陳明媚，李俊杰，李曉丹,2，肖軍霞,2，郭麗萍,2

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109; 2. 青島特種食品研究院，山東青島 266109)

流行病學(xué)研究表明，經(jīng)常食用十字花科蔬菜(如西蘭花、結(jié)球甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、花椰菜、白菜)可以降低肺癌、胃癌、乳腺癌、直腸癌、膀胱癌、前列腺癌和胰腺癌等癌癥的發(fā)生[1-5]。這是由于十字花科蔬菜中含有的硫代葡萄糖苷(硫苷，glucosinolates)，在黑芥子酶(myrosinase)水解作用下生成的一系列具有生物活性的水解產(chǎn)物——異硫氰酸酯。蘿卜硫素(又稱萊菔子素，化學(xué)名稱為1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥?，sulforaphane)是4-甲基亞磺酰基丁基硫苷(glucoraphanin)在黑芥子酶的作用下形成的一種異硫氰酸酯，相對(duì)分子質(zhì)量為177.3，分子式為C6H11S2NO，結(jié)構(gòu)式如圖1[6]所示，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為有效的植物源性抗癌物質(zhì)之一，因而備受關(guān)注[7-8]。

圖1 蘿卜硫素分子結(jié)構(gòu)式

西蘭花(Brassicaoleraceavar.italica)，又稱青花菜，綠花菜，是十字花科蕓薹屬一年生植物，與花椰菜和結(jié)球甘藍(lán)同為甘藍(lán)的變種。西蘭花富含蘿卜硫素，尤其是種子及其芽苗中，因此西蘭花種子和芽苗是提取蘿卜硫素的良好來(lái)源。西蘭花種子中蘿卜硫素的形成及提取條件雖然有相關(guān)報(bào)道[9-11]， 但是都沒有進(jìn)行系統(tǒng)的研究及其條件優(yōu)化。本文研究了酶解溫度、時(shí)間、pH、Vc添加量、料液比對(duì)西蘭花種子中蘿卜硫素形成的影響，用響應(yīng)面優(yōu)化了最佳酶解條件，并通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(Gas chromatography-mass spectrometry, GC/MS)對(duì)種子中的異硫氰酸酯種類進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

西蘭花種子：‘翠綠75天’‘翠綠80天’‘碧玉’‘狼眼’‘惠綠早生’‘曼陀綠’購(gòu)自南京理想種苗有限公司；‘綠玉80天’‘文興’購(gòu)自南京金盛達(dá)種子有限公司；蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；乙腈(色譜純)：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；二氯甲烷、抗壞血酸、檸檬酸、磷酸二氫鈉等均為分析純：南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2802型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯(上海)儀器有限公司；液相色譜儀Agilent 1200：安捷倫公司；FA/JA電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；GL-20G-H型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：XDB-C18色譜柱(4.6×150 mm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；洗脫程序：0 min～25 min～30 min，10%乙腈～60%乙腈～100%乙腈。

定量方法: 以一系列濃度的蘿卜硫素標(biāo)樣溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得Y= 519.81X，R2= 0.999 9, 在1.0～ 40.0 μg/mL 范圍內(nèi)都與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2 不同品種種子中蘿卜硫素含量的測(cè)定

稱取0.2 g種子，研磨成粉末，加入8 mL蒸餾水，37 ℃水解3 h后，用二氯甲烷萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用10%的乙腈溶解，HPLC分析定量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

稱取‘綠玉80天’西蘭花種子 0.2 g，利用種子中的內(nèi)源黑芥子酶進(jìn)行酶解，在其他條件相同的情況下，分別采用不用的溫度、時(shí)間、pH值、Vc添加量、料液比(種子質(zhì)量∶蒸餾水體積)考察對(duì)蘿卜硫素的提取效果。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

水解溫度：20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃，45 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃；

水解時(shí)間：2 h，4 h， 6 h，8 h，10 h，12 h；

Vc添加量：0.02 mg/g， 0.06 mg/g， 0.10 mg/g，0.20 mg/g，0.40 mg/g，0.80 mg/g；

pH值：3，4，5，6，7，8；

料液比：1∶30 g/mL，1∶35 g/mL，1∶40 g/mL，1∶45 g/mL，1∶50 g/mL。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

表1 響應(yīng)面分析因素水平編碼表

1.3.5 GC/MS檢測(cè)條件

色譜柱：Hp-5ms石英毛細(xì)管柱；載氣：He；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫條件：50 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升溫至250 ℃保持8 min。EI離子源溫度：240 ℃；EI能量：70 eV；接口溫度：250 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；掃描范圍：50～240 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同西蘭花品種種子中的蘿卜硫素含量

