邢海華，劉偉石，左 月，鄭 義，李和平

（東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040）

精子屬于生殖細(xì)胞，由雄性動(dòng)物產(chǎn)生并能將遺傳物質(zhì)穩(wěn)定地傳遞給子代，當(dāng)動(dòng)物精子的生理結(jié)構(gòu)與功能出現(xiàn)異常時(shí)，會(huì)影響雄性動(dòng)物的繁殖能力，甚至?xí)绊懽哟慕】禒顩r。因此，對(duì)精子的形態(tài)特征以及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)致的研究，能夠進(jìn)一步檢驗(yàn)不同處理方法對(duì)精子結(jié)構(gòu)的影響，還能為精子的體外受精、頂體反應(yīng)發(fā)生時(shí)精子結(jié)構(gòu)的改變情況提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，即精子形態(tài)以及結(jié)構(gòu)的研究能夠有助于受精規(guī)律的揭示與總結(jié)［1］。而對(duì)動(dòng)物精子超微結(jié)構(gòu)的研究經(jīng)過了一個(gè)漫長(zhǎng)的探究過程，最初有學(xué)者對(duì)人、狗的精子進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)研究；隨著電鏡技術(shù)的不斷升級(jí)與改造，動(dòng)物精子超微結(jié)構(gòu)研究方式也產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍。國(guó)內(nèi)對(duì)哺乳動(dòng)物精子超微結(jié)構(gòu)的探究相對(duì)較晚，曾陸續(xù)對(duì)綿羊［2］、驢［3］、豬［4－6］、兔［7］、大熊貓［8］、藍(lán)狐［9－10］、梅花鹿［11－12］等動(dòng)物精子的超微結(jié)構(gòu)展開了細(xì)致的研究，并詳盡分析了頂體囊泡化的特征以及各類動(dòng)物精子的結(jié)構(gòu)特異性。

關(guān)于鹿精子超微結(jié)構(gòu)的研究也已有一些基礎(chǔ)，如馮懷亮等［11］通過電子顯微鏡對(duì)東北梅花鹿精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)致觀察，結(jié)果表明，東北梅花鹿精子的超微結(jié)構(gòu)與其他哺乳動(dòng)物精子相差不大，最明顯特征是其精子頂體前端相對(duì)膨大，頭部偏長(zhǎng)，有明顯的環(huán)狀結(jié)構(gòu)將精子的中段與主段分開。楊智等［12］通過光學(xué)顯微鏡以及電子顯微鏡觀察了梅花鹿精子在冷凍前后超微結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)果表明，冷凍解凍后精子頂體部位發(fā)生膨脹，部分精子的頂體內(nèi)容物外溢，頂體內(nèi)部出現(xiàn)明顯空泡現(xiàn)象，部分線粒體丟失。之后，李和平等［13］對(duì)馬鹿精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察與研究，并成功測(cè)得馬鹿精子的全長(zhǎng)以及頭、頸、尾長(zhǎng)。史文清等［14］觀察并對(duì)比分析了冷凍保存方法對(duì)馬鹿精子超微結(jié)構(gòu)的影響與作用。

馴鹿是我國(guó)使鹿部落鄂溫克少數(shù)民族的重要生產(chǎn)資料，僅分布于北緯50°～53°的我國(guó)內(nèi)蒙古大興安嶺根河市，由二十幾個(gè)鄂溫克家庭飼養(yǎng)，數(shù)量約有1 000頭。關(guān)于我國(guó)馴鹿精子形態(tài)以及超微結(jié)構(gòu)的研究尚未見報(bào)道。試驗(yàn)對(duì)馴鹿精子形態(tài)結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并對(duì)其結(jié)構(gòu)的各部分進(jìn)行觀測(cè)，掌握馴鹿精子的顯微與超微結(jié)構(gòu)，以期為馴鹿精子精液冷凍保存、體外受精與頂體反應(yīng)發(fā)生過程等研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馴鹿精液，于2020年9月采自根河林業(yè)局馴鹿養(yǎng)殖基地的3頭成年健康馴鹿，制成細(xì)管凍精，用38～40℃水浴解凍，解凍后精子活力在0.3以上，用0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS溶液，pH值7.2）沖洗2次，每次6 000 r／min離心2 min，除去上清液，將最后一次沉淀加入0.1 mol／L PBS溶液1 mL，以保持馴鹿精子活力及形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2 主要器械、儀器與化學(xué)試劑

