王文靜， 麻冬梅， 趙麗娟， 馬巧利

(寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧夏 銀川 750021)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中由于大量施用化肥、大水漫灌以及氣候等因素的變化，使得全球鹽堿化土壤面積不斷擴(kuò)增[1]。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致滲透脅迫、離子毒害及離子分布不平衡，阻止植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和攝取、損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、擾亂細(xì)胞的生理代謝，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[2-6]。同時(shí)鹽脅迫影響植物葉片的光合作用和呼吸作用，降低植物吸水性[7]，抑制根系對(duì)植物必需營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，造成植株?duì)I養(yǎng)虧缺[8]，生育期變短，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)[9]。由于鹽堿脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)造成的巨大危害，尋找對(duì)鹽堿脅迫具有抑制作用的物質(zhì)以提高作物產(chǎn)量和改善鹽堿地方面具體重要意義。

2，4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)是一類對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要影響的新激素，可促進(jìn)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，提高植物酶活性并參與植物體其他生理過程[10-13]。張紅[14]研究表明鹽脅迫下玉米(ZeamaysL.)種子經(jīng)EBR處理可提高發(fā)芽率和出苗整齊度；謝云燦等[15]研究表明，噴施外源EBR預(yù)處理不但可以通過提高常溫和高溫條件下大豆(Leguminosae)葉片的光合能力、促進(jìn)干物質(zhì)積累、提高產(chǎn)量，而且提高了籽粒中蛋白質(zhì)含量、改善了籽粒品質(zhì)；陸曉民等[16]研究發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫下噴施EBR后黃瓜(CucumissativusLinn.)幼苗根系的線粒體抗氧化酶活性升高，超氧陰離子產(chǎn)生速率、過氧化氫含量、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量降低，根尖細(xì)胞受損害程度降低，從而減輕了鹽脅迫對(duì)植物造成的傷害；寇江濤等[17]研究表明，EBR可增強(qiáng)鹽脅迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)根系的活性氧清除能力，降低植物體內(nèi)活性氧含量。因此，EBR在增強(qiáng)植株抗逆性、提高抗氧化酶活性和調(diào)節(jié)光合作用方面起著重要作用[18-19]。

苜蓿(Medicagosativa)作為優(yōu)質(zhì)的豆科類牧草，被譽(yù)為“牧草之王”[20]。苜蓿具有較強(qiáng)的耐鹽性，其葉片對(duì)鹽分侵害具有一定的抵抗能力，因此也是一類改善鹽堿地狀況的理想作物[21]。目前，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者主要圍繞糧食類作物[8，13]、豆類作物[9]和蔬菜類作物[10，12，14]利用EBR增強(qiáng)植物耐鹽性進(jìn)行了大量研究，而針對(duì)不同激素濃度對(duì)紫花苜蓿幼苗材料的研究相對(duì)較少，且研究領(lǐng)域以光合特性和膜滲透調(diào)節(jié)為主，而對(duì)鹽脅迫條件下植物體內(nèi)關(guān)鍵酶活性和離子吸收分配的調(diào)節(jié)效應(yīng)缺乏機(jī)理性研究。為此，本研究以紫花苜蓿‘阿迪娜’為試驗(yàn)材料，探究外源激素EBR對(duì)鹽脅迫下苜蓿幼苗生理特性及離子分配與吸收的影響，以期為利用EBR增強(qiáng)苜蓿耐鹽性能的生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)選擇紫花苜?！⒌夏取癁椴牧?，該材料來自于寧夏大學(xué)種質(zhì)資源庫(kù)。于2019年5—9月在寧夏大學(xué)西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室(38°30′ N，106°8′ E)進(jìn)行試驗(yàn)。苜蓿種子用0.1% HgCI2消毒8 min，然后用75%酒精消毒30 s，再用蒸餾水漂洗5～6遍，將清洗消毒之后的種子均勻鋪在放好濾紙的培養(yǎng)皿中，并將濾紙用蒸餾水噴濕，放入人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)至種子發(fā)芽(24～26℃)。待幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)移至裝有3L Hoagland，s營(yíng)養(yǎng)液的水培箱進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。在營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)30 d后開始處理。

試驗(yàn)設(shè)置 5個(gè)處理，分別為CK(澆灌營(yíng)養(yǎng)液)、150 mmol·L-1NaCl(N)，150 mmol·L-1NaCl+0.3 μmol·L-1EBR(M1)、150 mmol·L-1NaCl +0.6 μmol·L-1EBR(M2)、150 mmol·L-1NaCl +1.2 μmol·L-1EBR(M3)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。連續(xù)處理7 d后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

生理指標(biāo)測(cè)定方法：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD) 活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光還原法；過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定吸光值；過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定；丙二醛含量采用李合生的硫代巴比妥酸法測(cè)定；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法，具體步驟可參考趙世杰等的測(cè)定方法[22]。

