王紫潔,馬靈珍
小兒康顆粒由太子參、山楂、白芍、白術(shù)、茯苓等12味中藥材按照“君、臣、佐、使”中醫(yī)藥理論配伍而成,主要用于食滯蟲痢、煩躁不安、精神疲倦、脘腹脹滿、面色萎黃等病癥的治療[1]?,F(xiàn)代藥理和臨床研究表明,小兒康顆??捎行Ц纳乒δ苄愿雇碵2]、再發(fā)性腹痛[3]的臨床癥狀,對小兒腹瀉[4]、小兒功能性便秘[5]治療效果顯著,同時還具有增強小兒厭食癥患者食欲[6]、降低高血鉛和輕度鉛中毒患兒的血鉛水平[7]等作用。小兒康顆粒現(xiàn)收載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第六冊[1],質(zhì)量標準中尚未對其所含成分進行定量控制,文獻報道[8]中也僅對其佐藥白芍所含的芍藥苷進行了定量研究。中藥及其制劑所含成分繁多且復雜,具有多靶點、多組分協(xié)同增效、多點微調(diào)等特點,為全面評價中成藥復方制劑整體質(zhì)量,多指標成分質(zhì)量控制模式近年來已廣泛應用于其質(zhì)量控制中。本實驗根據(jù)中醫(yī)配伍理論,結(jié)合中藥質(zhì)量標志物確定原則,采用HPLC梯度洗脫法對小兒康顆粒中君藥太子參的主要活性成分太子參環(huán)肽B,臣藥山楂的代表性成分牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷和金絲桃苷,佐藥白芍的代表性成分氧化芍藥苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷含量進行同時測定,采用化學計量學分析方法對不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的小兒康顆粒目標成分含量進行聚類分析和主成分分析,為全面評價小兒康顆粒整體質(zhì)量、提高其質(zhì)量控制標準提供數(shù)據(jù)支持。
1.1 儀器 Waters2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司);AE240型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司);KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2 試藥 芍藥苷對照品(批號:110736-201943,含量95.1%,CAS號23180-57-6)、金絲桃苷對照品(批號:111521-201809,含量94.9%,CAS號482-36-0)和牡荊素葡萄糖苷對照品(批號:111979-201501,含量92.8%,CAS號178468-00-3)均來源于中國食品藥品檢定研究院;牡荊素鼠李糖苷對照品(批號:16042941,含量98.1%,CAS號64820-99-1)、氧化芍藥苷對照品(批號:18031641,含量98.8%,CAS號:39011-91-1)、苯甲酰芍藥苷對照品(批號:18031622,含量99.3%,CAS號38642-49-8)和太子參環(huán)肽B對照品(批號:18031328,含量99.9%,CAS號145459-19-4)均來源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司;乙腈為色譜純,其他試劑為分析純。小兒康顆粒(規(guī)格:每袋裝10 g;批號:190303、190305、190801,編號依次為S1~S3,來源于海南葫蘆娃藥業(yè)集團股份有限公司,簡稱企業(yè)1;批號:7381902、7382201、7382401、7382801、8381802、8382203、8382501,編號依次為S4~S10,來源于廣州諾金制藥有限公司,簡稱企業(yè)2;批號:1902002、200101,編號依次為S11~S12,來源于江西佑美制藥有限公司,簡稱企業(yè)3)。
2.1 溶液的制備
2.1.1 混合對照品儲備液 精密稱取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B對照品適量,用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.436、3.178、0.544、0.278、2.536、0.192、0.158 mg/ml的混合對照品儲備液。
2.1.2 混合對照品溶液 精密吸取混合對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和2.5 ml,分別置于6個20 ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,制成6個系列質(zhì)量濃度線性考察混對溶液Ⅰ~Ⅵ;取混對溶液Ⅳ作為混合對照品溶液(牡荊素葡萄糖苷21.8 μg/ml、牡荊素鼠李糖苷158.9 μg/ml、金絲桃苷27.2 μg/ml、氧化芍藥苷13.9 μg/ml、芍藥苷126.8 μg/ml、苯甲酰芍藥苷9.6 μg/ml、太子參環(huán)肽B 7.9 μg/ml)。
2.1.3 供試品溶液和陰性樣品溶液 取小兒康顆粒樣品適量,除去內(nèi)包裝,取內(nèi)容物研成細粉,取約2.0 g,精密稱定,置25 ml量瓶中,精密加入甲醇25 ml,超聲處理45 min,放冷后用甲醇補重,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,制成小兒康顆粒供試品溶液。按小兒康顆粒的處方工藝[1],分別制備缺山楂、缺白芍和缺太子參的陰性樣品,再按上述方法制成陰性樣品溶液。