TDL－5－A低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；OLYMPUS IMF－2相差顯微鏡，購(gòu)自日本OLYMPUS株式會(huì)社；MOTIC SFC－18 SERIES油鏡，購(gòu)自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司；量制滬字02270113血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，購(gòu)自上海市求精生化試劑儀器有限公司。以上儀器由東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院公共實(shí)驗(yàn)室提供。

H－7650透射電子顯微鏡，購(gòu)自日本日立公司；EM UC7超薄切片機(jī)，購(gòu)自德國(guó)LEICA公司。以上儀器由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測(cè)試共享中心提供。

PBS、戊二醛、吉姆薩染色液、四氧化鋨溶液、乙醇、丙酮、環(huán)氧樹脂812包埋劑、醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測(cè)試共享中心提供。

1.3 顯微鏡檢

通過光學(xué)顯微鏡對(duì)馴鹿精子進(jìn)行鏡檢觀察，研究其顯微結(jié)構(gòu)特征。

1.3.1 染色 用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）沖洗3次，并將精子稀釋成1×104個(gè)／mL，涂抹在載玻片上，空氣干燥。用吉姆薩染色液滴在涂片上染色5 min，再用純化水沖洗，待干燥。

1.3.2 鏡檢 將樣品放置在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)特征。

將目微尺放入目鏡，測(cè)量精子長(zhǎng)度，在不同放大倍數(shù)下用臺(tái)微尺校正測(cè)微尺。需要注意的是，如果調(diào)整顯微鏡的放大倍數(shù)，則需要重新用臺(tái)微尺校正測(cè)微尺。

在視野中任選45個(gè)精子，測(cè)量精子的全長(zhǎng)以及頭部、頸部、尾部各部分長(zhǎng)度，各部分測(cè)量不少于3次，取平均值，并記錄，之后用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 精子超微結(jié)構(gòu)研究

利用透射電子顯微鏡技術(shù)研究馴鹿精子超微結(jié)構(gòu)。

1.4.1 前固定 將精子懸液用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）沖洗3次，每次10 000 r／min離心5 min，除去上清液；將最后一次沉淀加入2.5%戊二醛，預(yù)固定2 h，保持馴鹿精子形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4.2 沖洗 用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）沖洗3次，每次放入4℃冰箱中靜置15 min，10 000 r／min離心3 min，去除上清液。

1.4.3 后固定 在通風(fēng)櫥內(nèi)，滴加1%四氧化鋨溶液，4℃冰箱內(nèi)固定2 h。

1.4.4 沖洗 用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）沖洗3次，每次放入4℃冰箱中靜置15 min，10 000 r／min離心3 min，去除上清液。

1.4.5 脫水 分別用50%、70%、90%乙醇進(jìn)行梯度脫水，于4 ℃冰箱中靜置5 min；期間10 000 r／min離心3 min，去除上清液，用100%乙醇脫水2次，于4℃冰箱中靜置7 min，期間10 000 r／min離心3 min，去除上清液。

1.4.6 置換 用丙酮置換一次：無水乙醇、丙酮體積比為1∶1，各滴加0.5 mL，4℃冰箱靜置7 min，再10 000 r／min離心3 min，去除上清液；再滴加1 mL無水丙酮，室溫靜置5 min。

1.4.7 浸透與包埋 用環(huán)氧樹脂812進(jìn)行浸透，純丙酮、環(huán)氧樹脂812包埋（體積比為1∶1），25℃靜置30 min；純丙酮、環(huán)氧樹脂812包埋（體積比為1∶2），25℃靜置90 min；再以純丙酮、環(huán)氧樹脂812包埋（體積比為1∶3），開蓋過夜。再用環(huán)氧樹脂812進(jìn)行包埋。

