姚云平 于淼航 陳麗媛 劉 丹 李昌模，2

(1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.桂發(fā)祥十八街麻花食品〔天津〕有限公司，天津 300221)

油脂在工業(yè)生產(chǎn)以及人們?nèi)粘Ｉ钪袘?yīng)用廣泛，油脂的質(zhì)量與人們的健康息息相關(guān)。但是在生產(chǎn)加工以及使用過(guò)程中油脂會(huì)發(fā)生氧化，產(chǎn)生各種氧化產(chǎn)物，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)油脂的品質(zhì)以及人們的健康產(chǎn)生不良影響[1]。

過(guò)氧化值(POV)是反映油脂新鮮程度和質(zhì)量的重要指標(biāo)[2]。碘量滴定法是目前檢測(cè)油脂過(guò)氧化值最常用的方法[3]。但是，碘化鉀對(duì)氧非常敏感，環(huán)境中的氧會(huì)影響其檢測(cè)結(jié)果[4]。有試驗(yàn)[5]發(fā)現(xiàn)，油脂中的不飽和脂肪酸對(duì)碘有吸收作用，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低。此外，碘量滴定法還存在操作繁瑣，取樣量大，試劑使用量大，反應(yīng)終點(diǎn)不易判斷，檢測(cè)結(jié)果容易受到操作者主觀影響等問(wèn)題[6-7]，這些因素都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前也有一些其他方法用于檢測(cè)油脂的過(guò)氧化值。如：化學(xué)發(fā)光(CL)法，該方法雖然可以檢測(cè)到較低濃度的脂質(zhì)氫過(guò)氧化物，但是化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度卻容易受油脂的種類(lèi)和濃度的影響[8-10]；傅里葉紅外光譜法，利用三苯基磷與氫過(guò)氧化物的反應(yīng)可以定量檢測(cè)各種食用油的過(guò)氧化值，但是反應(yīng)產(chǎn)物與三苯基膦的光譜存在交叉干擾的潛在風(fēng)險(xiǎn)[11-14]；2-硫代巴比妥酸(TBA)法，因其簡(jiǎn)單和可重復(fù)性高且成本低而被廣泛應(yīng)用于油脂、未加工的肉類(lèi)和魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品等食品基質(zhì)中[15]，但樣品需要經(jīng)過(guò)高溫和酸處理，可能存在人為的過(guò)氧化反應(yīng)，影響最終的檢測(cè)結(jié)果[16-17]；亞鐵離子氧化法[18-19]，具有簡(jiǎn)單快速、試劑使用量小、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，但是其吸收系數(shù)會(huì)受到多種因素的影響，同時(shí)線性范圍窄，再現(xiàn)性低等問(wèn)題也限制該方法的應(yīng)用[20]。

二茂鐵是一種過(guò)渡金屬氧化物，由兩個(gè)環(huán)戊二烯和一個(gè)鐵原子組成[21-22]，具有可逆的氧化還原特性，常被用作還原劑或者催化劑。較其他檢測(cè)方法中使用的試劑，二茂鐵具有更好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性[23-24]。Chen等[25]報(bào)道了二茂鐵衍生聚合物探針在電化學(xué)生物傳感中的應(yīng)用，該研究證明，基于二茂鐵聚合物的納米傳感器應(yīng)檢測(cè)過(guò)氧化氫是可行的。Murgandani等[26]報(bào)告了一種靈敏、快速且具有選擇性的安培法測(cè)量亞油酸和亞麻酸及其氫過(guò)氧化物，該方法主要通過(guò)氫過(guò)氧化物氧化二茂鐵而形成陰極電流，通過(guò)對(duì)電流的測(cè)定評(píng)價(jià)樣品的氧化程度，且試驗(yàn)結(jié)果不受還原劑和其他過(guò)氧化物的干擾。前人的研究證實(shí)了二茂鐵與氫過(guò)氧化物可發(fā)生計(jì)量反應(yīng)的可行性。但是直接應(yīng)用二茂鐵來(lái)檢測(cè)油脂的過(guò)氧化值還未見(jiàn)報(bào)道。

