陳軼嘉,胡楚紅,王建偉

(1.杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)新藥研究院有限公司,浙江 杭州 310011;2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

卡格列凈(國(guó)際通用名:Canagliflozin,Invokana)是首個(gè)獲批的鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2,Sodium-glucose co-transporter 2)抑制藥。SGLT-2抑制劑是一種前端新型降糖藥,主要通過(guò)抑制腎臟中腎小管對(duì)葡萄糖重吸收,促使機(jī)體內(nèi)多余的葡萄糖從尿液中排出,從而降低血糖含量,改善胰島β細(xì)胞功能,促使肝糖輸出恢復(fù)正常[1-6]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明:卡格列凈在降低空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)和控制血糖水平方面均表現(xiàn)出很好的療效,是一種非常有競(jìng)爭(zhēng)潛能的降糖藥物,并且安全性高。二甲雙胍是一種II型糖尿病的常規(guī)治療藥物,臨床試驗(yàn)證明它可以降低肝糖原生成和體內(nèi)對(duì)糖的吸收并促進(jìn)身體對(duì)糖的利用度,從而達(dá)到控制血糖的效果[7-9]。鑒于糖尿病的侵略性,很多病人最終需要通過(guò)多種渠道對(duì)血糖加以控制。卡格列凈加二甲雙胍復(fù)方制劑是SGLT-2抑制劑加雙胍類(lèi)藥物的復(fù)方制劑,利用卡格列凈和二甲雙胍的作用互補(bǔ)促進(jìn)機(jī)制,用于強(qiáng)化血糖控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

安捷倫高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1260 HPLC-6470 QQQ),梅特勒XS205電子分析天平。

1.2 藥品與試劑

卡格列凈二甲雙胍復(fù)方制劑樣品:50 mg/500 mg規(guī)格(片均質(zhì)量約為780 mg)樣品(廠家自制,批號(hào)181002-S,181003-S,181101,復(fù)方制劑);雜質(zhì)J對(duì)照品(LOT:20171130,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%);試劑:乙酸銨(ACS,LOT:95C1612UG,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%);甲酸(ACS,LOT:75C1710LL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%);乙腈(ACS,色譜純)。

2 方案與結(jié)果

2.1 色譜儀器條件

色譜柱:InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(2.1×100 mm,2.7 μm)。流動(dòng)相A相為甲酸-乙酸銨混合液(甲酸體積分?jǐn)?shù)0.1%、乙酸銨濃度5 mmol/L),B相為乙腈;流速0.4 mL/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度

后運(yùn)行時(shí)間為3 min,預(yù)計(jì)雜質(zhì)出峰時(shí)間為4.7 min。離子源:AJS ESI;掃描模式:MRM;極性:正離子;增益:400?；蚨倦s質(zhì)J離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。離子源參數(shù):干燥氣溫度300 ℃;干燥氣流速6 L/min;鞘氣溫度350 ℃;鞘氣流速11 L/min;毛細(xì)管電壓3 500 V;噴嘴電壓500 V;霧化氣壓力310 kPa。

表2 離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 稀 釋 液

稱取乙酸銨約0.38 g,加水1 L溶解,搖勻,超聲使其溶解,得5 mmol乙酸銨;取等體積的乙酸銨與乙腈混勻,得乙酸銨稀釋液,即空白溶液。

2.2.2 雜質(zhì)J儲(chǔ)備液

精密稱取基因毒性雜質(zhì)J適量,置量瓶中,加稀釋液至刻度線,搖勻,得113.5 ng/mL的對(duì)照品雜質(zhì)J儲(chǔ)備液,即單雜儲(chǔ)備液。

2.2.3 雜質(zhì)J對(duì)照品溶液

精密量取113.5 ng/mL雜質(zhì)儲(chǔ)備液2 mL,置于50 mL量瓶中,加稀釋液至刻度,搖勻作為4.54 ng/mL的雜質(zhì)J對(duì)照品溶液,即系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.4 專(zhuān)屬性溶液

分別取輔料、卡格列凈原料、二甲雙胍原料和雜質(zhì)J母液溶液各適量,加稀釋液配制成卡格列凈、二甲雙胍和雜質(zhì)J 100%限度濃度的混合溶液,作為專(zhuān)屬性溶液。