2.2 色譜條件及專屬性試驗 以Waters SunFire C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)為液相色譜柱,柱溫:30 ℃;流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0~14.0 min,15.0%A;14.0~25.0 min,15.0%A→27.0%A;25.0~41.0 min,27.0%A→39.0%A;41.0~47.0 min,39.0%A→52.0%A;47.0~55.0 min,52.0%A→15.0%A),流速:1.0 ml/min;進樣量:10 μl;檢測波長分別為340 nm (0~25.0 min檢測牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷和金絲桃苷)[9-11],230 nm (25.0~41.0 min檢測氧化芍藥苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷)[12-14]和203 nm (41.0~55.0 min檢測太子參環(huán)肽B)[15-17]。精密吸取混合對照品溶液、小兒康顆粒供試品溶液和各陰性樣品溶液各10 μl,進樣檢測,記錄色譜圖。結(jié)果小兒康顆粒供試品色譜圖中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B色譜峰峰形對稱,分離度均>1.5,理論板數(shù)按各目標化合物色譜峰計均≥3 500,陰性樣品對小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分的測定不干擾,色譜圖見圖1。
圖1 HPLC色譜圖
2.3 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下系列質(zhì)量濃度線性考察混對溶液Ⅰ~Ⅵ各10 μl,依次進樣測定小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標化合物的峰面積,以牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B質(zhì)量濃度(X,μg/ml)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸,得7種成分的回歸方程、線性范圍及r值見表1。
表1 7種化合物的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍
2.4 精密度、重復性、穩(wěn)定性考察
2.4.1 精密度考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液連續(xù)進樣6次,記錄牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積,結(jié)果儀器精密度良好,太子參環(huán)肽B等7種目標成分峰面積的RSD分別為1.05%、0.52%、1.06%、1.09%、0.57%、1.10%和1.22%。
2.4.2 重復性考察 取小兒康顆粒樣品,按“2.1.3”項下方法配制6份小兒康顆粒供試品溶液,依法進樣分析,記錄牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積并計算各目標化合物的含量,結(jié)果方法重復性良好,太子參環(huán)肽B等7種目標成分含量的RSD分別為1.82%、0.86%、1.61%、0.73%、1.08%、1.75%和1.89%。
2.4.3 穩(wěn)定性考察 臨用新配1份小兒康顆粒供試品溶液,于0、2、4、8、18和24 h進樣檢測牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積,結(jié)果小兒康顆粒供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定,太子參環(huán)肽B等7種目標成分峰面積的RSD分別為0.99%、0.56%、1.07%、1.12%、0.60%、1.15%和1.18%。
2.5 加樣回收率試驗 取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B含量均已知的同一批次小兒康顆粒樣品適量,除去內(nèi)包裝取內(nèi)容物研成細粉,取約1.0 g,精密稱定(共稱取9份,3份隨機分為1組),依據(jù)《中國藥典》2015年版四部規(guī)定(對照品加入量約為樣品原有量的50%、100%和150%),分別精密加入混合對照品溶液(另行配制,牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的質(zhì)量濃度分別為0.127、0.863、0.159、0.078、0.715、0.057、0.043 mg/ml)1.0、2.0和3.0 ml,再按“2.1.3”項下方法制成加樣回收樣品溶液,依法進樣測定牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積,并計算其含量,用測得量與樣品原有量之差除以對照品加入量,計算太子參環(huán)肽B等7種目標成分的回收率及RSD值,結(jié)果見表2。
表2 小兒康顆粒中7種成分的加樣回收率試驗結(jié)果
續(xù)表
2.6 樣品含量測定 取12個批次的小兒康顆粒樣品(編號S1~S12),按“2.1.3”項下方法制成供試品溶液(每個批次平行制備3份),依法進樣測定牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積,并計算目標成分的含量,結(jié)果見表3。
表3 樣品含量測定結(jié)果(mg/g)