無機(jī)離子含量測(cè)定：將植株的根系用去離子水潤(rùn)洗干凈，并將水分用吸水紙吸干，采用干燥法對(duì)干物質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。將各處理的干樣粉碎、研磨和過篩，根據(jù)毛美飛等[23]方法測(cè)定Na+，K+，Ca2+，Mg2+含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，用SPSS 18.0軟件中的鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行單因素方差分析和多重比較(LSD<0.05)、相關(guān)性分析，并用不同字母標(biāo)注差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素EBR對(duì)紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)及表型的影響

與CK相比，150 mmol·L-1NaCl降低了紫花苜蓿生長(zhǎng)指標(biāo)，其中根長(zhǎng)變化最明顯，降幅達(dá)45.3%。M1處理各項(xiàng)指標(biāo)變化小，與CK差異不顯著。M2，M3處理根長(zhǎng)和根粗與CK相比有所提高(表1)。由于水培條件下鹽溶液中的Na+和CI-1可直接迅速侵入根系，因此在脅迫后很短的時(shí)間內(nèi)苜蓿幼苗就出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，但在噴施不同濃度的外源激素EBR 2～3 h后，幼苗莖葉萎蔫現(xiàn)象緩解，逐漸恢復(fù)到鹽脅迫前的表型(圖1)。說明就表型特征而言，外源激素EBR對(duì)鹽脅迫的危害具有一定緩解作用。

表1 外源激素EBR對(duì)鹽脅迫下苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of exogenous EBR on the growth of Alfalfa seedlings under salt stress

圖1 外源激素EBR對(duì)鹽脅迫下苜蓿幼苗表型的影響Fig.1 Effect of exogenous hormone EBR on alfalfa seedling phenotype under Salt Stress

2.2 外源激素EBR對(duì)NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，鹽脅迫會(huì)大幅度降低苜蓿幼苗葉片的抗氧化酶活性。葉片中SOD，POD，CAT活性隨著EBR濃度的升高出現(xiàn)下降—上升—下降的趨勢(shì)，并最終低于對(duì)照。與150 mmol·L-1NaCl脅迫相比，M1，M2和M3處理時(shí)苜蓿幼苗的抗氧化酶活性均升高，且M2處理下升高趨勢(shì)達(dá)顯著性差異，說明外源激素EBR濃度為0.6 μmol·L-1時(shí)可以顯著提高紫花苜蓿幼苗的抗氧化酶活性，減輕鹽脅迫對(duì)苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響。

圖2 外源激素EBR對(duì)NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of exogenous hormone EBR on antioxidant enzyme activity of alfalfa seedlings under NaCl stress

2.3 外源激素EBR對(duì)NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片丙二醛含量及電解質(zhì)滲透率的影響

由圖3可知，150 mmol·L-1NaCl脅迫處理下，苜蓿幼苗葉片中的電解質(zhì)滲透率和MDA含量升高，顯著高于對(duì)照(P<0.05)。鹽脅迫下添加0.6 μmol·L-1外源激素EBR顯著降低了NaCl脅迫導(dǎo)致的電解質(zhì)滲透和MDA積累。丙二醛含量越高，對(duì)膜和細(xì)胞造成的傷害越大，說明外源激素EBR可以減少鹽脅迫對(duì)植物細(xì)胞過氧化的危害，提高植株對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)性。

圖3 外源激素EBR對(duì)NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片丙二醛含量及電解質(zhì)滲透率的影響Fig.3 Effects of exogenous hormone EBR on MDA content and electrolyte permeability of alfalfa seedling leaves under NaCI Stress

2.4 外源激素EBR對(duì)NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，與對(duì)照相比，鹽脅迫處理下苜蓿幼苗的可溶性蛋白含量顯著下降(P<0.05)；鹽脅迫時(shí)噴施不同濃度外源激素EBR后，幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量均有提高，M2處理上升趨勢(shì)最明顯，但含量均低于沒有鹽脅迫影響。說明鹽脅迫使苜蓿幼苗體內(nèi)的可溶性蛋白含量降低，影響植物體內(nèi)氮素的形成和正常的滲透勢(shì)過程，破壞可溶性蛋白對(duì)植物細(xì)胞和生物膜的保護(hù)作用，而適當(dāng)濃度(0.6 μmol·L-1)的外源激素EBR可以抑制鹽脅迫的部分影響。

圖4 不同處理下可溶性蛋白含量變化Fig.4 Changes of soluble protein content under different treatments

2.5 外源激素EBR對(duì)鹽脅迫下苜蓿幼苗無機(jī)離子含量的影響

150 mmol·L-1NaCl處理下苜蓿幼苗根系中的Na+含量顯著升高，K+，Ca2+和Mg2+含量顯著降低(P<0.05)(圖5)。和CK相比，NaCl處理苜蓿幼苗葉片中的Na+含量提高了32.8%(P<0.05)，K+，Ca2+，Mg2+含量分別降低了57.1%，69.7%和19.2%。由圖5可知，M1處理Na+含量與對(duì)照相比上升，與鹽脅迫處理相比含量下降；M1處理K+含量較對(duì)照下降了22.8%(P<0.05)，比鹽脅迫處理略有上升；M1處理Ca2+和Mg2+含量均低于CK處理，但高于鹽脅迫處理，分別提高了30.7%和29.1%。M2處理苜蓿幼苗根系的Na+含量顯著低于NaCl處理的Na+離子含量，K+，Ca2+和Mg2+含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于NaCl處理，分別提高53.8%，66.7%，31.2%(P<0.05)。M3處理其離子含量變化趨勢(shì)同M2，Na+含量低于鹽脅迫處理，K+,Ca2+和Mg2+含量均高于鹽脅迫。綜上所述，150 mmol·L-1NaCl使植物體內(nèi)K+，Ca2+和Mg2+等陽(yáng)離子含量下降，噴施外源激素EBR可以有效減小鹽脅迫的危害并且控制植物體內(nèi)離子平衡和對(duì)植株根系生長(zhǎng)的影響以及根系對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收促進(jìn)，0.6 μmol·L-1EBR為紫花苜蓿較為適應(yīng)的激素濃度。