試驗(yàn)擬以二茂鐵作為反應(yīng)試劑，利用二茂鐵與油脂中的過(guò)氧化物發(fā)生的反應(yīng)，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立過(guò)氧化物與二茂鐵反應(yīng)的線性關(guān)系，以期開(kāi)發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、方便的油脂過(guò)氧化值的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生油：市售；

異丙醇、甲酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

過(guò)氧化氫異丙苯標(biāo)準(zhǔn)品(CHP)：純度80%，上海麥克林生化科技有限公司；

二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)品：純度98%，上海麥克林生化科技有限公司；

紫外—可見(jiàn)光分光光度計(jì)：Evolution 300型，賽默飛世爾科技公司；

恒溫水浴鍋：HH-S型，江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)液及油樣制備

(1)二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.54 g二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)品置于燒杯中，加入適量異丙醇溶解后倒入100 mL容量瓶中，用異丙醇定容，即得濃度為29 mmol/L的二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮封后放置在4 ℃下備用。

(2)過(guò)氧化氫異丙苯溶液：準(zhǔn)確稱取0.6 g過(guò)氧化氫異丙苯標(biāo)準(zhǔn)品(純度80%)置于10 mL棕色容量瓶中，異丙醇定容，配置成濃度為315.4 mmol/L的過(guò)氧化氫異丙苯母液，然后逐級(jí)稀釋為3.15～44.15 mmol/L的過(guò)氧化氫異丙苯溶液，氮封后放置在4 ℃下備用。

(3)油樣的制備：準(zhǔn)確稱取0.4 g食用油置于10 mL容量瓶中，用異丙醇定容，氮封后放置在4 ℃下備用。

1.2.2 最佳吸收波長(zhǎng)的確定 分別取15.77，7.89 mmol/L的過(guò)氧化氫異丙苯溶液各1 mL于2支干凈的試管中，各加入1 mL二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1 mL甲酸后用異丙醇定容至5 mL(相當(dāng)于過(guò)氧化氫異丙苯的濃度為3.15，1.58 mmol/L)。在恒溫水浴鍋中60 ℃下反應(yīng)40 min，反應(yīng)結(jié)束后立即用流動(dòng)的水冷卻至室溫，使用紫外分光光度計(jì)在200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，異丙醇作為空白校準(zhǔn)基線，通過(guò)對(duì)比樣品吸光度之間的關(guān)系，按式(1)計(jì)算離散系數(shù)，確定最佳吸收波長(zhǎng)。

(1)

式中：

Vs——離散系數(shù)；

σ——吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)差；

μ——吸光度值的平均值。

1.2.3 反應(yīng)摩爾比的確定 取0.1 mL二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL不同濃度(3.15～44.15 mmol/L)的過(guò)氧化氫異丙苯溶液于不同的試管中，加入0.1 mL甲酸后用異丙醇定容至5 mL。在60 ℃的恒溫水浴條件下加熱40 min，結(jié)束后立即用流動(dòng)水冷卻至室溫，使用異丙醇校準(zhǔn)基線在310 nm處檢測(cè)吸光度值，通過(guò)二茂鐵與過(guò)氧化氫異丙苯在不同摩爾比時(shí)的吸光度確定二者反應(yīng)的飽和摩爾比。

