黎威巍，李菁琦，李 彥，張 燕，金科華

(湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

饑餓與飽食對(duì)肝糖原含量的影響是一個(gè)重要的綜合性生化實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)糖原水解產(chǎn)物與班氏試劑反應(yīng)生成磚紅色氧化亞銅的量來(lái)判斷糖原含量的高低。筆者按本教研室實(shí)驗(yàn)教程[1]帶教時(shí)，發(fā)現(xiàn)從飽食小鼠的肝臟提取的糖原水解產(chǎn)物與班氏試劑反應(yīng)沉淀量太少或無(wú)沉淀。實(shí)驗(yàn)失敗易導(dǎo)致學(xué)生喪失實(shí)驗(yàn)興趣，降低教師帶教的激情。為解決這一問(wèn)題，我們對(duì)水解糖原的鹽酸濃度、水解時(shí)間及氫氧化鈉的量進(jìn)行優(yōu)化，顯著改善了糖原鑒定效果，現(xiàn)予以報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

家兔由我校動(dòng)物室提供。分析純?nèi)纫宜?、氫氧化鈉為天津歐博凱化工有限公司產(chǎn)品，濃鹽酸為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。分別將三氯乙酸、氫氧化鈉溶于蒸餾水，配制5%三氯乙酸、20%氫氧化鈉各200mL。B-廣范試紙(pH1-14)為上海三愛(ài)思試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 糖原的提取

將家兔頸椎脫臼處死，取20g肝臟，分成10等分，剪碎，每份加6mL 5%三氯乙酸，制備勻漿。勻漿于3 600r/min室溫離心4min(下同)。上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加等體積無(wú)水乙醇，混勻，離心。棄上清，將離心管倒扣于紙巾上，吸干殘存液體，50℃烘干，取風(fēng)干的糖原400mg溶于10mL蒸餾水，配制40mg/mL糖原溶液。

1.3 鹽酸濃度對(duì)糖原水解的影響

取5支1.5mL EP管，依次編號(hào)為1、2、3、4、5，按表1依次加入糖原溶液，蒸餾水和濃鹽酸，渦旋混勻，置沸水浴反應(yīng)5min，取出，置冰水中冷卻2min。取糖原水解20 μL于反應(yīng)板上，與等體積的 0.3%碘液混勻，比較紅褐色深淺。見(jiàn)表1。

表1 鹽酸濃度對(duì)糖原水解的影響

1.4 時(shí)間對(duì)糖原水解的影響

取8支1.5mL EP管，依次編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8，按表2依次加入糖原溶液和濃鹽酸，渦旋混勻，置沸水浴水解0～3.5min，取出，置冰水中冷卻2min。取糖原水解10μL于反應(yīng)板上，與等體積的0.3%碘液混勻，比較紅褐色深淺。見(jiàn)表2。

表2 水解時(shí)間對(duì)糖原水解的影響

1.5 氫氧化鈉濃度對(duì)班氏試劑反應(yīng)的影響

將4mL糖原溶液與800μL濃鹽酸渦旋混勻，按650μL/管分裝至5支1.5mL EP管中，沸水浴反應(yīng)3.5min，取出，置冰水中冷卻2min。按表3加入氫氧化鈉和蒸餾水，渦旋混勻。取中和后的水解液300μL分別與150μL班氏試劑渦旋混勻，置沸水浴中反應(yīng)3min，取出，置冰水中冷卻2min，記錄沉淀量。見(jiàn)表3。

表3 氫氧化鈉量對(duì)班氏試劑反應(yīng)的影響

2 結(jié) 果

2.1 鹽酸濃度對(duì)糖原水解的影響

鹽酸濃度對(duì)糖原水解影響的結(jié)果見(jiàn)圖1(封三)，由圖可知，糖原水解速度隨鹽酸終濃度增大而加快。終濃度0.5mol/L的鹽酸，即可有效水解糖原；鹽酸終濃度達(dá)到2mol/L及以上時(shí)，5min內(nèi)即可將反應(yīng)體系中的糖原完全分解。

2.2 時(shí)間對(duì)糖原水解影響

終濃度2mol/L的鹽酸反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖原水解影響的結(jié)果見(jiàn)圖2(封三)?？芍S時(shí)間加長(zhǎng)，糖原水解程度加深，至3.5min時(shí)，糖原完全水解。