2.2.5 供試品溶液

供試品溶液:取卡格列凈二甲雙胍復(fù)方片(50 mg/500 mg)20片,精密稱定,研細(xì),精密稱取390 mg(約相當(dāng)于卡格列凈25 mg),置25 mL量瓶中,加稀釋液適量,超聲10 min使其溶解,冷卻,加稀釋液至刻度,搖勻。在13 000 r/min下離心15 min,取上清液作為1 mg/mL卡格列凈二甲雙胍復(fù)方片供試品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取2.2節(jié)方法所配的空白溶液、雜質(zhì)對(duì)照溶液和專(zhuān)屬性溶液各1 μL,在2.1節(jié)色譜條件下分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,LC-MS/MS色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知:在上述色譜條件下,空白溶劑不干擾測(cè)定,卡格列凈二甲雙胍復(fù)方制劑中主成份卡格列凈、二甲雙胍與基因毒雜質(zhì)J出峰時(shí)間無(wú)干擾,無(wú)任何其他檢測(cè)干擾。

圖1 LC-MS/MS色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取約120 mg輔料和約250 mg二甲雙胍(相當(dāng)于卡格列凈25 mg制劑配比)共6份,分別置于25 mL量瓶中,加適量稀釋劑,分別加入適量雜質(zhì)J對(duì)照品儲(chǔ)備液,確保其最終定容后為定量限LOQ,10%,50%,100%,150%和200%基因毒雜質(zhì)限度質(zhì)量濃度溶液。超聲10 min,冷卻至室溫,用上述稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,在13 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液,得6份線性溶液。由峰面積對(duì)溶液質(zhì)量濃度線性回歸,得回歸線性方程y=2 228.380 5x+43.219 6,基因毒雜質(zhì)J質(zhì)量濃度為0.09～9.08 ng/mL時(shí)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

2.5 檢測(cè)限與定量限

精密稱取120 mg輔料和250 mg二甲雙胍(相當(dāng)于卡格列凈25 mg的制劑配比)若干份,分別置于25 mL量瓶中,加稀釋劑適量,分別加入適量雜質(zhì)J對(duì)照品儲(chǔ)備液,確保其最終定容后為一定質(zhì)量濃度的基因毒性雜質(zhì)J限度質(zhì)量濃度溶液。超聲10 min,冷卻至室溫,用上述稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,在13 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液,得相應(yīng)質(zhì)量濃度溶液,按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,得到信噪比S/N約為3的檢測(cè)限質(zhì)量濃度0.022 7 ng/mL,信噪比S/N約為10的定量限質(zhì)量濃度0.090 8 ng/mL。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

稱取卡格列凈二甲雙胍復(fù)方片(批號(hào):181002-S)細(xì)粉末390 mg(相當(dāng)于卡格列凈25 mg),精密稱定,共2份,按照2.2.5節(jié)方法配制得到2份供試品溶液,作為樣品空白對(duì)照。稱取該批次卡格列凈二甲雙胍復(fù)方細(xì)粉390 mg,精密稱定,共9份,分別置于50 mL量瓶中,加適量稀釋液,精密量取雜質(zhì)J對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5,1.0,1.5 mL,各平行3份,加入。超聲10 min使其溶解,冷卻,加稀釋液至刻度,搖勻,在13 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min,取上清液作為基因毒性雜質(zhì)回收率50%,100%和150%的供試品溶液各3份。按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,根據(jù)雜質(zhì)J加入與測(cè)得量計(jì)算回收率和RSD,結(jié)果見(jiàn)表3,總平均回收率為95.70%,總RSD為2.54%,表明回收率良好。

表3 雜質(zhì)J回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 精密度試驗(yàn)

稱取卡格列凈二甲雙胍復(fù)方片(批號(hào):181002-S)細(xì)粉390 mg(相當(dāng)于卡格列凈25 mg),精密稱定,共6份,分別置于25 mL量瓶中,加稀釋液適量,精密量取雜質(zhì)J對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL分別加入。超聲10 min使其溶解,冷卻,加稀釋液至刻度,搖勻,在13 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min,取上清液作為基因毒雜質(zhì)的100%限度質(zhì)量濃度溶液6份。按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率和RSD,雜質(zhì)J的加入量為4.54 ng/mL,平均回收率為90.97%,RSD為1.16%,結(jié)果見(jiàn)表4,由表4可知精密度較高。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取卡格列凈二甲雙胍復(fù)方(批號(hào):181002-S)細(xì)粉390 mg,加入一定量的雜質(zhì)J儲(chǔ)備液制含有基因毒雜質(zhì)限度質(zhì)量濃度100%的雜質(zhì)溶液,分別在0,4,6,8,10,12 h進(jìn)樣。按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得基因毒雜質(zhì)限度質(zhì)量濃度的RSD為1.67%,說(shuō)明該雜質(zhì)溶液在12 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.9 樣品測(cè)定

取3批樣品,按2.2.5節(jié)方法配制供試品溶液,按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 3批樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié) 論