向麗萍 范斌強(qiáng) 楊志龍 伍 強(qiáng) 余有貴

(1.邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000；2.生態(tài)釀酒技術(shù)與應(yīng)用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽(yáng) 422000；3.湖南湘窖酒業(yè)有限公司，湖南 邵陽(yáng) 422000)

固態(tài)發(fā)酵中真菌種群主要來(lái)源于大曲[1]，大曲中的微生物主要來(lái)自原料、器具、空氣、水等[2]，其微生物種類、數(shù)量以及群落結(jié)構(gòu)對(duì)大曲品質(zhì)有直接影響[3]。根據(jù)群落結(jié)構(gòu)和功能不同，可以將大曲中的微生物分為霉菌、酵母菌、細(xì)菌等[4]。大曲中酵母優(yōu)勢(shì)菌群主要為釀酒酵母和東方伊薩酵母[5]，酵母是白酒釀造過(guò)程中主要的功能菌[6]；產(chǎn)酯酵母又叫生香酵母，能促進(jìn)酯類的生成，形成白酒的特征風(fēng)味物質(zhì)[7]。朱文優(yōu)[8]通過(guò)比較夏秋兩季高溫大曲中的真菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前期Pichia、Saccharomycopsis和Wickerhamomyces是夏秋兩季大曲中的主要真菌；Pichia是秋季大曲整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中的主要真菌類群，Thermoascus是夏季大曲發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)真菌類群。劉建學(xué)等[9]從濃香型白酒酒醅中篩選出兩株高產(chǎn)酯的戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。伍強(qiáng)等[10]從野生獼猴桃中篩選鑒定出一株適于獼猴桃果酒發(fā)酵的釀酒酵母，制成的果酒產(chǎn)品具有良好的ACE抑制活性。董琪等[11]從濃香型大曲中分離得到一株可耐受42 ℃高溫且具有一定發(fā)酵產(chǎn)酒能力的酵母菌，該菌株經(jīng)鑒定為Zygosaccharomycescidri。陽(yáng)秀蓮等[12]從不同楊梅鮮果及果園環(huán)境中篩選得出一株發(fā)酵性能好耐受性強(qiáng)的釀酒酵母RY1。劉延波等[13]從中高溫大曲中分離得到一株名為Pichiakudriavzevii的酵母菌且具有很好的耐高溫耐乙醇性能。應(yīng)靜等[14]用5種不同的商業(yè)酵母菌發(fā)酵甘蔗酒，確定出兩株酵母菌更適宜用于甘蔗酒釀造。

濃香型白酒回糟酸度高，導(dǎo)致酵母菌產(chǎn)酒率低，丟糟殘余淀粉含量高，影響企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益及生態(tài)效益。目前，對(duì)大曲中酵母菌研究大多集中在分離篩選、鑒定[15-16]等方面，也有對(duì)其耐高溫、耐乙醇、耐酸等特性進(jìn)行研究的[17-18]。將耐高溫、耐酸性等耐受性較好的酵母菌應(yīng)用于濃香型白酒生產(chǎn)中，對(duì)解決濃香型白酒中回糟酸度高、殘余淀粉含量高的現(xiàn)狀具有重要意義。研究擬以中高溫大曲為研究對(duì)象，通過(guò)平板劃線純化、WL培養(yǎng)基形態(tài)觀察及顯微鏡觀察對(duì)中高溫大曲中酵母菌進(jìn)行初步鑒定，再通過(guò)TTC培養(yǎng)基染色篩選、差異酸度培養(yǎng)基篩選適用于回糟發(fā)酵耐酸性產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定、生物學(xué)特性及回糟發(fā)酵小試研究，為進(jìn)一步提高濃香型白酒回糟發(fā)酵出酒率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中高溫大曲：4個(gè)月成品曲，湖南省湘窖酒業(yè)有限公司；

黃水：湖南省湘窖酒業(yè)有限公司；

蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、瓊脂等培養(yǎng)基配制試劑：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

美蘭染液：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；

香柏油：上海生物制品研究所有限責(zé)任公司；

TTC：化學(xué)純，博立生物制品有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：采用YEPD培養(yǎng)基，115 ℃滅菌20 min；

形態(tài)鑒定培養(yǎng)基：采用WL培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min；

高粱汁培養(yǎng)基：500 g高粱粉與4倍體積蒸餾水充分混合，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%液化酶攪拌均勻，80 ℃水浴酶解2 h，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的糖化酶攪拌均勻，60 ℃水浴酶解4 h，離心過(guò)濾，加水稀釋至糖度為10～12 °Bx；

