龐芹，黃宇，吳敏，覃開羽

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 婦科，廣西 柳州；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，廣西 柳州）

0 引言

陰道炎是婦科常見病，引起外陰瘙癢、灼痛、陰道分泌物增多，影響患者正常生活，既往報道證實致病菌是引起陰道炎的主要病因，致病菌種類繁多，陰道炎發(fā)病率逐年上升[1-3]。目前臨床有關(guān)陰道炎的外用藥物種類較多，療效不一[4]。婦科洗屬中藥外用制劑，本研究所用婦科洗是本院協(xié)定處方，近年來婦科洗劑在院外患者使用逐漸增多[5]。有關(guān)婦科洗在陰道炎患者中的應(yīng)用，臨床尚未有統(tǒng)一標準[6]。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazole Chloride, TTC）被多次推薦為抗菌實驗試劑[7]，為規(guī)范婦科洗用藥，本研究采用TTC法探討其抗菌效果。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑

TTC由上海亨代勞生物科技有限公司提供，實驗菌株包括大腸桿菌（ATCC15597）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、表皮葡萄球菌（ATCC49134）糞腸球菌（ATCC51299）、奇異變形桿菌（ATCC12453）白色念珠菌（ATCC14053）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）、肺炎克雷伯菌（ATCC13883）及陰溝腸桿菌（ATCC700323）。婦科洗由本院協(xié)定處方，煎藥房煎制而成，規(guī)格300mL。新西蘭兔（清潔級）由蘇州湖橋生物科技有限公司提供。AMRESCO增菌液由上海撫生生物科技有限公司提供。

1.2 菌液備制

取冷凍保存的菌株斜面培養(yǎng)物，分別放入增菌液試管中，37 ℃下孵育24h，然后在培養(yǎng)基平板上將懸液進行分離，37 ℃下再次孵育24h。然后將菌落接種在營養(yǎng)瓊脂斜面，用生理鹽水沖洗除去斜面菌苔。將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基融化，冷卻后加入TTC和1.0 mg/mL瓊脂液，稀釋成1×107cfu/mL濃度，得到實驗菌液后備用。

1.3 滅菌實驗

取婦科洗5.0mL與0.5 mL菌液混勻，作用10 min，然后制成瓊脂平板，37 ℃下孵育24h后，計算菌落數(shù)和殺菌率。菌落數(shù)和殺菌率計算方法均參照《中國藥典》附錄微生物限度檢查法：取50 cfu/mL含菌液1 mL，加入滅菌平皿，培養(yǎng)72h后計數(shù)，記錄菌落顏色變化，據(jù)此作為菌落計數(shù)，然后計算殺菌率。最低抑菌濃度計算：將婦科洗按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32比例進行稀釋，再將稀釋后的婦科洗溶液按每2 mL婦科洗+18 mL培養(yǎng)基混勻備用。取少量待測菌株研磨，配制0.5麥氏單位菌懸液，再以1:10比例稀釋，滴種于各婦科洗培養(yǎng)基中，37 ℃孵育24h后，記錄最低抑菌濃度，以無菌生長的最高稀釋濃度作為最低抑菌濃度。最低記錄致病菌開始被抑制和完全被抑制時TTC濃度。以相鄰菌落團數(shù)量明顯減少或試驗菌顏色明顯變化為致病菌開始被抑制時間，以菌落團被殺滅消失為完全被抑制。

1.4 毒性實驗

取清潔級新西蘭兔，用醫(yī)用剪刀剪去兔脊柱兩側(cè)區(qū)域兔毛，每側(cè)30 mm×30 mm，一側(cè)用沾有婦科洗的紗條浸潤貼敷，另一側(cè)作為對照。

2 結(jié)果

2.1 婦科洗殺菌效果

婦科洗藥液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌均具有較好的殺菌效果，隨著時間延長，殺菌率有上升趨勢，見表1。

表1 婦科洗殺菌效果（%）

2.2 各致病菌開始被抑制和完全被抑制時TTC濃度

在加入TTC的增菌液中，各致病菌開始被抑制和完全被抑制時TTC濃度，見表2。

表2 致病菌開始被抑制和完全被抑制時TTC濃度（mg/mL）

2.3 婦科洗最低抑菌濃度結(jié)果

婦科洗對陰道炎各菌種均具有一定程度的殺菌作用，其強度依次為大腸桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、奇異變形桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌及表皮葡萄球菌，見表3。

表3 婦科洗最低抑菌濃度結(jié)果（g/L）

2.4 毒性試驗結(jié)果

毒性試驗結(jié)果顯示，未出現(xiàn)紅腫、潰爛等毒副反應(yīng)。

3 討論

陰道炎是臨床最常見感染性疾病。目前，隨著醫(yī)療技術(shù)的進步，陰道炎療效逐漸改善[8]。中醫(yī)藥引起毒副作用少的特點受到臨床醫(yī)師和患者青睞，在陰道炎治療尤其是院外患者自行治療方面占據(jù)重要地位[9]。外用洗劑可直接作用于病變部位，發(fā)揮清洗、抗菌作用。婦科洗屬于中藥外用成劑，包含黃柏、蛇床子、地膚子、松崗油等成分，黃柏性寒，具有清熱燥濕作用[10]，藥理學(xué)研究證實其有效提取物川黃柏生物堿具有良好的抗炎殺菌作用[11]。解光艷等[12]則認為蛇床子素可通過破壞外陰念珠菌病混合菌的生物膜，進而達到滅菌效果。而地膚子對大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌及白色念珠菌均具有抑菌作用[13]。近年來有關(guān)婦科洗在臨床應(yīng)用已有報道[14]，但用藥方案不一。

本研究通過體外實驗檢測婦科洗對陰道炎常見致病菌種的抑制作用，并計算最低抑菌濃度，為臨床合理用藥提供參考。TTC即C19H15CIN4，屬無色氧化劑，分解性強，還原形成三苯甲臜，能清晰顯示菌落分布，TTC被作為指示劑廣泛用于臨床[15]。另外，本研究瓊脂濃度為1.0 mg/mL，Shinu P等[16]發(fā)現(xiàn)以此濃度可使菌落呈短線或圓球狀，并使菌液顯色，減少漏檢，這對于提高檢測計算的準確性具有重要意義。另外，也有學(xué)者認為樣品試劑中可能因含有其他菌種而影響菌落計數(shù)，造成結(jié)果不準確。TTC不僅具有顯色效果，且具有一定的抑菌作用，這也可能影響對婦科洗滅菌效果的檢測結(jié)果。其干擾作用可能隨TTC濃度增加而增大，理論上既能顯示相同殺菌抑菌效果、干擾作用又小的濃度為最佳TTC濃度，本研究設(shè)計使用了不同梯度濃度的TTC目的也在于此。此外，本研究顯示TTC對不同菌株開始被抑制和完全被抑制時間有所不同，這可能與其敏感度有關(guān)，而對于不同來源的同一菌株在TTC中是否具有敏感性差異也有待今后進一步研究。

綜上，TTC用于婦科洗的體外滅菌實驗，有助于提高菌落顯色效果，減少漏檢，但有關(guān)其與不同致病菌敏感性關(guān)系有待深入研究。