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草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

2021-07-07 11:06:00高鳴鄉(xiāng)蔣佩文李敏惠
關(guān)鍵詞:草果膜電位揮發(fā)油

高鳴鄉(xiāng),蔣佩文,李敏惠,楊 平,代 敏

1成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院;2成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心;4成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,成都 610500

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency For Research on Cancer,IARC)估計(jì),2020年全球?qū)⒂?10,677例新增的NPC病例,且763 570 000例患者或?qū)⑺烙谶@種癌癥[1]。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),約80%NPC發(fā)生在中國(guó),嚴(yán)重危害人民健康和生命安全,是中國(guó)重點(diǎn)防治的惡性腫瘤之一[2]。目前,放射和化學(xué)藥物治療是其主要的治療手段,而局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移又是治療失敗的主要原因[3];治療鼻咽癌的藥物主要有紫杉醇類(lèi)、順鉑、5-氟尿嘧啶、西妥昔單抗[4,5]等,但這些抗腫瘤藥物多為非特異性藥物,伴有淋巴細(xì)胞減少、黏膜炎、咽喉/口腔疼痛、貧血、皮疹等毒副作用[6]。因此,為了更有效的治療鼻咽癌,學(xué)者們致力于靶向性強(qiáng)、毒副作用小的抗鼻咽癌的新型天然藥物研發(fā)。

草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemaire)為姜科豆蔻屬植物草果的干燥成熟果實(shí),主產(chǎn)于廣西、云南、貴州等地,是我國(guó)重要的藥食兩用植物[7];中醫(yī)認(rèn)為其具有燥濕溫中、截瘧除痰的功效,主治寒濕內(nèi)阻,痞滿嘔吐,瘧疾寒熱,瘟疫發(fā)熱等癥狀,廣泛用于治療痔瘡、咽喉感染、消化系統(tǒng)疾病、惡心和腹痛等病癥[8,9]。現(xiàn)代研究表明,草果具有降脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、防霉和抗炎鎮(zhèn)痛等生物活性[10]。草果揮發(fā)油作為草果重要的活性成分,其包含1,8-桉葉素、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸香葉酯、芳樟醇、反-橙花叔醇、β-月桂烯等,具有抗氧化、調(diào)節(jié)胃腸、抗菌、抗腫瘤及改變藥物通透性等生物活性[11],但其在抗腫瘤活性方面的研究較少,目前僅有草果揮發(fā)油抗肝癌的研究[12],而關(guān)于草果揮發(fā)油抑制鼻咽癌的相關(guān)研究尚無(wú)報(bào)道?;诖耍狙芯繑M通過(guò)探討草果揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖的抑制作用,闡釋其作用機(jī)制,為草果揮發(fā)油在抗鼻咽癌等腫瘤的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

草果購(gòu)自北京同仁堂,產(chǎn)于云南,由成都醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)專(zhuān)家李弈教授鑒定為草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemaire)。

1.2 腫瘤細(xì)胞

鼻咽癌6-10B細(xì)胞,四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng),已在原實(shí)驗(yàn)室完成細(xì)胞STR鑒定,保存于成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 主要試劑

胎牛血清(Cat.No.10100147)、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Cat.No.11965-092)(Gibco公司);CCK-8檢測(cè)試劑盒(Cat.No.CK04)(日本同仁化學(xué)研究所);Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(Cat.No.KGA108-2)(凱基生物公司);線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(Cat.No.MAK160)、蛋白酶抑制劑Cocktail(Cat.No.11206893001)(Roche公司);通用蛋白裂解液(百泰克生物公司);BCA蛋白定量試劑盒(Cat.No.7780)、抗GAPDH(Cat.No.5174)、促凋亡及抗凋亡BCL-2家族抗體試劑盒(Cat.No.5023、Cat.No.2933、Cat.No.4223、Cat.No.2764)、抗Caspase-3(Cat.No.14220)、抗PARP(Cat.No.9542)、抗Caspase-7/9(Cat.No.12827、Cat.No.9502)、抗cleaved Caspase-7/9抗體(Cat.No.8438、Cat.No.52873)和羊抗兔IgG抗體(Cat.No.7074)(Cell Signaling Technology公司)。

1.4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱和生物安全柜(Thermo公司);低溫離心機(jī)和高速離心機(jī)(Eppendorf公司);水平離心機(jī)(浙江湘儀公司);超純水機(jī)Direct Q5(Millipore公司);酶標(biāo)儀(Bioteke公司);流式細(xì)胞儀NovoCyte(ACEA公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 草果揮發(fā)油的提取及其制備

草果揮發(fā)油采用水蒸氣蒸餾法提取[13],密度ρ=929 mg/mL。采用吐溫-80進(jìn)行乳化,乳化后用無(wú)菌超純水進(jìn)行稀釋。

2.2 草果揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞的增殖抑制試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)篩選草果揮發(fā)油抑制鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖活性的濃度,確定具有增殖抑制活性的5個(gè)不同濃度(0.058、0.12、0.23、0.46和0.93 mg/mL)。采用上述5個(gè)不同濃度的草果揮發(fā)油處理鼻咽癌6-10B細(xì)胞24 h,CCK-8法[14]檢測(cè)草果揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞的抑制情況,并用GraphPad Prism 7繪制鼻咽癌6-10B細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線。