TTC培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，瓊脂7.5 g，水500 mL，121 ℃滅菌20 min，無(wú)菌環(huán)境加入0.25 g TTC。

1.3 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋：G154-DWS型，致微(廈門(mén))儀器有限公司；

便攜式pH計(jì)：LE438型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-3802型，重慶萬(wàn)達(dá)儀器有限公司；

電子式液體密度計(jì)：BHOM-SJ04型，石家莊市百亨通用儀器儀表制造有限公司；

電子顯微鏡：AE2000+MoticamS3型，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；

單人單面垂直凈化工作臺(tái)：SW-CJ-1FD型，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：H21-6型，北京市東霞電子儀表廠；

萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW-400A型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：SCIENTZ-18N型，北京科偉永興儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 中高溫大曲中酵母菌的分離純化與初篩 無(wú)菌條件下稱取25.0 g成品曲樣品至裝有225 mL無(wú)菌水的錐形瓶?jī)?nèi)，充分搖勻，同時(shí)制備10-2，10-3，10-4，10-5，10-6倍的稀釋樣品勻液，吸取0.1 mL稀釋液涂布至YEPD富集培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑選符合酵母形態(tài)的單菌落菌株進(jìn)行平板劃線3次，獲得純種菌株。采用TTC培養(yǎng)基篩選，菌株顏色越深其產(chǎn)酒精能力越好，通過(guò)觀察菌落顏色篩選產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)的純化菌株。將純化菌株接種于WL培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)，通過(guò)顯微鏡觀察確定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行初步分類。將純化的菌株轉(zhuǎn)移到Y(jié)EPD斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌株菌落生成后，置于4 ℃冰箱保藏。

1.4.2 耐酸性酵母菌的復(fù)篩 將純化菌株接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，調(diào)整種子活化液濃度為1.0×107CFU/mL，采用富含有機(jī)酸的黃水調(diào)節(jié)YEPD液體培養(yǎng)基的pH，設(shè)置差異酸度梯度為pH 2.5，3.0，3.5，4.0，4.5。以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將活化液接種至差異酸度YEPD培養(yǎng)基中，同時(shí)空白對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定560 nm下菌液的OD值，OD值越大，酵母菌的生長(zhǎng)活性越強(qiáng)，酵母菌的耐酸性越強(qiáng)。

將純化菌株接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，調(diào)整種子活化液濃度為1.0×107CFU/mL，采用富含有機(jī)酸的黃水調(diào)節(jié)高粱汁培養(yǎng)基的pH，設(shè)置差異酸度梯度為pH 2.5，3.0，3.5，4.0，模擬真實(shí)白酒發(fā)酵酸性環(huán)境。以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將活化液接種至差異酸度高粱汁培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫發(fā)酵9 d，蒸餾后檢測(cè)酒精度，每組進(jìn)行3次重復(fù)。選取酸性環(huán)境下產(chǎn)酒精能力較高的酵母菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.4.3 酵母菌分子生物學(xué)鑒定 將篩選得到的酵母菌送至北京六合華大基因有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為：Super Mix 15 μL，Primer F(10p)1 μL，Primer R(10p)1 μL，模板(ng/μL)1 μL，ddH2O 12 μL。PCR擴(kuò)增條件：96 ℃、10 min；96 ℃、20 s，56 ℃、20 s，72 ℃、30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)，純化后測(cè)序。并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列比對(duì)，采用MEGA.7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4.4 耐酸性酵母菌的生物學(xué)特性研究

(1)耐酸性：配制pH 2.5，3.0，3.5，4.0，4.5的高粱汁培養(yǎng)基，滅菌后待用。無(wú)菌條件下，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將篩得的酵母菌種子液加入盛有100 mL差異酸度高粱汁培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，測(cè)定OD560 nm值，每組平行3次。

(2)耐高溫性：無(wú)菌條件下，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量分別將篩得酵母菌種子液加入含有100 mL的高粱汁培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別置于36，40，44，48，52 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，測(cè)定OD560 nm值，每組平行3次。

(3)耐酒精能力：無(wú)菌條件下，分別配制100 mL酒精度為2%vol，4%vol，6%vol，8%vol，10%vol的高粱汁培養(yǎng)基，再接種體積分?jǐn)?shù)2%的篩得酵母菌種子液，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)2～3 d。測(cè)定OD560 nm值，每組平行3次。