1.2.4 酸催化劑的選擇 試管中加入1 mL二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液后，加入1 mL 濃度為15.77 mmol/L的過(guò)氧化氫異丙苯溶液，然后分別加入0.1 mL有機(jī)酸(甲酸，乙酸)和無(wú)機(jī)酸(硫酸)，異丙醇定容至5 mL。60 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)40 min，反應(yīng)完成后在200～600 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.2.5 溫度和時(shí)間的影響 選擇30，40，50，60，70 ℃ 5組不同的溫度。每個(gè)樣品中分別加入1 mL二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL濃度為15.77 mmol/L的過(guò)氧化氫異丙苯溶液，加入0.1 mL甲酸后用異丙醇定容至5 mL，在不同的反應(yīng)溫度下加熱40 min，反應(yīng)后冷卻至室溫在310 nm處進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置10，20，30，40，50 min反應(yīng)時(shí)間，同樣的反應(yīng)條件下在310 nm處檢測(cè)吸光度變化。

1.2.6 過(guò)氧化氫異丙苯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取0.1，0.2，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1.0 mL濃度為15.77 mmol/L的過(guò)氧化氫異丙苯溶液于試管中，加入1 mL二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1 mL甲酸，異丙醇定容至5 mL，在最佳檢測(cè)條件下以過(guò)氧化氫異丙苯的濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度值(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按式(2)計(jì)算油脂過(guò)氧化值。

(2)

式中：

PV——過(guò)氧化值，mmol/kg；

Y——樣品的吸光度；

B——空白的吸光度；

A——標(biāo)準(zhǔn)曲線的系數(shù)；

M——取樣量，g；

V——定容體積，mL。

1.2.7 檢出限和定量限 參照文獻(xiàn)[27]的方法確定二茂鐵法的檢出限。在玻璃管中分別加入0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL的1.58 mmol/L的過(guò)氧化氫異丙苯溶液，再加入1 mL二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1 mL 的甲酸，用異丙醇定容至5 mL(相當(dāng)于樣品中過(guò)氧化氫異丙苯濃度為0.00，0.03，0.06，0.10，0.13，0.16，0.19，0.22，0.25，0.28，0.32 mmol/L)。在恒溫水浴鍋中60 ℃加熱40 min，加熱結(jié)束后立即用流動(dòng)水冷卻至室溫，在310 nm處檢測(cè)其吸光度。得到檢出限的估計(jì)值后按照加標(biāo)濃度為估計(jì)檢出限的1～5倍范圍確定過(guò)氧化氫異丙苯添加量，在干凈的試管中加入合適的過(guò)氧化氫異丙苯溶液(15.77 mmol/L)，再加入1 mL二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1 mL 的甲酸，用異丙醇定容至5 mL，在60 ℃下加熱40 min，加熱結(jié)束后立即用流動(dòng)水冷卻至室溫，在310 nm處檢測(cè)吸光度值，共檢測(cè)7組平行。根據(jù)式(3)求得方法檢出限，以方法檢出限的3.3倍為定量限。

LD=st(n-1,1-α)，

(3)

式中：

LD——方法檢出限，mmol/L；

s——加標(biāo)樣品測(cè)試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

t——自由度為n-1時(shí)的Student's值，可查值表得到，當(dāng)n=7時(shí)，在99%置信區(qū)間(α=0.01)下，t=3.14；

n——加標(biāo)樣品數(shù)量，一般取7。

1.2.8 回收率 在試管中分別加入1 mL空白油樣、低加標(biāo)油樣(3.15 mmol/L過(guò)氧化氫異丙苯)、中加標(biāo)油樣(7.89 mmol/L 過(guò)氧化氫異丙苯)、高加標(biāo)油樣(12.62 mmol/L過(guò)氧化氫異丙苯)，再加入1 mL二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1 mL的甲酸，用異丙醇定容至5 mL，在60 ℃條件下加熱40 min，然后在310 nm下檢測(cè)樣品的吸光度值。

1.2.9 滴定法測(cè)定過(guò)氧化值 按GB 5009.227—2016執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳吸收波長(zhǎng)的確定