2.7 聚類分析 為考察不同批次小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分的含量差異,采用SPSS 26.0軟件系統(tǒng)聚類分析法(聚類方法:組間聯(lián)接,測度:歐氏距離)對12個批次小兒康顆粒樣品進行聚類分析,結(jié)果見圖2。由圖2所得結(jié)果可知,當類間距離為15時,12批小兒康顆粒樣品聚為3類,樣品S6、S10、S5、S7、S9、S4和S8聚為一類,樣品S11和S12聚為一類,樣品S1、S3和S2聚為一類。從分類結(jié)果可以看出,同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的小兒康顆粒樣品聚為一類,表明同一生產(chǎn)企業(yè)樣品各成分含量相對穩(wěn)定、均勻,企業(yè)2樣品質(zhì)量較為穩(wěn)定,而不同生產(chǎn)企業(yè)樣品間存在一定差異。
圖2 12批小兒康顆粒聚類分析樹狀圖
2.8 主成分分析 采用SPSS 26.0軟件對12批小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分的含量數(shù)據(jù)進行主成分分析,將表3測得數(shù)值導入分析軟件,得樣品主成分分析碎石圖見圖3,主成分特征值和方差貢獻率結(jié)果見表4。
表4 主成分特征值和方差貢獻率
圖3 主成分分析碎石圖
根據(jù)累積貢獻率>85%的原則,以初始特征值>1為提取標準,前3個主成分分別為3.219、1.461、1.282,初始特征值均>1,對方差貢獻率分別為45.987%、20.869%和18.312%,累積貢獻率為85.168%,大于85%,表明提取前3個主成分即可代表小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分85.168%的信息,可以用于對小兒康顆粒的質(zhì)量評價。
3.1 多指標成分的選擇 小兒康顆粒由太子參、山楂、白芍、白術(shù)、茯苓等12味中藥材組方而來,方中太子參益氣健脾、生津潤肺,白術(shù)健脾益氣、燥濕利水,共為君藥;山楂消食健胃、化濁降脂,茯苓健脾滲濕,葫蘆茶消痰散瘀,麥芽行氣消食、健脾開胃,合為臣藥;白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛,烏梅斂肺生津,蟬蛻斂肺止痛,榧子消積潤肺、潤燥通便,檳榔行氣消積,合為佐藥;陳皮健脾和胃、行氣寬中,引藥達病所,為使藥。諸藥合用,共奏健脾開胃、消食化滯、驅(qū)蟲止痛之功。太子參環(huán)肽B為君藥太子參特征成分;牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷等黃酮類為臣藥山楂主要活性成分;氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等單萜類化合物為佐藥白芍主要藥效成分。本實驗根據(jù)中藥質(zhì)量標志物確認原則選取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B為小兒康顆粒多指標定量測定成分,以期全面評價小兒康顆粒的整體質(zhì)量。
3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化 在確定供試品溶液制備方法時,以小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的綜合提取率為指標,同時結(jié)合雜質(zhì)干擾程度,對比考察了50%甲醇[11]、70%甲醇[9]、甲醇[13,15-17]和50%乙醇[12,14]提取溶劑以及超聲提取[9-11,13-17]、加熱回流[12]提取方式對考察指標的影響,結(jié)果顯示,以甲醇超聲提取時,小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分綜合提取率最佳,雜質(zhì)成分干擾較小,在此基礎上對提取時間進行優(yōu)化,最終確定采用甲醇超聲提取45 min對小兒康顆粒進行供試品溶液的制備。
3.3 流動相的優(yōu)化選擇 在流動相優(yōu)化選擇時,參考相關文獻,依次考察了乙腈-水[15,17]、乙腈-0.1%甲酸溶液[10-11,16]和乙腈-0.1%磷酸溶液[12-14]流動相體系對小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B色譜峰峰形、分離度的影響。結(jié)果顯示,以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫時,色譜圖基線平穩(wěn),太子參環(huán)肽B等7種目標成分色譜峰峰形對稱,與相鄰色譜峰均能有效分離。在此基礎上對流動相中有機相和水相比例進行優(yōu)化,最終確定采用“2.2”項色譜條件下的流動相梯度洗脫程序?qū)π嚎殿w粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B含量進行同時檢測。
本實驗采用HPLC法對小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B含量進行了同時測定,建立了該制劑的多指標成分質(zhì)量控制評價模式,所建立的方法操作簡便、結(jié)果準確,為全面評價小兒康顆粒的整體質(zhì)量提供了參考依據(jù),同時采用聚類分析、主成分分析對3個不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的12批次小兒康顆粒樣品質(zhì)量進行了綜合評價。結(jié)果顯示,同一生產(chǎn)企業(yè)樣品相對穩(wěn)定,不同生產(chǎn)企業(yè)樣品間存在一定差異,可能與各生產(chǎn)企業(yè)原藥材質(zhì)量控制和生產(chǎn)過程參數(shù)控制存在一定差異有關,提示藥品生產(chǎn)企業(yè)應加強原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)等源頭控制,不斷提升原藥材內(nèi)控質(zhì)量標準,優(yōu)化制劑生產(chǎn)過程控制參數(shù),確保產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的一致性。