晏 菲，高佳蓉，張小飛，鄒俊波，賈妍卓，王雯翡，史亞軍

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，咸陽 712046

“頭風(fēng)”最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，“白鮮，味苦，寒。主治頭風(fēng)”?！栋Y治準繩·頭痛》云：“醫(yī)書多分頭痛頭風(fēng)為二門，然一病也，但有新久去留之分耳。淺而近者名頭痛，其痛卒然而至，易于解散速安也。深而遠者為頭風(fēng)，其病作止不常，愈后遷觸復(fù)發(fā)也。”現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，頭風(fēng)病是一種慢性陣發(fā)性頭痛為主要表現(xiàn)的疾病，相當于西醫(yī)的偏頭痛、緊張性頭痛和叢集性頭痛等原發(fā)性頭痛。發(fā)病間歇期間狀如常人，一旦受到誘因刺激，便頭痛劇烈，每次發(fā)作性質(zhì)相似，病程較長，容易反復(fù)發(fā)作。僅偏頭痛一項在全球的發(fā)病率為8.4%～28%，終生發(fā)病率約為14.0%，大約18.2%的女性和6.5%的男性患有偏頭痛[1]。偏頭痛在全球的傷殘調(diào)整生命年數(shù)(disability-adjusted life-years，DALYs)從1990年到2015年增加了49.5%，為僅次于卒中的第二大DALYs[2]。西醫(yī)治療以應(yīng)用非甾體類抗炎藥、曲普坦類藥物、阿片類藥物、麥角類制劑為主，但有較大的副作用，且易反復(fù)。傳統(tǒng)口服中藥服藥時間長，且不能立即緩解癥狀。針灸治療可疏通經(jīng)絡(luò)，改善患者血管內(nèi)皮細胞功能，但僅能減輕疼痛強度，減少發(fā)作次數(shù)、縮短持續(xù)時間，需與藥物結(jié)合才能起到更好的效果。

生姜是姜科多年生草本植物姜Zingiberofficinale Rosc.的新鮮根莖。味辛，性微溫。具有解表散寒，溫中止嘔等功效[3]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)使用生姜治療頭風(fēng)病早有記載，《名醫(yī)類案》曰：“以生姜自然汁少許，灌入鼻中，其痛立止”治療頑固性頭風(fēng)痛。現(xiàn)代研究表明，生姜揮發(fā)油具有鎮(zhèn)痛、興奮與鎮(zhèn)靜，抗氧化和對缺血性腦損傷的保護作用，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有興奮和抑制的雙向調(diào)節(jié)作用[4]。生姜揮發(fā)油脂溶性強，極性較小，而鼻黏膜為脂質(zhì)膜，極性小、脂溶性強的物質(zhì)易于通過，本研究擬將生姜揮發(fā)油制成鼻腔給藥制劑，可經(jīng)“鼻-腦” 通路向腦區(qū)高效遞藥而呈現(xiàn)顯著的腦靶向作用[5]，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析生姜揮發(fā)油、頭風(fēng)病、靶點之間作用的關(guān)系，構(gòu)建“化合物—靶點—通路—疾病”間的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，對生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的作用機制進行探討，為后期制劑研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

BT-25S型十萬分之一電子天平(賽多利斯上海貿(mào)易有限公司)；Agilent 7890B/5977B氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)。

生姜(購于陜西西安市農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級實驗師鑒定為姜科姜屬植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖)。乙酸乙酯、無水硫酸鈉為分析純。

1.2 方法

1.2.1 生姜揮發(fā)油化學(xué)成分的測定

照《中國藥典》2020版一部生姜項下?lián)]發(fā)油提取方法提取揮發(fā)油，生姜破碎成小塊，加10倍量水，浸泡30 min，水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集揮發(fā)油，以適量乙醚溶解，無水硫酸鈉脫水干燥后備用[6]。