為了選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，考察過(guò)氧化氫異丙苯濃度為1.58，3.15 mmol/L時(shí)與二茂鐵反應(yīng)的全波長(zhǎng)(200～600 nm)掃描圖，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在300～400 nm的范圍內(nèi)隨著過(guò)氧化氫異丙苯濃度的增加樣品吸光度值變大，雖然最大吸收波長(zhǎng)在318 nm處，但是通過(guò)對(duì)比吸光度值離散系數(shù)(表1)可知，在310 nm處吸光度值的離散系數(shù)最大，即在310 nm處的空白樣品的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光度的差值最大，檢測(cè)最為靈敏。所以選擇310 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化

表1 不同波長(zhǎng)下吸光度值離散系數(shù)

2.2 反應(yīng)摩爾比的確定

由圖2可知，二茂鐵與過(guò)氧化氫異丙苯反應(yīng)的飽和摩爾比(n二茂鐵∶n過(guò)氧化氫異丙苯)為1∶4，說(shuō)明二茂鐵結(jié)構(gòu)中2個(gè)環(huán)戊二烯可以與4個(gè)過(guò)氧化物結(jié)合或者每個(gè)環(huán)戊二烯與一個(gè)過(guò)氧化物結(jié)合，其余兩個(gè)過(guò)氧化物與鐵形成絡(luò)合物。為了保證在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)二茂鐵過(guò)量且吸光度值處于檢測(cè)器的最佳檢測(cè)范圍，選擇二茂鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為29 mmol/L，過(guò)氧化氫異丙苯標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為15.77 mmol/L。

圖2 過(guò)氧化氫異丙苯與二茂鐵反應(yīng)摩爾比

2.3 酸性催化劑的優(yōu)化

二茂鐵在酸性條件下與氫過(guò)氧化物反應(yīng)，選擇硫酸、甲酸、乙酸，分別加入二茂鐵溶液以及二茂鐵與過(guò)氧化氫異丙苯的混合溶液中，并進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)由甲酸提供的氫離子濃度可使催化反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，保證二茂鐵不分解，硫酸(強(qiáng)酸)使二茂鐵分解而乙酸存在下沒(méi)有顯示反應(yīng)性，故選擇甲酸作為催化劑。

如圖3所示，隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的增大，二茂鐵與過(guò)氧化氫異丙苯反應(yīng)產(chǎn)物在310 nm范圍內(nèi)的吸光度值不斷升高，表明酸性催化劑體積分?jǐn)?shù)的升高有助于反應(yīng)的進(jìn)行。但是，過(guò)低的酸性條件可能會(huì)破壞二茂鐵與過(guò)氧化氫異丙苯反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)[28]。因此，最終選擇體積分?jǐn)?shù)為2%的甲酸，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也表明在該酸性催化劑條件下，過(guò)氧化氫異丙苯不會(huì)發(fā)生分解。

圖3 甲酸濃度對(duì)吸光度的影響

2.4 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

由圖4可知，二茂鐵與過(guò)氧化氫異丙苯的反應(yīng)隨溫度的提高形成反應(yīng)產(chǎn)物的含量不斷增加，當(dāng)60 ℃后反應(yīng)基本達(dá)到了平衡，溫度再升高其生成物含量變化微弱?？紤]到氫過(guò)氧化物容易受到高溫的影響而發(fā)生變化，所以選擇60 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)樣品吸光度的影響

2.5 反應(yīng)時(shí)間的影響

由圖5可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)反應(yīng)產(chǎn)物含量增加，當(dāng)在60 ℃加熱40 min時(shí)，二茂鐵與過(guò)氧化氫異丙苯的反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)，即使增加反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)物含量恒定。故選擇40 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間。通過(guò)滴定驗(yàn)證過(guò)氧化氫異丙苯濃度的方法檢驗(yàn)過(guò)氧化氫異丙苯在60 ℃ 加熱40 min后的穩(wěn)定性，結(jié)果表明在該條件下過(guò)氧化氫異丙苯不會(huì)發(fā)生變化。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)樣品吸光度的影響