2.3 草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用上述5個(gè)不同濃度草果揮發(fā)油處理鼻咽癌6-10B細(xì)胞24 h,倒置顯微鏡下(20×物鏡)觀察鼻咽癌6-10B細(xì)胞形態(tài)變化。綜合分析細(xì)胞增殖抑制活性、細(xì)胞毒性和形態(tài)學(xué)結(jié)果,選擇明顯引起細(xì)胞凋亡的3個(gè)不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理,探討其作用機(jī)制。采用Annexin V/PI雙染法[15],通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)3個(gè)不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理鼻咽癌6-10B細(xì)胞24 h后,對(duì)鼻咽癌6-10B腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng),以未處理組為空白對(duì)照。

2.4 草果揮發(fā)油作用鼻咽癌6-10B細(xì)胞后線粒體膜電位檢測(cè)

JC-1是一種用于檢測(cè)線粒體膜電位的陽(yáng)離子親脂性熒光探針[16],可通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度來(lái)監(jiān)測(cè)線粒體膜電位的改變。3個(gè)不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理鼻咽癌6-10B細(xì)胞24 h,JC-1染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)鼻咽癌6-10B細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況,以未處理組為空白對(duì)照。

2.5 草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡的蛋白檢測(cè)

3個(gè)不同濃度的草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理鼻咽癌6-10B細(xì)胞24 h后,采用Western blot法[17],分析凋亡通路相關(guān)蛋白PARP、Caspase-3/7/9及其cleaved片段,以及線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xL等表達(dá)情況,以未處理組為對(duì)照。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 草果揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞的增殖抑制作用

結(jié)果顯示,草果揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞具有增殖抑制作用,且呈劑量依賴(lài)性,24 h的IC50為0.14 mg/mL(見(jiàn)圖1)。

圖1 草果揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線Fig.1 Growth inhibition curve of nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells treated by A.tsaoko essential oil

3.2 草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡

3個(gè)不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理后,鼻咽癌6-10B細(xì)胞可見(jiàn)典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,即細(xì)胞皺縮、變圓,核染色質(zhì)致密深染,形成致密質(zhì)塊,細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,晚期可見(jiàn)凋亡小體(見(jiàn)圖2B)。而草果揮發(fā)油在較高濃度(0.93和0.46 mg/mL)呈細(xì)胞毒性作用,鼻咽癌6-10B細(xì)胞呈現(xiàn)死亡現(xiàn)象,貼壁細(xì)胞出現(xiàn)完全脫落、變形和膜破裂(見(jiàn)圖2C)。

圖2 草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Fig.2 Morphological change on nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注:A:空白對(duì)照組;B:0.23 mg/mL草果揮發(fā)油;C:0.46 mg/mL草果揮發(fā)油。Note:A:Blank control;B:0.23 mg/mL A.tsaoko essential oil;C:0.46 mg/mL A.tsaoko essential oil.

形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,高濃度(0.93 mg/mL和0.46 mg/mL)草果揮發(fā)油使6-10B細(xì)胞破碎裂解,發(fā)揮明顯的細(xì)胞毒作用;而在較低濃度(0.23、0.12和0.058 mg/mL)草果揮發(fā)油作用下,鼻咽癌6-10B細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)現(xiàn)象。進(jìn)一步用Annexin V/PI雙染法、流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證藥物的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng),結(jié)果顯示:不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞具有明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋的作用,其中凋亡細(xì)胞所占比例分別為47.51%、33.91%、23.22%(對(duì)照組為2.76%),呈典型劑量依賴(lài)性(見(jiàn)圖3)。

圖3 草果揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用Fig.3 Apoptosis in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注:A:不同濃度草果揮發(fā)油作用6-10B細(xì)胞 24 h后的凋亡檢測(cè)圖;B:凋亡率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(*P<0.05)。Note:A is the apoptosis detection diagram of 6-10B cells exposed to different concentrations of A.tsaoko essential oil for 24 h;B is a statistical analysis of the apoptotic rate (*P<0.05).

3.3 草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡蛋白改變

用對(duì)6-10B細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的草果揮發(fā)油作用濃度(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理鼻咽癌6-10B細(xì)胞24 h,Western blot法分析凋亡通路相關(guān)蛋白PARP和Caspase-3/7/9及其cleaved片段的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)鼻咽癌6-10B細(xì)胞PARP和Caspase-7/9的cleaved片段表達(dá)明顯增加,較空白對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

圖4 草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白差異表達(dá)Fig.4 Expression of apoptosis-related proteins in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注:A:草果揮發(fā)油作用6-10B細(xì)胞24 h后凋亡標(biāo)志性蛋白表達(dá);B:蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(*P<0.05)。Note:A shows the expression of apoptotic marker proteins after treatment with Amomum tsaoko essential oil was applied to 6-10B cells for 24 h;B is the data statistical analysis of protein expression (*P<0.05).