1.4.8 聚合 在恒溫箱內(nèi)60℃聚合3 d。

1.4.9 切片 用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度5～7μm，所有切好的切片用帶有支持膜的樣品載網(wǎng)撈起，切片放進(jìn)培養(yǎng)皿。

1.4.10 染色 在25℃條件下，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，然后用純化水沖洗，待檢。

1.4.11 鏡檢、照相 用H－7650透射電子顯微鏡對(duì)處理好的樣品進(jìn)行鏡檢，并照相記錄。

2 結(jié)果

顯微鏡下觀測(cè)，馴鹿精子全長(zhǎng)（90.545±5.374）μm，由頭部、頸部、尾部構(gòu)成，這三部分長(zhǎng)度分別為（13.009±1.095）μm、（1.991±0.694）μm、（75.545±5.592）μm。

2.1 頭部

馴鹿精子頭部呈現(xiàn)略微扁平的卵圓形，頭長(zhǎng)（13.009±1.095）μm，內(nèi)部含有高度濃縮并且電子密度相對(duì)較高的精核，精核的矢狀面呈現(xiàn)長(zhǎng)楔形。頂體是兩層膜結(jié)構(gòu)，形似囊狀，包裹在精核外側(cè)，遠(yuǎn)離精核的一側(cè)是頂體外膜，鄰近精核的一側(cè)是頂體內(nèi)膜，兩層膜相對(duì)平行，且都是雙層膜結(jié)構(gòu)，兩者在頂體尾部交相融合成為一個(gè)整體。頂體前端相對(duì)膨大且呈現(xiàn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)，其電子密度相對(duì)較低；頂體后端為頂體后區(qū)，電子密度更低，見圖1、圖2。

圖1 馴鹿精子超微結(jié)構(gòu)（20 000×）

圖2 馴鹿精子頭部超微結(jié)構(gòu)（20 000×）

2.2 頸部

馴鹿精子的頸部位于頭部與尾部之間，部位較短，并且不明顯，從近端中心粒到遠(yuǎn)端中心粒這一部位為頸部，頸長(zhǎng)為（1.991±0.694）μm。近端中心粒位于精核下面的淺窩中，呈現(xiàn)偏短的圓筒狀，與精子尾部的縱軸多呈垂直關(guān)系，矢狀面多呈圓形。有漏斗狀結(jié)構(gòu)包裹在頸部的外側(cè)，漏斗狀結(jié)構(gòu)由9條縱向緊密排布的粗纖維構(gòu)成，上部附著于精核的下端，下部附著于精子尾部的中段。

2.3 尾部

馴鹿精子尾部位于頸部后側(cè)，尾長(zhǎng)為（75.545±5.592）μm，可分為中段、主段、終段。中段的縱切面清晰可見，線粒體呈現(xiàn)念珠狀分布于軸絲的外側(cè)，構(gòu)成線粒體鞘，見圖3、圖4；橫切面上，由9對(duì)微管結(jié)構(gòu)形成同心環(huán)結(jié)構(gòu)，中心部位有一對(duì)中央微管，形成“9＋2”結(jié)構(gòu)，而外側(cè)還包裹著9束外致密纖維，共同組成“9＋9＋2”結(jié)構(gòu)，再外層被線粒體鞘包被著，見圖5、圖6。中段的末端與主段的起始部位有一個(gè)明顯的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。主段是馴鹿精子尾部的主要部位，周圍包被著纖維鞘。纖維鞘的末端與細(xì)胞膜緊密貼合，構(gòu)成一層薄膜包裹著微束管，在向后延伸過程中，末端直徑緩慢變小。尾部主段橫切面可見“9＋2”結(jié)構(gòu)。終段是精子尾部的末端，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，只有“9＋2”結(jié)構(gòu)以及最外層的細(xì)胞膜。