采用GC-MS技術(shù)測定生姜揮發(fā)油的化學(xué)成分。氣相色譜條件：Agilent HP-5 ms(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細管色譜柱，載氣為氦氣，進樣量1 μL，分流比5:1，分流流量5 mL/min，程序升溫初始溫度70 ℃(10 min)，10 ℃/min至95 ℃，5 ℃/min至125 ℃，6 ℃/min至240 ℃，1 ℃/min至260 ℃。質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質(zhì)量范圍(m/z)20～450 amu，溶劑延遲3 min，采用DataAnalysis將閾值調(diào)為21，篩選化學(xué)成分[7]。

1.2.2 生姜揮發(fā)油作用靶點的預(yù)測

利用GC-MS測定的生姜揮發(fā)油化學(xué)成分借助TCMSP和Swiss Target Prediction在線分析工具對生姜揮發(fā)油的靶點進行預(yù)測。

1.2.3 頭風(fēng)病疾病相關(guān)靶點的預(yù)測

頭風(fēng)病相當于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的偏頭痛、緊張性頭痛、叢集性頭痛等原發(fā)性頭痛。為了較完全的預(yù)測頭風(fēng)病疾病的靶點，以頭風(fēng)病(head wind disease)、偏頭痛(migraine)、緊張性頭痛(tension headache)、叢集性頭痛(cluster headache)作為關(guān)鍵詞，在Drugbank、OMIM和DisGeNET數(shù)據(jù)庫對頭風(fēng)病疾病相關(guān)靶點進行檢索。

1.2.4 生姜揮發(fā)油化學(xué)成分—頭風(fēng)病疾病靶點的交集

將生姜揮發(fā)油化學(xué)成分的靶點與頭風(fēng)病疾病的靶點分別導(dǎo)入在線網(wǎng)站Venny 2.1.0中繪制維恩圖，重疊部分為兩者的交集，即生姜揮發(fā)油化學(xué)成分直接作用于頭風(fēng)病的靶點。

1.2.5 “成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將生姜揮發(fā)油化學(xué)成分與1.2.4中的交集靶點分別導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建生姜揮發(fā)油化學(xué)成分—交集靶點信息網(wǎng)絡(luò)。在信息網(wǎng)絡(luò)中，邊表示蛋白與蛋白的相互關(guān)系，線條的粗細代表關(guān)聯(lián)度等級。

1.2.6 蛋白—蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.2.4中獲得的交集導(dǎo)入String中獲取PPI網(wǎng)絡(luò)功能富集分析，將結(jié)果以TSV文件保存并上傳至Cytoscape 3.7.2軟件對靶點進行可視化分析，得到生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)并對其進行拓撲分析。

1.2.7 GO富集分析與KEGG富集分析

R語言ClusterProfiler包[8]可以對基因集合進行統(tǒng)計分析和可視化。利用ClusterProfiler包對交集靶點進行GO和KEGG富集分析，得到與生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病生物過程、細胞組分、分子功能及主要通路等有關(guān)的富集項。

1.2.8 分子對接

利用Discovery Studio 4.0軟件進行分子對接。在生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中選取核心靶點，借助PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)找出靶點score值排序靠前的靶點蛋白結(jié)構(gòu)，配體為該靶點所對應(yīng)的化合物，利用Drugbank在線平臺找出核心靶點對應(yīng)的陽性藥物并在Pub Chem中下載陽性藥物和所對應(yīng)化合物的2D結(jié)構(gòu)。將整理好的靶點蛋白3D結(jié)構(gòu)和對應(yīng)化合物及陽性藥物的2D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Discovery Studio，使用DOCK ligand(libDock)進行分子對接，得到核心靶點蛋白和對應(yīng)化合物及陽性藥物的相互作用關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 生姜揮發(fā)油的化學(xué)成分

通過GC-MS測定出生姜揮發(fā)油的化學(xué)成分有53種(見表1)，成分總離子譜圖見圖1。

表1 生姜揮發(fā)油化學(xué)成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖1 生姜揮發(fā)油成分總離子譜圖Fig.1 Total ion spectrum of ginger volatile oil