3.4 草果揮發(fā)油通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡

JC-1染色和流式檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位(MMP),發(fā)現(xiàn)草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)作用6-10B細(xì)胞24 h后,藥物組較對(duì)空白照組(2%)的線粒體膜電位明顯改變,其比例分別為:32.68%、43.24%和8.22%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖5)。提示線粒體凋亡途徑極有可能參與了草果揮發(fā)油誘導(dǎo)的鼻咽癌6-10B腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程。

圖5 草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞的線粒體膜電位改變Fig.1 The change of mitochondrial membrane potential in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A。 tsaoko essential oil注:A:草果揮發(fā)油作用6-10B細(xì)胞24 h后的線粒體膜電位變化趨勢(shì);B:線粒體膜電位改變的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(*P<0.05)。Note:A shows the change trend of mitochondrial membrane potential of 6-10B cells after 24 h treatment with A.tsaoko essential oil;B is a statistical analysis of changes in mitochondrial membrane potential (*P<0.05).

Western blot進(jìn)一步分析線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)情況,結(jié)果顯示鼻咽癌6-10B細(xì)胞經(jīng)草果揮發(fā)油處理后,凋亡蛋白Bax和Bim表達(dá)升高,Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)(見(jiàn)圖6)。推測(cè)線粒體凋亡途徑參與了草果揮發(fā)油誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

圖6 草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞線粒體途徑相關(guān)蛋白差異表達(dá)Fig.6 Differential expression of mitochondrial pathway-related proteins in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注:A:草果揮發(fā)油處理24 h后6-10B細(xì)胞的線粒體途徑相關(guān)蛋白表達(dá)變化;B:蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(*P<0.05)。Note:A shows the changes of mitochondrial pathway related proteins expression in 6-10B cells after 24 h treatment with A.tsaoko essential oil;B is the statistical analysis of protein expression data (*P<0.05).

4 討論

鼻咽癌為頭頸部上皮細(xì)胞惡性腫瘤,其主要病理類(lèi)型為非角化型未分化癌。早期鼻咽癌單純放療效果相對(duì)較好,而晚期病變的治療效果欠佳,所以嘗試將放療和化療結(jié)合用于治療晚期鼻咽癌[18]。但是,目前常用的化療藥物又存在耐藥性和高劑量等缺點(diǎn)[19]。因此,學(xué)者們致力于探索天然藥物治療鼻咽癌的效果,研究表明,吐根堿、番茄堿苷和喜樹(shù)堿等生物堿類(lèi)化合物,以及腫節(jié)風(fēng)提取物等多種天然產(chǎn)物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖有一定抑制作用[20,21]。

草果揮發(fā)油是草果主要活性成分,具有抗氧化、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗菌、抗腫瘤及改變藥物通透性等作用[22]。關(guān)于草果揮發(fā)油抗腫瘤研究鮮有報(bào)道,僅見(jiàn)Zhang[12]報(bào)道草果揮發(fā)油具有抑制肝癌細(xì)胞增殖作用。本研究首次對(duì)草果揮發(fā)油抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行探討,結(jié)果發(fā)現(xiàn)草果揮發(fā)油對(duì)6-10B細(xì)胞有增殖抑制作用,且呈劑量依賴(lài)性,24 h的IC50為0.14 mg/mL;同時(shí)形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,在高濃度(0.93和0.46 mg/mL)草果揮發(fā)油的作用下,腫瘤細(xì)胞完全破碎裂解,而低濃度(0.23、0.12和0.058 mg/mL)草果揮發(fā)油卻對(duì)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞6-10B具有明顯的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一,線粒體膜電位改變(Δψm)是細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志[16]。本研究發(fā)現(xiàn)藥物濃度為0.23、0.12和0.058 mg/mL的草果揮發(fā)油作用6-10B細(xì)胞24 h后,線粒體膜電位明顯改變,提示線粒體凋亡途徑參與了草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程。Bcl-2家族蛋白[23]在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮極為重要的調(diào)控作用。外界凋亡刺激因素激活促凋亡因子(如Bax、Bim等),促使線粒體膜電位改變,導(dǎo)致線粒體膨脹,外膜通透性增加,細(xì)胞色素C釋放,Caspase-9激活,從而引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Western blot進(jìn)一步分析線粒體途徑相關(guān)蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xL及凋亡標(biāo)志性蛋白Caspase-3/7/9、PARP等的表達(dá)水平變化,結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了草果揮發(fā)油通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡。

綜上,草果揮發(fā)油體外對(duì)鼻咽癌細(xì)胞有明顯增殖抑制作用,可通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)6-10B細(xì)胞發(fā)生凋亡,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng);課題組后續(xù)將深入探討草果揮發(fā)油體內(nèi)治療鼻咽癌的療效及其作用機(jī)制,并分析其對(duì)其它腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用,這些研究將為草果揮發(fā)油在后續(xù)抗腫瘤天然藥物開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)也為藥食兩用植物—草果的綜合開(kāi)發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

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