圖3 馴鹿精子尾部斜切面結(jié)構(gòu)（25 000×）

圖4 馴鹿精子尾部縱切面結(jié)構(gòu)（30 000×）

圖5 馴鹿精子尾部中段橫切面結(jié)構(gòu)（40 000×）

圖6 馴鹿精子尾部橫切面結(jié)構(gòu)（20 000×）

3 討論與結(jié)論

為了探究與揭示哺乳動(dòng)物精子的形態(tài)構(gòu)造與超微結(jié)構(gòu)特征，一些學(xué)者陸續(xù)進(jìn)行了各類哺乳動(dòng)物精子的相關(guān)試驗(yàn)研究，盡管各類哺乳動(dòng)物正常精子的形態(tài)與結(jié)構(gòu)存在著一定的差異，但是都具有部分相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：精子總體能夠分成頭部、頸部以及尾部，而尾部又可細(xì)分為中段、主段以及終段。哺乳動(dòng)物精子之間最主要的差別是頭部形態(tài)，如牛、豬、馬等動(dòng)物精子頭部呈現(xiàn)略微扁平的卵圓形；而虎、人精子頭部則呈梨形。造成各類哺乳動(dòng)物精子頭部出現(xiàn)顯著區(qū)別的原因是精核與頂體的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，馴鹿精子具備哺乳動(dòng)物精子的主要特征，即含有頭部、頸部、尾部，且尾部能夠清晰地分為中段、主段、終段。

馴鹿精子全長(zhǎng)（90.545±5.374）μm，頭部長(zhǎng)（13.009±1.095）μm，頸部長(zhǎng)（1.991±0.694）μm，尾部長(zhǎng)（75.545±5.592）μm，其中尾部占精子全長(zhǎng)的比例最大；而馬鹿精子全長(zhǎng)（58.75±2.35）μm，頭部長(zhǎng)（8.93±0.24）μm ，頸部長(zhǎng)（1.00±0.16）μm，尾部長(zhǎng)（48.18±1.18）μm［13］。馴鹿精子頭部、頸部、尾部的長(zhǎng)度分別占精子全長(zhǎng)的14.37%、2.20%、83.43%；馬鹿精子頭部、頸部、尾部的長(zhǎng)度分別占精子全長(zhǎng)的15.20%、1.70%、82.01%；馴鹿精子長(zhǎng)度是馬鹿精子長(zhǎng)度的1.54倍；精子形態(tài)上，馴鹿精子頭部相對(duì)偏小而尾長(zhǎng)，馬鹿精子則頭相對(duì)偏大而尾較短；馴鹿精子與馬鹿精子在全長(zhǎng)以及各部位長(zhǎng)度、比例上的差異可能是種屬間的差異所造成的。

馴鹿精子的頂體前端相對(duì)平滑、膨大且呈現(xiàn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)。精子頸部位于頭部與尾部之間，部位較短，并且不明顯。精子尾部的中段與主段可見清晰的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，中段縱切面可見線粒體呈念珠狀，緊密分布于軸絲的兩側(cè)，構(gòu)成線粒體鞘；而橫切面則能清晰觀察到軸絲具有“9＋9＋2”微管結(jié)構(gòu)，這與馬鹿、梅花鹿精子的軸絲結(jié)構(gòu)一致［11－14］，與其他哺乳動(dòng)物如大熊貓［8］等的精子結(jié)構(gòu)一致，與火雞［15］等鳥類精子的軸絲結(jié)構(gòu)相似。通常認(rèn)為，中央微管具有傳導(dǎo)的作用與功能，外圍的9對(duì)微管結(jié)構(gòu)承擔(dān)收縮調(diào)節(jié)的功能。

4 致謝

試驗(yàn)中樣品采集得到根河縣林業(yè)局楊建民，計(jì)劃科王慶海、田曉瑞，多種經(jīng)營(yíng)科吳曉宇、蓋廣輝等同志，以及都慧中老師的大力支持，在此表示感謝！