2.2 生姜揮發(fā)油化學(xué)成分作用靶點的收集

將生姜揮發(fā)油的化學(xué)成分在TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進行作用靶點預(yù)測，共獲得作用靶點3 816個，刪除重復(fù)項，獲取生姜揮發(fā)油化學(xué)成分靶點509個。

2.3 頭風(fēng)病基因靶點的收集

通過Drugbank、OMIM和DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集頭風(fēng)病疾病的基因靶點共1 507個，刪除重復(fù)項，得到靶點915個。

2.4 生姜揮發(fā)油化學(xué)成分—頭風(fēng)病疾病靶點的交集結(jié)果

利用檢索得到的生姜揮發(fā)油的509個靶點與頭風(fēng)病的915個疾病靶點繪制維恩圖，得到交集基因130個(見圖2)。說明生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病可能是通過這130個靶點發(fā)揮作用。

圖2 生姜揮發(fā)油化學(xué)成分靶點與頭風(fēng)病疾病靶點維恩圖Fig.2 Venn diagram of chemical component target of ginger volatile oil and head wind disease target

2.5 “成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

將2.4得到的交集靶點，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中建立 “生姜化學(xué)成分—交集靶點”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)由178個節(jié)點組成1 400條邊，其中最大自由度值為86，平均自由度為14.034(見圖3)。圖中左邊淺藍色三角代表生姜揮發(fā)油的化學(xué)成分，右邊紅色圓圈代表藥物—疾病的交集靶點，大小根據(jù)自由度排序，展示成分與各交集靶點之間的關(guān)系。

圖3 “生姜揮發(fā)油化學(xué)成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of "chemical component of ginger volatile oil-intersection target"

2.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用String網(wǎng)站對130個交集基因進行分析，通過Cytoscape 3.7.2軟件對分析得到的數(shù)據(jù)進行可視化分析，得到生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)并進行拓撲分析。根據(jù)度的大小得到62個主要節(jié)點，642條邊，平均自由度為16.726(見圖4)。即62個頭風(fēng)病相關(guān)的關(guān)鍵靶點和642條與頭風(fēng)病靶點蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，圖中每個圓圈代表每個交集靶點，大小及顏色深淺顯示其自由度的大小。

圖4 生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease target

在生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病作用PPI網(wǎng)絡(luò)中，APP、OPRM1、ADRA2A、ADRA2C、HTR1A、DRD2、DRD4、DRD3、ADRA2B、OPRK1是度值最大的10個節(jié)點，即生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的關(guān)鍵靶點，可能在生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的過程中具有重要作用。

2.7 GO富集分析與KEGG富集分析

2.7.1 生物過程(BP)分析

對生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的潛在靶點進行GO分析，BP分析得到1 148個富集項，按照顯著性大小排序，前20項最具顯著性的BP見圖5，生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病和與環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、血管管徑調(diào)節(jié)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管突起、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、血管內(nèi)徑負調(diào)控等生物過程密切相關(guān)。通過Clusterprofiler包構(gòu)建BP分析GO交互網(wǎng)絡(luò)(見圖6)，圖中大紅色節(jié)點代表著更顯著的路徑。

圖5 生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病潛在靶點GO富集分析(BP)Fig.5 GO enrichment analysis of potential targets of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease(BP)

圖6 生物過程(BP)重點通路圖Fig.6 Key pathway map of biological process

2.7.2 細胞組分(CC)分析

CC分析得到72個富集項，前20項最具顯著性的CC見圖7，生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病與突觸后膜、突觸膜、突觸后膜的組成部分、突觸后膜的固有成分以及突觸膜的整體成分等細胞組分密切相關(guān)。CC分析GO交互網(wǎng)絡(luò)見圖8。

圖8 細胞組分重點通路圖Fig.8 Key pathway map of cellular component

2.7.3 分子功能(MF)分析

MF分析得到141個富集項，前20項最具顯著性的MF見圖9，生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)與G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、5-羥色胺受體活性等分子功能密切相關(guān)。MF分析GO交互網(wǎng)絡(luò)見圖10。