2.3 氫氧化鈉中和鹽酸的最佳用量

不同體積的氫氧化鈉中和水解產(chǎn)物中的鹽酸后，中和液與班氏試劑反應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)圖3(封三)。由圖知，不加氫氧化鈉(圖3A)及加300μL氫氧化鈉(圖3B)中和的管均無(wú)沉淀生成；加380μL氫氧化鈉中和的管開(kāi)始出現(xiàn)磚紅色沉淀(圖3C)；加420μL氫氧化鈉的管沉淀明顯增多(圖3D)；當(dāng)氫氧化鈉為460μL時(shí)，沉淀較之380μL未見(jiàn)增多(圖3E)。綜上可知，隨中和鹽酸所用氫氧化鈉量的增加，水解產(chǎn)物與班氏試劑反應(yīng)的沉淀從無(wú)到有，從少到多，當(dāng)氫氧化鈉為420μL時(shí)，沉淀量達(dá)最大值。

3 討 論

沸水浴時(shí)，鹽酸催化糖原水解為葡萄糖。諸多實(shí)驗(yàn)教程[2-4]都限定了水解糖原所用濃鹽酸體積和反應(yīng)時(shí)間，未探究鹽酸終濃度對(duì)水解反應(yīng)速度的影響，便用氫氧化鈉中和鹽酸，終止水解反應(yīng)，取糖原水解液與班氏試劑反應(yīng)。如此操作，若糖原水解不充分，生成的葡萄糖少，易導(dǎo)致水解產(chǎn)物與班氏試劑反應(yīng)生產(chǎn)的氧化亞銅沉淀不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，隨鹽酸濃度增加和水解時(shí)間延長(zhǎng)，糖原水解程度增加。為此，筆者建議實(shí)驗(yàn)者在用氫氧化鈉中和鹽酸前，取少量水解液和水解前的糖原分別與碘液反應(yīng)，判斷糖原水解程度，確認(rèn)水解完全，再用氫氧化鈉終止水解反應(yīng)。

弱堿性的班氏試劑與葡萄糖反應(yīng)生成磚紅色沉淀[5]。在酸性環(huán)境中，班氏試劑中的Cu2+較為穩(wěn)定，不容易與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)。為此，中和糖原水解液中的鹽酸，使水解液呈堿性是班氏試劑與葡萄糖反應(yīng)的前提。中和水解液中的鹽酸所用的氫氧化鈉量與磚紅色深淺的關(guān)系未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)教程中用6～8滴20%的氫氧化鈉中和水解反應(yīng)中的10滴濃鹽酸，并強(qiáng)調(diào)滴加的氫氧化鈉中和液以使石蕊試紙剛變藍(lán)為宜。濃鹽酸摩爾濃度為12mol/L，20%氫氧化鈉摩爾濃度為5mol/L，理論上，中和本反應(yīng)體系中濃鹽酸的所需氫氧化鈉體積為鹽酸體積的2.4倍?？梢?jiàn)，教程中中和鹽酸所用的氫氧化鈉量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。340μL氫氧化鈉中和水解液中的150鹽酸后，中和液剛使pH試紙變藍(lán)(少于此體積，試紙不變藍(lán))，但此時(shí)并沒(méi)有沉淀生成。當(dāng)氫氧化鈉的增加至380μL時(shí)，中和液與班氏試劑反應(yīng)才出現(xiàn)磚紅色沉淀，隨氫氧化鈉體積增加，沉淀逐漸加深；當(dāng)氫氧化鈉達(dá)到420μL時(shí)，磚紅色達(dá)到最深，繼續(xù)增加氫氧化鈉，磚紅色不再加深。

班氏試劑通過(guò)其成分中的碳酸鈉維持弱堿性環(huán)境。圖3A和3B管中的水解液中的鹽酸若未經(jīng)氫氧化鈉中和或氫氧化鈉的量不夠，加入班氏試劑即產(chǎn)生大量氣泡，表明水解液中的鹽酸分解碳酸鈉，破壞弱堿性環(huán)境，導(dǎo)致無(wú)氧化亞銅沉淀生成。