從圖2可以看出，不同西蘭花品種的種子中蘿卜硫素含量差異很大，含量最高的為‘綠玉80天’，達(dá)5.35 mg/g；‘狼眼’和‘惠綠早生’次之，分別為1.74 mg/g和1.37 mg/g；相比之下，其他品種的種子中蘿卜硫素的含量較低，‘翠綠80天’‘綠翠75天’和‘曼陀綠’種子中蘿卜硫素含量不足1 mg/g。因此，西蘭花種子中蘿卜硫素的含量與品種有極大關(guān)系[12-13]。在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇‘綠玉80天’進(jìn)行。

圖2 不同西蘭花種子中蘿卜硫素含量

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 水解溫度對(duì)蘿卜硫素含量的影響

由圖3可以看出，蘿卜硫素的含量隨溫度的增高先增加后減少，當(dāng)水解溫度為40 ℃時(shí)，蘿卜硫素含量最高，這與有的研究結(jié)果并不完全一致。原因可能是與品種有關(guān)，因?yàn)椴煌贩N植物黑芥子酶的最適溫度和pH是有較大差異的[14]，本研究中的蘿卜硫素含量較高，其前體物質(zhì)4-甲基亞磺?；』蜍盏暮恳部赡茌^高，以及不同品種間黑芥子酶活性的差異也可能較大。硫代葡萄糖苷在黑芥子酶的作用下，會(huì)生成異硫氰酸酯、硫氰酸酯、腈類化合物、惡唑烷酮等一系列水解產(chǎn)物，水解同時(shí)受黑芥子酶和表皮特異硫蛋白(Epithiospecifier protein, ESP蛋白)的調(diào)控，當(dāng)ESP蛋白活性強(qiáng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腈類產(chǎn)生而降低異硫氰酸酯的含量[15]。研究表明，當(dāng)加熱溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，ESP蛋白的活性會(huì)受到抑制，而黑芥子酶的活性較高，會(huì)產(chǎn)生更多的蘿卜硫素[16]。本研究中水解時(shí)間較長(zhǎng)，黑芥子酶在相對(duì)較低的溫度下長(zhǎng)時(shí)間加熱，其活性也可能會(huì)降低，因此導(dǎo)致溫度升高到45 ℃后蘿卜硫素的產(chǎn)量下降。

圖3 溫度對(duì)蘿卜硫素含量的影響

2.2.2 水解時(shí)間對(duì)蘿卜硫素含量的影響

由圖4可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蘿卜硫素含量先增加后減少，當(dāng)酶解時(shí)間為6 h時(shí)，蘿卜硫素含量達(dá)到最高。在一定溫度下水解，可能隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，黑芥子酶的活性會(huì)有所降低，也可能已經(jīng)形成的蘿卜硫素在水溶液中不穩(wěn)定，發(fā)生降解反應(yīng)導(dǎo)致其含量變少。綜合考慮，水解時(shí)間控制在4～6 h為佳。

圖4 時(shí)間對(duì)蘿卜硫素含量的影響

2.2.3 Vc添加量對(duì)蘿卜硫素含量的影響

Vc被認(rèn)為是黑芥子酶的激活劑，有助于蘿卜硫素的形成[15]。從圖5可以看出，添加Vc后蘿卜硫素含量有所增加，但是當(dāng)超過(guò)0.1 mg/g后，反而會(huì)降低。Shen等[17]研究表明，添加一定的抗壞血酸后，西蘭花種子酶解產(chǎn)生蘿卜硫素的產(chǎn)量較未添加者增加，但添加量過(guò)大時(shí)反而會(huì)抑制蘿卜硫素的生成。本文的研究也得到了相似的結(jié)果，可能Vc添加過(guò)量之后會(huì)抑制黑芥子酶的活性從而導(dǎo)致蘿卜硫素形成減少。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，Vc的添加量控制在0.02～0.1 mg/g較好。

圖5 Vc添加量對(duì)蘿卜硫素含量的影響

2.2.4 pH值對(duì)蘿卜硫素含量的影響

從圖6中可以看出，當(dāng)pH值為5、6、7時(shí)，蘿卜硫素含量較多，但在pH值5、6、7之間無(wú)顯著差異(p>0.05)，但是當(dāng)pH值繼續(xù)降低時(shí)，蘿卜硫素生成會(huì)減少，當(dāng)pH為3時(shí)，蘿卜硫素含量比pH為5時(shí)少58.5%，這是因?yàn)楫?dāng)pH<5時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腈類物質(zhì)的產(chǎn)生，從而使異硫氰酸酯的含量減少[18]。調(diào)整pH值后水解與直接用蒸餾水水解結(jié)果無(wú)顯著性差異(p>0.05)，一般蒸餾水pH值在5.5～7，經(jīng)檢測(cè)，本試驗(yàn)所用蒸餾水pH值為5.52。因此，無(wú)須調(diào)整pH值進(jìn)行水解。有研究表明，黑芥子酶在pH值5～7保持穩(wěn)定[19]，pH值無(wú)論過(guò)高或過(guò)低，黑芥子酶活降低，而降低蘿卜硫素含量。