圖9 生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病潛在靶點GO富集分析(MF)Fig.9 GO enrichment analysis of potential targets of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease(MF)

圖10 分子功能重點通路圖Fig.10 Key pathway map of molecular function

2.7.4 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集結(jié)果見圖11，共得到77個富集項，前20項最具顯著性的通路見圖8。結(jié)果顯示，神經(jīng)活性配體—受體相互作用通路是最顯著的代謝通路，可能是生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病最重要的通路，Ca2+信號通路、含血清素的神經(jīng)突觸、cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路等可能是較重要的通路。血清素5-羥色胺(5-HT)是含血清素的神經(jīng)突觸通路中發(fā)揮作用的重要物質(zhì)，作用過程見圖12。

圖11 生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病潛在靶點KEGG通路富集分析Fig.11 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease

圖12 生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的重要通路-含血清素的神經(jīng)突觸Fig.12 An important pathway of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease-serotonergic synapse

2.8 分子對接分析

為了進一步說明靶點蛋白與對應(yīng)化合物之間的結(jié)合活性，本研究選擇生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病作用蛋白交互網(wǎng)絡(luò)中度值較高的3個核心靶點OPRM1、ADRA2A和DRD2，與其對應(yīng)的化合物進行分子對接，結(jié)合活性越高，得分越高(見表2)。其中橙花叔醇與OPRM1，可巴烯與ADRA2A，金合歡醛與DRD2的結(jié)合活性最高。利用Discovery Studio 4.0軟件進行陽性藥物驗證實驗和分子對接，并選擇與表2中對接得分最高的化合物即核心成分進行比較，對比情況見表3。核心靶點與核心成分、陽性藥物的對接結(jié)果見圖13。結(jié)果表明，3個核心靶點與核心成分的對接得分均高于與陽性藥物的對接得分。

圖13 核心靶點與核心成分、陽性藥物分子對接圖Fig.13 Molecular docking results of core targets combined with core components and positive drugs注：A.OPRM1-橙花叔醇；B.OPRM1-嗎啡；C.ADRA2A-可巴烯；D.ADRA2A-溴莫尼定；E.DRD2-金合歡醛；F.DRD2-阿樸嗎啡。Note:A.OPRM1-Nerolidol;B.OPRM1-Morphine;C.ADRA2A-Copaene;D.ADRA2A-Brimonidine;E.DRD2-2,6,10-Dodecatrienal,3,7,11-trimethyl-,(E,E)-;F.DRD2-Apomorphine.

表2 核心靶點與對應(yīng)化合物結(jié)合活性得分表

表3 核心靶點與核心成分、陽性藥物的結(jié)合活性得分對比

3 討論

中醫(yī)學(xué)認為，頭風(fēng)病其病因為內(nèi)感和外傷兩端，臨證時難以用單一病機概括，為風(fēng)、瘀、寒、痰、虛雜合致病?！吨T病源候論》謂“頭面風(fēng)者，是體虛，諸陽經(jīng)脈為風(fēng)所乘”。風(fēng)邪為最主要的致病因素，與頭風(fēng)病的發(fā)作與反復(fù)有密切關(guān)系。Wu等[9]整理了秦漢至晚清1911年現(xiàn)存的治療頭痛的古代醫(yī)學(xué)論著及文獻資料，解表藥及辛味藥物使用頻次為最高，以解表藥祛除外感風(fēng)寒或風(fēng)熱，其中生姜在所有藥物中的使用頻次占第5位。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對生姜揮發(fā)油的主要活性成分、作用靶點進行篩選并與頭風(fēng)病的靶點進行交集，建立生姜揮發(fā)油化學(xué)成分—交集靶點信息網(wǎng)絡(luò)進行生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的研究。研究表明，生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的主要活性物質(zhì)是乙酸龍腦酯、合成右旋龍腦、α-松油醇、eudesma-4,6-二烯、橙花叔醇、檸檬醛、可巴烯以及β-桉葉醇等。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出APP、OPRM1、ADRA2A、ADRA2C、HTR1A、DRD2、DRD4、DRD3、ADRA2B、OPRK1等62個可能在生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病過程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵靶點以及642條頭風(fēng)病靶點蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。

