張思琪，谷相勇，劉濱磊*

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.武漢濱會生物科技股份有限公司)

肝癌作為一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國逐年上升[1]。有研究表明，乙型肝炎病毒作為誘發(fā)肝癌的最主要危險因素之一[2]，其所編碼的乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)在很多肝癌中存在高表達趨勢[3]。由于乙型肝炎相關的原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)通常同時攜帶乙肝病毒[4]，在臨床治療過程中，常采取在抗腫瘤治療的同時給予抗乙肝病毒來改善患者肝功能，降低肝臟病毒載荷量，延長肝癌患者生存期[5]。富馬酸替諾福韋二吡呋酯(TDF)[6]、阿德福韋酯(Ade)、替比夫定(Telb)[7]是目前3種經(jīng)常使用的核苷類抗乙肝病毒藥，臨床上廣泛運用于乙肝相關的原發(fā)性肝癌患者的治療。核苷類抗乙肝病毒藥主要是通過抑制HBV逆轉錄，或是與HBV的DNA鏈競爭性結合，影響病毒復制，最終達到抗病毒的效果[8]。

Ⅱ型溶瘤單純皰疹病毒(oncolyticherps simplex virus Ⅱ，OH2)是在野生型單純皰疹病毒株Ⅱ型的基礎上通過基因編輯技術，在敲除神經(jīng)毒性基因(ICP34.5)、刪除免疫抑制基因(ICP47)的同時，在ICP34.5位點插入編碼的人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF)基因序列，構造出的一種溶瘤病毒[9]。因其溶瘤活性強，靶向性好，能攜帶多種外源基因，又同時兼具安全性強等特點[10],從而引起溶瘤病毒相關研究人員強烈關注。在目前的臨床試驗中，OH2注射液的治療效果及受試者對藥物的耐受性均表現(xiàn)良好，且患者注射部位反應較小，安全性好[11]，具有很好的應用前景。但在臨床對于乙型肝炎相關原發(fā)性肝癌的治療過程中，患者通常需要同時服用抗乙肝病毒藥物來延緩疾病的發(fā)展。本文旨在回答OH2作為一種改造后病毒，在對攜帶HBV肝癌患者的治療上，其療效是否會受到目前臨床常見的3種抗乙肝病毒藥物的影響，為OH2的肝癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和細胞

正常BALB/c小鼠，6～8周齡，無基因改造及免疫缺陷。購自湖北省疾控中心。

CT26-iRFP細胞(本實驗室提供)，是通過PiggyBac轉座子系統(tǒng)將近紅外熒光蛋白iRFP720轉入鼠結腸癌細胞CT26細胞株，并通過嘌呤霉素篩選獲得CT26-iRFP720單克隆細胞株[12]。

1.1.2 試劑與儀器

DME/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司。胎牛血清購自四季青公司。肌醇山梨醇緩沖液(IS Buffer)由本實驗室配制。胰酶購自Gibco公司。OH2病毒是通過HG52野生病毒株的基因組中剔除ICP34.5和ICP47基因,并插入hGM-CSF表達序列的改造病毒[13](本實驗室提供)重懸于IS Buffer并分裝凍存在-70℃冰箱中，在使用前進行快速解凍。每一個時間點的研究所用病毒都是新鮮解凍。實驗用病毒沒有重復凍融。Ade、TDF片均購自湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院；Telb購自華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院。所有藥物使用時均獲得國藥準字號，且在保質(zhì)期內(nèi)。

二氧化碳培養(yǎng)箱購于日本松下公司。細胞計數(shù)儀購于賽默飛科技有限公司。動物活體成像系統(tǒng)購于PE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病毒準備

將按標準生產(chǎn)流程生產(chǎn)的1×108CCID50/mL的OH2病毒解凍后混合均勻，使用IS Buffer稀釋到約1×107CCID50/mL，分裝到EP管中凍存在-70℃冰箱中。

1.2.2 抗乙肝病毒藥物準備

依照藥物使用說明并根據(jù)人和鼠的體表面積比例計算小鼠每日給藥量，即若將人的單日有效劑量記為A，小鼠單日有效劑量記為B，按小鼠(20g)體表面積是人(70kg)的0.0026倍，則小鼠單日需使用的劑量為B=0.0026×A。Telb人使用劑量為600mg/d，故小鼠注射劑量為1.56mg/100μL。Ade人使用劑量為10mg/d，故小鼠每日劑量為26μg/100μL，TDF人使用劑量為300mg/d，故小鼠注射劑量為780μg/100μL。將Telb、TDF用無菌PBS充分溶解，Ade加入少量無水酒精充分溶解，然后用無菌PBS分別將3種藥物稀釋到目的濃度，最終用0.22μm的濾頭在生物安全柜中過濾除菌，分裝到EP管中，放4℃避光保存。

1.2.3 CT26-iRFP細胞準備

從液氮中取出一只CT26-iRFP細胞復蘇，使用含10%胎牛血清的DME/F12在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞匯合度達到80%～90%進行細胞傳代。待細胞達到80%～100%匯合度后收集培養(yǎng)瓶中的CT26-iRFP細胞，醫(yī)用離心機820g離心5min，隨后用無血清DME/F12重懸，并將細胞稀釋到1×107個/mL。

1.2.4 小鼠皮下移植瘤誘導

22只雌性BALB/c小鼠于右側腹部皮下注射100μL含有1×106CT26-iRFP鼠結腸癌細胞懸液以誘導腫瘤。成瘤后，分別量取腫瘤長徑(a)、短徑(b)，腫瘤體積(TV)的計算公式為：TV=1/2×a×b×b。

