(jīng)ARL3基因的蛋白質(zhì)序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)東北狍與白尾鹿親緣關(guān)系最近，與野牦牛、長(zhǎng)江江豚、非洲爪蟾的親緣關(guān)系較近，與家貓、美洲河貍等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合傳統(tǒng)的分類(lèi)學(xué)進(jìn)化關(guān)系。ARL3蛋白質(zhì)磷酸化修飾發(fā)生的位點(diǎn)是絲氨酸和蘇氨酸，可能與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)發(fā)育以及癌癥機(jī)制有關(guān)。其蛋白的O－糖基化連接位點(diǎn)是甘氨酸，許多隱藏的膜結(jié)合蛋白在甘氨酸上發(fā)生O－糖基化，這些糖蛋白中大多數(shù)為黏液糖蛋白，常稱(chēng)黏蛋白。黏蛋白組成了富含多聚糖的膜相關(guān)蛋白和分泌性糖蛋白大家族，它們由上皮細(xì)胞分泌，是保護(hù)黏膜上皮的物理和生物屏障。許多重要的生物進(jìn)程，包括上皮細(xì)胞表層的保護(hù)、免疫應(yīng)答、黏附、炎癥和腫瘤發(fā)生等，都是由黏蛋白或帶有黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域的糖蛋白控制和／或調(diào)節(jié)的［7］。

ARL3結(jié)構(gòu)域中包含GTP／Mg2＋結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)與GTP結(jié)合時(shí)ARL3蛋白呈現(xiàn)激活狀態(tài)，當(dāng)GTP水解為GDP時(shí)，蛋白為非激活構(gòu)象。Mg2＋離子在促進(jìn)switchⅠ和switchⅡ功能區(qū)與磷酸根結(jié)合中起到了關(guān)鍵作用，通過(guò)激活態(tài)與非激活態(tài)之間的轉(zhuǎn)變來(lái)完成信號(hào)傳遞的“開(kāi)”與“關(guān)”，進(jìn)而調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)通路和物質(zhì)代謝［8］。

ARL3蛋白在人腦發(fā)育的早期（包括小腦）以及發(fā)育中的視網(wǎng)膜和腎臟中表達(dá)，研究表明，它通過(guò)調(diào)節(jié)睫狀體運(yùn)動(dòng)參與睫狀疾病的發(fā)生，影響腎臟和光感受器的發(fā)展［9］。此外，ARL3基因參與多種生物學(xué)過(guò)程和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，調(diào)節(jié)多種基本的細(xì)胞功能，如膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞黏附和遷移等細(xì)胞活動(dòng)，它在免疫突觸和初級(jí)纖毛中起著濃縮脂質(zhì)修飾蛋白的作用［10］，可以作為評(píng)估膠質(zhì)瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物，亦或是一個(gè)膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)。鹿茸能夠像腫瘤一樣快速生長(zhǎng)，鹿茸快速生長(zhǎng)期細(xì)胞增殖速度是癌細(xì)胞增值速度的30倍［11－12］。在鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)胞的分化、增殖、凋亡都受到特定基因表達(dá)的調(diào)控。

綜上所述，ARL3基因的存在與癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，可能也與鹿茸頂端組織快速生長(zhǎng)密不可分。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)ARL3基因編碼序列的克隆，對(duì)ARL3基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了初步分析預(yù)測(cè)，研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示ARL3基因的功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，也為狍茸角的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。