3 討論

在我國(guó)南北方許多地區(qū)存在大量鹽堿地，對(duì)各類植物造成危害，不同基因型植物對(duì)鹽害的適應(yīng)能力不同[26]。有大量研究報(bào)道，土壤中的含鹽量在超過0.2%～0.25% 時(shí)就會(huì)對(duì)敏鹽植株正常生長(zhǎng)造成危害，耐鹽植物可忍受鹽分濃度為0.5%～1.8%。在我國(guó)西北地區(qū)、華北地區(qū)、東北部分和海濱等地分布有大量鹽堿地，總面積大約(2～7)×107ha[27]。鹽脅迫條件下，敏鹽種子的萌發(fā)受到抑制，同時(shí)植株的發(fā)芽率、干鮮重等顯著降低?？芙瓭齕17]、王小山[18]等研究表明，外源激素EBR可以緩解鹽脅迫對(duì)植株生長(zhǎng)造成的影響。本試驗(yàn)中，施加微量外源激素EBR便可提高紫花苜蓿幼苗中的抗氧化酶活性，使植株的可溶性蛋白含量增加，而對(duì)苜蓿幼苗的丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率具有一定的抑制作用，抗氧化酶可以有效地清除膜質(zhì)過氧化物對(duì)植物造成的傷害，其活性越高，植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力越強(qiáng)[19]，因此外源激素EBR可在一定程度上緩解膜脂過氧化對(duì)苜蓿幼苗造成的傷害，增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的抵抗能力，減輕鹽脅迫對(duì)苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響，這一結(jié)論也與梁超[24]、鄒琦[25]等的研究結(jié)果相似。相對(duì)而言鹽溶液明顯抑制抗氧化酶活性，提高丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率，這也和前人的研究結(jié)果相似[14-18]。由此可知，適量濃度的外源激素EBR對(duì)鹽脅迫的抑制作用明顯，可加強(qiáng)植物的耐鹽性，對(duì)鹽脅迫生態(tài)系統(tǒng)的改善具有很好的效果。

在對(duì)離子的研究方面，K+影響著植物體的水分和光合利用,淀粉以及蛋白質(zhì)合成，是構(gòu)成細(xì)胞滲透勢(shì)的主要離子[28]，其濃度高低對(duì)氣孔的開閉有調(diào)節(jié)作用。Ca2+調(diào)節(jié)植物體的許多生理代謝過程，在植物的信號(hào)傳導(dǎo)過程中充當(dāng)?shù)诙攀筟29]，能夠提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)性。Mg2+與植物的光合作用密切相關(guān)，是組成葉綠素的重要分子，確保光合磷酸化的正常進(jìn)行[30]。本試驗(yàn)中，NaCl脅迫下紫花苜蓿根中的K+，Ca2+，Mg2+含量顯著下降，Na+含量顯著升高，表明濃度較高的Na+對(duì)K+，Ca2+，Mg2+3者的吸收有抑制作用，打破了植物體內(nèi)的正常離子含量和離子分布；較低濃度的外源激素EBR (0.6 μmol·L-1)可以降低植株體內(nèi)的Na+含量，提高植株體內(nèi)其他離子含量，維持離子平衡。以上結(jié)果可能是由于外源激素EBR提高了NaCl脅迫下植物的根系活力和光合能力[31]，同時(shí)外源激素EBR可以調(diào)控植物根系中內(nèi)源植物激素的合成[32]，從而有效調(diào)控?zé)o機(jī)離子的吸收、運(yùn)輸和分配，減少鹽脅迫危害。

4 結(jié)論

極低濃度的外源激素EBR可以有效地減輕鹽脅迫的危害，使植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性升高，葉綠素含量和可溶性蛋白含量增加，丙二醛含量以及電解質(zhì)滲透率下降；并且外源激素EBR可有效抑制Na+對(duì)K+，Ca2+,Mg2+的毒害，控制離子平衡；0.6 μmol·L-1EBR為紫花苜蓿受鹽脅迫較為適應(yīng)的激素濃度。不同物種在逆境條件下對(duì)外源激素EBR的適應(yīng)程度有差異，EBR可以快速有效地影響苜蓿等一些牧草生長(zhǎng)，對(duì)提高鹽堿地牧草對(duì)逆境的耐受力，提高產(chǎn)量，改善生長(zhǎng)狀況具有重要意義。