1.2.5 小鼠分組給藥及量瘤

待腫瘤體積達到約80mm3時，將22只荷瘤鼠隨機分為5組，每組4～5只，分別為陰性對照組(n=4)、OH2組(n=5)、OH2+Telb組(n=5)、OH2+Ade組(n=4)、OH2+TDF組(n=4)。第一次治療記為第0d，治療包括OH2病毒瘤內(nèi)注射和抗乙肝病毒藥物溶液腹腔注射。各治療組的病毒劑量和注射體積一致，為1×106CCID50/100μL/只，陰性對照組瘤內(nèi)注射病毒重懸用的肌醇山梨醇緩沖液(IS Buffer)100μL。同時，連續(xù)7d，各OH2+抗乙肝病毒藥物組動物每日經(jīng)腹腔注射100μL有效劑量的抗乙肝病毒藥物PBS溶液，陰性對照組和OH2單藥治療組動物于腹腔注射等量PBS。動物皮下植瘤后第10d(平均瘤體積約80mm3)開始用OH2治療，將第一次治療記為第0d，于第0、4、7d共給藥3次，實驗觀察時間為21d。在首次給藥后通過測量腫瘤體積來對病毒抑瘤效果進行評估。

1.2.6 小鼠腫瘤近紅外拍攝

在治療后第21d，將各組動物分組放入動物活體成像系統(tǒng)，拍攝腫瘤近紅外熒光表達圖片，并記錄同等面積下小鼠腫瘤的總熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad Prism 6.01軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠量瘤結果

研究結果表明在CT26-iRFP皮下移植瘤模型上，與陰性對照比所有瘤內(nèi)注射OH2的動物腫瘤生長趨勢更為平緩(圖1，封二)。給藥第21d，與陰性對照組比較，3組治療效果明顯(圖2，封二)：OH2組(P=0.0267)；OH2+Ade組(P=0.0071)；OH2+TDF組(P=0.0168)，且3組均有無瘤動物產(chǎn)生，但3個有效組之間療效無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。停藥一段時間后，3個有效組的腫瘤治療效果未見明顯反彈。OH2+Telb組與陰性對照組相比較抑瘤效果無顯著性差異(P=0.3105)。

2.2 小鼠腫瘤總熒光強度結果

在實驗第21d對各組小鼠分別進行近紅外熒光強度檢測。結果表明在CT26-iRFP皮下移植瘤模型上，小鼠腫瘤總熒光強度與量瘤數(shù)據(jù)的趨勢基本一致(圖3，封三)，已有兩只動物iRFP信號消失，且出現(xiàn)一只無瘤動物。其中OH2+Ade(P=0.0092)；OH2+TDF(P=0.0313)。OH2組雖與陰性對照組相比未見顯著性差異(P=0.0888)，但陰性對照組的腫瘤總熒光強度約為OH2組的兩倍(6.61×109±2.33×109vs 1.28×1010±1.96×109)，OH2+Telb組和陰性對照組相比在腫瘤總熒光強度方面未見顯著性差異，OH2+Telb組熒光強度為(1.07×1010±1.52×109)，陰性對照組為(1.28×1010±1.96×109)。見圖4(封三)。

3 討 論

溶瘤病毒作為一種目前新興的抗腫瘤生物治療技術受到了眾多研究者的關注和腫瘤患者的期待[14]。但對于同時攜帶HBV的腫瘤患者來說，他們?nèi)粘７玫目共《舅幬锸欠駮θ芰霾《镜闹委熜Чa(chǎn)生抑制作用，不單是研究者們需要考慮的問題，更是溶瘤病毒普適性的一種體現(xiàn)。

本文針對在腹腔分別注射Ade、TDF、Telb的情況下，溶瘤病毒OH2對CT26-iRFP腫瘤進行瘤內(nèi)給藥的治療效果進行實驗，評估OH2在3種常見抗HBV藥物的作用下的溶瘤情況。實驗結果表明，OH2+Ade組和OH2+TDF組的OH2對小鼠腫瘤有明顯的治療效果，且與OH2組的腫瘤大小無顯著性差異，甚至在腫瘤熒光強度上的數(shù)值更小。因此，我們認為OH2組對腫瘤依然有很好的治療作用，可能是由于樣本數(shù)量較少，另外兩只小鼠腫瘤熒光強度過高導致兩組間對比無差異。我們可以認為在本次試驗中Ade和TDF對OH2的溶瘤效果沒有影響。OH2+Telb組在第3次給藥結束后的一周時間里，腫瘤生長的速率低于陰性對照組，但相比OH2組其生長速率還是處于一個較快的趨勢。在隨后的一周時間內(nèi)，OH2+Telb組小鼠的腫瘤快速增長，其生長速率接近陰性對照組，但即使在這種情況下，在實驗結束時OH2+Telb組的腫瘤體積仍小于陰性對照組。我們認為，Telb對OH2的治療效果存在影響，且很有可能是通過中斷OH2在腫瘤中的持續(xù)性復制，或影響OH2中hGM-CSF的表達削弱了抗腫瘤免疫反應，從而導致在OH2治療后期，腫瘤的增長速率變快，最終未達到理想的抗腫瘤效果。

綜上所述，OH2+Ade組和OH2+TDF組對OH2的溶瘤效果影響小，更適合推薦給參與OH2抗腫瘤治療臨床試驗的HBV攜帶者使用，以減少抗乙肝病毒藥物對OH2治療效果的干擾。