圖6 pH值對(duì)蘿卜硫素含量的影響

2.2.5 料液比對(duì)蘿卜硫素含量的影響

由圖7可以看出，當(dāng)料液比為1∶35～1∶45時(shí)，蘿卜硫素含量較多，隨著蒸餾水體積的增加，蘿卜硫素含量反而降低，這可能是因?yàn)橄让附庠儆枚燃淄檩腿√}卜硫素，酶解用水體積不斷增加，而萃取溶劑不變，反而導(dǎo)致萃取效率的下降，因而導(dǎo)致蘿卜硫素含量降低。

圖7 料液比值對(duì)蘿卜硫素含量的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解生成蘿卜硫素的條件

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型：Y=6.248-0.185X1+0.34X2+0.025X3-0.015 X1X2-0.035 X1X3-0.010 X2X3-0.41 X12-0.17 X22-0.12 X32

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

回歸分析中決定系數(shù)R2為0.971 5，表明方程的擬合度和可信度均很高，此模型可用于酶解蘿卜硫素的條件分析和預(yù)測(cè)。

方差分析結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，模型的p<0.000 1，即對(duì)建立的水解條件的回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明二次模型相關(guān)性良好。

由表3和圖8a顯示，溫度的一次項(xiàng)(p<0.005)和二次項(xiàng)(p<0.000 1)顯著影響蘿卜硫素的含量，時(shí)間的一次項(xiàng)(p<0.000 1)和二次項(xiàng)(p<0.05)顯著影響蘿卜硫素的含量，但溫度和時(shí)間的交互作用不顯著(p=0.749 1)。在一定的水解時(shí)間下，隨著水解溫度的增加蘿卜硫素的含量先增加后減少；在一定的溫度下，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，蘿卜硫素的含量也增加。

表3 回歸模型方差分析

圖8b顯示Vc添加量的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)于蘿卜硫素含量影響不顯著，與溫度的交互作用也不顯著。圖8c顯示在一定的Vc添加量下，隨著時(shí)間的增加，蘿卜硫素的含量增加。但是時(shí)間和Vc添加量?jī)烧呓换プ饔貌伙@著。

圖8 因素交互作用響應(yīng)面圖

2.4 工藝條件優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，運(yùn)用試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷玫矫附馍商}卜硫素的最佳條件為：水解溫度39.06 ℃、水解時(shí)間5.8 h、Vc添加量0.07 mg/g，為便于操作將溫度設(shè)為39 ℃。為考察模型的可靠性和準(zhǔn)確性，進(jìn)行單因素最佳試驗(yàn)條件和隨機(jī)組合進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。在響應(yīng)面優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，蘿卜硫素的含量為6.41 mg/g，明顯高于單因素最佳條件和隨機(jī)組合，故本研究?jī)?yōu)化的水解生成蘿卜硫素的條件具有實(shí)用價(jià)值。

表4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 酶解產(chǎn)物的GC-MS檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)GC-MS分析，通過(guò)在線計(jì)算機(jī)譜庫(kù)檢索，在‘綠玉80’西蘭花種子水解產(chǎn)物中共檢測(cè)出9種異硫氰酸酯及其腈類物質(zhì)，其譜庫(kù)檢索相關(guān)性都很高。結(jié)果如表5所示?？梢钥闯觯}卜硫素占總異硫氰酸酯及腈類的74.42%，為主要的酶解產(chǎn)物，其次是1-丁烯基異硫氰酸酯，占12.17%，蘿卜硫腈僅為0.22%，表明ESP蛋白的活性很低。因此，綠玉是很好的蘿卜硫素的來(lái)源。通過(guò)對(duì)8個(gè)品種進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，綠玉的發(fā)芽率非常低，約20%；文興的發(fā)芽率也較低，為60%左右；其他種子發(fā)芽率都很高，大于90%。因此，綠玉只適合蘿卜硫素的提取，并不適合種植。

表5 酶解產(chǎn)物的GC-MS檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化分析得到西蘭花種子酶解的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=6.248-0.185X1+0.34X2+0.025X3-0.015 X1X2-0.035 X1X3-0.010 X2X3-0.41 X12-0.17 X22-0.12 X32。

溫度和時(shí)間的一次項(xiàng)(p<0.005)和二次項(xiàng)(p<0.000 1)顯著影響蘿卜硫素的含量，通過(guò)單因素及響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳酶解條件是溫度為39 ℃，水解時(shí)間為5.8 h，Vc添加量為0.07 mg/g，料液比1∶35，蘿卜硫素的得率為6.41 mg/g。

通過(guò)GC-MS檢測(cè)分析了酶解產(chǎn)物，鑒定出了9種化合物，其中蘿卜硫素的含量最多，占總異硫氰酸酯的74.42%，其次為1-丁烯基異硫氰酸酯，占12.17%。為蘿卜硫素的提取及研究奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。