(4)生長(zhǎng)曲線：無(wú)菌條件下，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將篩得酵母菌種子液加入含有250 mL的YEPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h用無(wú)菌移液槍吸取1.00 mL培養(yǎng)液，稀釋5倍后，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD560 nm值，以不接種的YEPD培養(yǎng)基為對(duì)照組，重復(fù)3次，繪制并對(duì)比分析酵母菌的生長(zhǎng)曲線。

1.4.5 耐酸性酵母菌發(fā)酵小試研究 擴(kuò)大培養(yǎng)篩得酵母菌，調(diào)整種子活化液中酵母菌濃度處于1×107CFU/mL。參照張海英[19]的方法，以湘窖濃香型白酒回糟為原料，以4.5%的回糟曲添加量、0.2%糖化酶添加量、0.5%酵母菌液添加量進(jìn)行混合，同時(shí)以不添加酵母菌菌液為空白組，以商用安琪酵母菌液為對(duì)照組，每組平行3次，分裝至玻璃瓶中，封口后置于濃香型白酒泥窖窖池上層醅中，模擬真實(shí)回糟發(fā)酵環(huán)境，冬季發(fā)酵1個(gè)月。按照DB34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》檢測(cè)糟醅殘余淀粉含量、還原糖含量及酒精度。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin和Word軟件進(jìn)行圖表繪制，通過(guò)SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，利用MEGA 7.0軟件對(duì)酵母菌測(cè)序序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 中高溫大曲中酵母菌的分離純化與初篩

從YEPD富集培養(yǎng)基上挑取25株菌種作進(jìn)一步分離純化，分別編號(hào)為dq1～dq25，根據(jù)酵母菌的生長(zhǎng)情況挑選出3株活性較強(qiáng)的酵母菌dq1、dq4和dq9，其中3株酵母菌在TTC培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基、WL培養(yǎng)基的菌落形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。菌株dq1在TTC培養(yǎng)基上顯色較深于菌株dq4和dq9，其發(fā)酵能力較優(yōu)于其他兩株菌。3株菌株菌落皆呈乳白色，表面光滑濕潤(rùn)，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，符合《真菌手冊(cè)》中酵母菌的菌落與細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

從左至右依次為T(mén)TC培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基、WL培養(yǎng)基、細(xì)胞形態(tài)，從上至下依次為菌株dq1，dq4和dq9

2.2 中高溫大曲中酵母菌的復(fù)篩

由圖2可知，當(dāng)pH>2.5時(shí)，不同菌種生長(zhǎng)活性存在顯著性差異(P<0.05)。由于不同酵母菌對(duì)酸性條件適應(yīng)能力不同，酵母菌因生長(zhǎng)環(huán)境酸度不同其生長(zhǎng)活性也不同。當(dāng)pH為2.5時(shí)，不同菌株的生長(zhǎng)活性不存在顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)pH為3.0時(shí)，3株酵母菌的OD560 nm值強(qiáng)于pH為2.5的，由于OD值越大，其生長(zhǎng)活性越強(qiáng)，因此當(dāng)pH為3.0時(shí)，3株酵母菌的生長(zhǎng)活性強(qiáng)于pH為2.5的。當(dāng)pH為3.0時(shí)，菌株dq1和dq4的生長(zhǎng)活性顯著高于菌株dq9；當(dāng)pH為3.5時(shí)，菌株dq1的生長(zhǎng)活性顯著強(qiáng)于其他兩株菌，說(shuō)明菌株dq1的耐酸性最強(qiáng)，因此確定以菌株dq1和dq4進(jìn)行產(chǎn)酒精能力篩選。

字母不同表示同一pH下不同菌株生長(zhǎng)活性差異顯著(P<0.05)

對(duì)菌株dq1和dq4進(jìn)行差異酸度高粱汁培養(yǎng)基篩選，其在不同pH下的高粱汁差異酸度培養(yǎng)基中的產(chǎn)酒精能力見(jiàn)圖3。由圖3可知，在pH 2.5和pH 4.0條件下，兩株菌株的產(chǎn)酒精能力無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在pH 3.0時(shí)，菌株dq1的產(chǎn)酒精能力顯著大于菌株dq4的(P<0.05)；而pH 3.5時(shí)，菌株dq4的產(chǎn)酒精能力顯著強(qiáng)于菌株dq1的(P<0.05)。

字母不同表示同一pH下不同菌株產(chǎn)酒精能力差異顯著(P<0.05)