為進一步探討生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的潛在機制，利用生姜揮發(fā)油活性成分和頭風(fēng)病疾病的交集靶點進行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析共得到1 361個富集項，包括生物過程中與環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、血管管徑調(diào)節(jié)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管突起等；細胞組分中的突觸后膜、突觸膜、突觸后膜的組成部分等；分子功能中的G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、5-羥色胺受體活性等。KEGG富集分析得到了77個富集項，包括神經(jīng)活性配體—受體相互作用通路、Ca2+信號通路、含血清素的神經(jīng)突觸通路等。頭風(fēng)病的發(fā)生與多種神經(jīng)遞質(zhì)及受體有關(guān)，其為陣發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體—受體相互作用通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[10]。文獻研究表明，偏頭痛與Ca2+信號通路密切相關(guān)，抑制性突觸在調(diào)節(jié)疼痛信號傳導(dǎo)和偏頭痛產(chǎn)生的調(diào)制電路中起著關(guān)鍵作用，P/Q型Ca2+通道通常對許多中樞突觸的突觸前Ca2+進入和神經(jīng)遞質(zhì)釋放至關(guān)重要，能夠抑制或興奮神經(jīng)傳遞[11]。含血清素的神經(jīng)突觸又稱5-HT神經(jīng)通路，其與控制進食行為，體溫調(diào)節(jié)和睡眠等有關(guān)。偏頭痛患者5-HT受體結(jié)合率降低，腦內(nèi)5-HT水平升高，許多抗偏頭痛藥物與5-HT及其受體相互作用從而發(fā)揮治療作用[12,13]。富集分析結(jié)果顯示，生姜揮發(fā)油可能通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶蛋白，參與神經(jīng)活性配體—受體相互作用，Ca2+信號通路以及含血清素的神經(jīng)突觸等相關(guān)通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛治療作用。

為進一步說明蛋白與相應(yīng)配體化合物的結(jié)合活性，結(jié)合文獻報道，在生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病作用PPI網(wǎng)絡(luò)度值較大的靶點中選取3個核心靶點OPRM1、ADRA2A、DRD2，在Drugbank里找出與蛋白有關(guān)的3個陽性藥嗎啡、溴莫尼定、阿樸嗎啡，配體即為該蛋白所對應(yīng)的成分化合物。利用Discovery Studio 4.0對該蛋白和配體及陽性藥進行分子對接，結(jié)果表明，該蛋白與配體的結(jié)合活性分數(shù)高于與陽性藥的結(jié)合活性分數(shù)，即蛋白與配體的結(jié)合活性較高。在核心靶點中，OPRM1基因是μ阿片受體的編碼基因，μ阿片受體在機體的痛覺敏感性和內(nèi)源性鎮(zhèn)痛等功能中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，尤其在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)方面有非常重要的作用[14]。ADRA2A屬于G蛋白偶聯(lián)受體，存在于去甲腎上腺素神經(jīng)元中，刺激和抑制突觸后中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號通路[15,16]。ADRA2A受體的激活會產(chǎn)生選擇性的顱腦血管收縮作用[17]。DRD2主要位于腦部，是黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的主要靶點[18]。偏頭痛患者發(fā)作期內(nèi)源性多巴胺釋放減少和波動[19]。DRD2基因多態(tài)性與中國漢族女性偏頭痛的發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)，偏頭痛患者血漿DRD2水平較高，女性偏頭痛患者的DRD2水平明顯高于男性偏頭痛患者[20]。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法證實了生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的作用，預(yù)測了生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的潛在靶點以及治療頭風(fēng)病作用相關(guān)的信號通路和生物過程，揭示了生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病是多成分、多靶點、多通路的作用結(jié)果。本研究對生姜揮發(fā)油治療頭風(fēng)病的作用機制及實驗驗證提供了理論依據(jù)，以期對后期的制劑研究、藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。