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

在310 nm處，過(guò)氧化氫異丙苯濃度和吸光度值之間的線性回歸方程為y=0.175 2x+0.220 2，R2=0.999 6。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系，可以作為過(guò)氧化物的定量方法用于檢測(cè)。濃度為0.00，0.03，0.06，0.10，0.13，0.16，0.19，0.22，0.25，0.28，0.32 mmol/L的過(guò)氧化氫異丙苯溶液與二茂鐵反應(yīng)后在310 nm處的吸光度曲線結(jié)果如圖6所示。曲線在0.126 mmol/L處出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)，在0.126～0.630 mmol/L的范圍內(nèi)選擇空白樣品加標(biāo)濃度為0.473 mmol/L，平行檢測(cè)7個(gè)樣品。7個(gè)平行樣品吸光度值的檢測(cè)結(jié)果為0.376±0.003，根據(jù)式(3)得到二茂鐵法的檢出限為0.08 mmol/L，定量限為0.26 mmol/L。

圖6 過(guò)氧化氫異丙苯在低濃度處的折點(diǎn)

2.7 添加回收率

稱取0.20 g花生油，添加0.1 mL濃度為3.15，7.89，12.62 mmol/L的過(guò)氧化氫異丙苯溶液配置成低、中、高加標(biāo)油樣，轉(zhuǎn)換成過(guò)氧化物值分別為15.44，39.74，63.10 mmol/kg，稱取油樣時(shí)，每次稱取都有些差異導(dǎo)致過(guò)氧化物含量發(fā)生波動(dòng)，計(jì)算結(jié)果如表2所示。

表2 二茂鐵法的添加回收率

計(jì)算結(jié)果表明，二茂鐵方法的加標(biāo)回收率在98.16%～100.03%，二茂鐵檢測(cè)方法與過(guò)氧化物含量檢測(cè)結(jié)果具有很好的對(duì)應(yīng)性，完全符合作為檢測(cè)方法對(duì)過(guò)氧化物的檢測(cè)，說(shuō)明該方法能有效檢測(cè)油脂中的氫過(guò)氧化物含量。

2.8 兩種方法對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)比較

取4組新鮮的花生油置于燒杯中，分別在120 ℃下加熱0，1，3，5 h，加熱后的樣品分別使用二茂鐵法和滴定法進(jìn)行檢測(cè)。

以二茂鐵法測(cè)得過(guò)氧化值(mmol/kg)為橫坐標(biāo)(x)，以滴定法測(cè)得過(guò)氧化值(mmol/kg)為縱坐標(biāo)(y)，建立線性回歸方程。兩者的線性回歸方程為y=0.883 4x-3.590 3，R2=0.996 7，說(shuō)明兩種方法對(duì)實(shí)際油樣的檢測(cè)結(jié)果具有良好的線性關(guān)系，但是也觀察到其斜率不為1，由于油脂體系較為復(fù)雜，二茂鐵可能會(huì)與油脂中的其他成分發(fā)生反應(yīng)(含氧自由基、過(guò)氧自由基等)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果增大，這一現(xiàn)象需要通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)去解釋，同時(shí)也觀察到回歸方程與y軸不交于零點(diǎn)處，這可能是由于二茂鐵法中油脂完全處于有機(jī)試劑中，其氧化產(chǎn)物更容易被完全反應(yīng)，所以其過(guò)氧化值較大。

圖7 植物油樣品兩種方法檢測(cè)結(jié)果的比較

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)油脂中的過(guò)氧化物與二茂鐵進(jìn)行反應(yīng)具有對(duì)應(yīng)關(guān)系；將二茂鐵方法與國(guó)標(biāo)滴定法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法具有良好的線性關(guān)系，且二茂鐵法具有試劑性質(zhì)穩(wěn)定不受空氣和光照影響，取樣量少，試劑使用量少，操作過(guò)程簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。