結(jié)合差異酸度YEPD培養(yǎng)基中酵母菌生長(zhǎng)活性篩選和差異酸度高粱汁發(fā)酵產(chǎn)酒精能力的篩選，確定酵母菌dq1為耐酸性較強(qiáng)、產(chǎn)酒精能力較優(yōu)的酵母菌，因此將酵母菌dq1進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.3 耐酸性酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，菌株dq1擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度約為750 bp，將所得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn)菌株dq1與Saccharomycescerevisiae(MT322849.1)序列相似性達(dá)100%；與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)聚于一支，鑒定所篩選的菌株dq1為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。釀酒酵母是白酒發(fā)酵中至關(guān)重要的微生物，在發(fā)酵等行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 耐酸性釀酒酵母的生物學(xué)特性分析

由圖5可知，菌株dq1在不同pH、溫度、酒精濃度下的生長(zhǎng)活性存在顯著性差異(P<0.05)。菌株dq1在pH 3.0時(shí)的生長(zhǎng)活性顯著大于pH 2.5時(shí)的，故菌株dq1能耐受pH 3.0的酸性，較葛隱等[20]研究中的耐酸性酵母菌的耐酸能力(pH 3.5)強(qiáng)，與李彥芹等[21]從酒醅中分離篩選得到酵母菌耐酸性一致；菌株dq1在48 ℃下的生長(zhǎng)活性顯著大于52 ℃下的，因此菌株dq1能耐高溫48 ℃，優(yōu)于劉延波等[13]研究中耐高溫45 ℃酵母菌；菌株dq1在6%vol酒精度環(huán)境中的生長(zhǎng)活性顯著大于8%vol時(shí)的，因此菌株dq1能耐酒精度6%vol，弱于伍強(qiáng)等[22]從野生獼猴桃中篩選出的釀酒酵母的耐酒精度12%vol；菌株dq1在2～8 h時(shí)處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，適應(yīng)環(huán)境后迅速生長(zhǎng)繁殖，14 h后處于穩(wěn)定期。

圖5 釀酒酵母dq1的生物學(xué)特性

2.5 耐酸性釀酒酵母的發(fā)酵小試分析

以濃香型白酒回糟糟醅為發(fā)酵原料，對(duì)發(fā)酵前后糟醅的淀粉及還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測(cè)分析，同時(shí)對(duì)空白組、試驗(yàn)組及對(duì)照組的糟醅進(jìn)行蒸餾測(cè)其酒精度，相關(guān)結(jié)果如表1所示。

表1 優(yōu)良酵母菌發(fā)酵糟醅的理化指標(biāo)?

由表1可知，小試發(fā)酵后糟醅中的淀粉及還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低(P<0.05)，主要是依靠回糟曲中霉菌的糖化作用和回糟曲中酵母菌及試驗(yàn)組添加的耐酸性釀酒酵母dq1的發(fā)酵作用。同時(shí)，釀酒酵母dq1試驗(yàn)組的糟醅中淀粉和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于空白組及安琪酵母對(duì)照組的(P<0.05)，而釀酒酵母dq1試驗(yàn)組的糟醅中酒精含量顯著高于空白組及安琪酵母對(duì)照組的(P<0.05)，其中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較空白組降低了1.0%，殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)較空白組降低了1.3%，主要是因?yàn)榛卦鉷H在3.0左右，而釀酒酵母dq1能耐酸性為pH 3.0，且在較低pH環(huán)境中能一定程度上進(jìn)行發(fā)酵。綜上，酵母菌dq1在回糟發(fā)酵中能夠加強(qiáng)殘?zhí)抢寐?，有效提高糟醅中酒精含量，從而提高回糟出酒率?/p>

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)湖南省湘窖酒業(yè)有限公司中高溫大曲中酵母菌進(jìn)行分離篩選及分子生物學(xué)鑒定，獲得一株優(yōu)良酵母菌dq1，經(jīng)鑒定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；特性研究結(jié)果表明，釀酒酵母dq1可耐受pH 3.0、48 ℃，其pH和高溫耐受性具有明顯優(yōu)勢(shì)；回糟發(fā)酵小試研究中，釀酒酵母dq1的添加提高了回糟中14.9%的殘?zhí)抢寐?，可作為濃香型白酒回糟發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)酵母菌。研究?jī)H為小試，后續(xù)可將優(yōu)良酵母菌制備強(qiáng)化大曲用于中試試驗(yàn)，進(jìn)一步探究其對(duì)濃香型白酒回糟發(fā)酵的影響。